Restauração do microRNA-499-5p protege camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse por meio de Sox6 de direcionamento

Resumo

Histórico

MicroRNAs (miRs) são conhecidos por participarem da sepse; portanto, nosso objetivo é discutir o efeito protetor do miR-499-5p que tem como alvo a região determinante de sexo Y relacionada à alta mobilidade-group box 6 (Sox6) na lesão pulmonar induzida por sepse em camundongos.

Métodos

O modelo de lesão pulmonar induzida por sepse foi estabelecido por ligadura e punção cecal. A razão peso úmido / seco (P / D), expressão de miR-499-5p, Sox6, Caspase-3 e Caspase-9 em tecidos pulmonares de camundongos foram testados. O escore de lesão pulmonar, as fibras de colágeno e o grau de fibrose pulmonar nos tecidos pulmonares foram determinados. Além disso, a apoptose celular em tecidos pulmonares foi medida. O conteúdo dos fatores inflamatórios e os índices de estresse oxidativo no fluido do lavado broncoalveolar (BALF) e nos tecidos pulmonares foram detectados por meio de ensaios de perda e ganho de função. A relação de direcionamento entre miR-499-5p e Sox6 foi verificada.

Resultados

A razão W / D e Sox6 foram aumentadas enquanto miR-499-5p foi diminuído em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. MiR-499-5p restaurado ou Sox6 depletado patologia dos tecidos pulmonares aliviados, pontuação de lesão pulmonar reduzida, fibras de colágeno, grau de fibrose pulmonar, células TUNEL positivas, expressão da proteína Caspase-3 e Caspase-9 e conteúdo de fatores inflamatórios em BALF e tecidos pulmonares bem como resposta ao estresse oxidativo em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. miR-499-5p Sox6 direcionado.

Conclusão

A alta expressão de miR-499-5p pode atenuar a apoptose celular em tecidos pulmonares e inibir a inflamação de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse através da depleção de Sox6, e é um potencial marcador candidato e alvo terapêutico para lesão pulmonar induzida por sepse.

Introdução

Sepse é uma inflamação sistêmica que surge como resultado de uma infecção e causa disfunções de múltiplos órgãos, contendo a síndrome do desconforto respiratório agudo [1]. É caracterizada por hipotensão profunda, hipoxemia progressiva, dano tecidual e alterações inflamatórias [2]. O pulmão é o órgão mais crítico e vulnerável na sepse, e a lesão pulmonar aguda (LPA) é uma doença inflamatória induzida por sepse frequente [3]. A gravidade da LPA induzida por sepse pode ser atribuída ao comprometimento da permeabilidade da rede alveocapilar, resultando na redução do suprimento de oxigênio [4]. A apoptose de células pulmonares é um fator crítico na lesão pulmonar induzida por sepse [5]. A fisiopatologia da LPA induzida por sepse é desconhecida, medidas de suporte e antibióticos são os únicos tratamentos disponíveis em pacientes com sepse e LPA e seu impacto nas altas taxas de mortalidade por sepse é limitado [6].

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos segmentos não codificantes de RNAs expressos endogenamente, consistindo em aproximadamente 18-24 nucleotídeos, que podem controlar uma ampla gama de funções celulares e se ligar a regiões alvo de um determinado gene para controlar sua expressão através da inibição ou ativação de mRNA tradução / transcrição [7]. MiR-499-5p é um membro recentemente descoberto de miRNAs codificados por miosina [8]. Um estudo relatou que os níveis séricos de miR-499-5p poderiam ser utilizados para indicar falência de órgãos em pacientes com sepse [9]. Outro estudo revelou que a expressão de miR-499-5p participa da apoptose cardíaca induzida por sepse [10]. A família de caixa de alta mobilidade (HMG) (SOX) relacionada à região determinante de sexo Y (SRY) é definida por um conjunto de genes incluindo um domínio de ligação ao DNA da classe HMG, cuja identidade de sequência com SRY é maior que 50% [11] . O fator de transcrição Sox6 é uma parte da família HMG-box relacionada ao SRY e expresso em vários tecidos durante a progressão, onde desempenha um papel crítico na transição de células progenitoras em proliferação para células funcionalmente maduras [12]. Há um estudo relatando que o aumento de Sox6 está implicado na apoptose cardíaca induzida por sepse [10]. Estudos demonstraram que a expressão de Sox2 e a expressão de Sox4 são aumentadas no câncer de pulmão de pequenas células humanas [13, 14]. Mas a relação entre Sox6 e lesão pulmonar induzida por sepse precisa de mais estudos. Assim, nosso estudo foi explorar o efeito protetor de miR-499-5p em camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse, visando Sox6.

Materiais e métodos

Conformidade com as normas éticas

Todos os experimentos com animais estavam de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi autorizado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Hospital Municipal de Weihai, Cheeloo College of Medicine, Shandong University.

Animais de experiência

Camundongos saudáveis ​​BABL / c de grau livre de patógenos específicos do sexo masculino (com idades entre 6–8 semanas, pesando 18–22 g) foram adquiridos no centro experimental de animais da Universidade de Shandong (Shandong, China). O ambiente foi fixado em 24 ± 2 ° C com 12 ciclos claro-escuro alternadamente. Os camundongos foram tratados com livre acesso a alimentos assépticos e água esterilizada. Os experimentos foram iniciados após alimentação adaptativa por 7 dias.

Estabelecimento de modelo de lesão pulmonar induzida por sepse por ligadura e punção cecal (CLP) em camundongos

Os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos:o grupo simulado ( n =8) e o grupo do modelo. Os camundongos foram mantidos em jejum por 12 h antes da operação e, em seguida, anestesiados com pentobarbital sódico a 1% (70 mg / kg) por injeção intraperitoneal. O efeito da anestesia foi observado; a respiração e os batimentos cardíacos dos ratos foram notados. A cabeça e os membros dos camundongos foram fixados em decúbito dorsal, e a pele abdominal foi preparada e desinfetada por bolas de algodão iodóforo. Os camundongos do grupo modelo foram tratados com uma incisão longitudinal (1,0 cm) no segmento médio da linha mediana abdominal, a cavidade abdominal foi aberta e o ceco foi retirado da cavidade abdominal evitando lesar os vasos mesentéricos. Foi ligado com um fio de seda 1-0 em 1/2 da extremidade do ceco, e o ceco foi puncionado na margem contralateral do mesentério com uma agulha de punção nº 16. Uma quantidade adequada de conteúdo intestinal foi extrusada, o ceco foi recolocado e a incisão suturada. Após a abertura da cavidade abdominal, os camundongos do grupo sham foram retirados apenas do ceco e, em seguida, o ceco foi colocado de volta. Os camundongos foram injetados por via subcutânea com 1 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9% no pós-operatório, separados em gaiolas e alimentados rotineiramente.

Transfecção In Vivo

Antes da modelagem, os ratos foram divididos em 7 grupos ( n =8):o grupo modelo, o grupo agomir miR-499-5p, o grupo controle negativo agomir (NC), o grupo RNA de interferência pequeno (si) -Sox6, o grupo si-NC, o agomir miR-499-5p + Grupo superexpressão (oe) -Sox6 e o ​​grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Uma hora antes da modelagem, os camundongos foram tratados de acordo com o agrupamento. Os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico a 1% por injeção intraperitoneal, depois fixados em uma posição supina com inclinação de 45 ° e a língua dos camundongos foi movida para o outro lado da boca para garantir a permeabilidade do trato respiratório. A pele anterior do pescoço dos camundongos foi desinfetada e cortada para expor a traqueia. O complexo de transfecção (50 μL) foi absorvido por um microsampler (gotejado de acordo com o grupo, a mesma quantidade de solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi gotejada no grupo modelo) e então gotejou lentamente na traqueia. Após a transfecção, os ratos foram rodados verticalmente e o complexo de transfecção foi totalmente distribuído nos pulmões [15]. Durante o processo de transfecção, foram observados os batimentos respiratórios e cardíacos dos camundongos. Se ocorresse parada respiratória e cardíaca, a transfecção era interrompida imediatamente e o trato respiratório estava desobstruído. A transfecção continuou quando a respiração e os batimentos cardíacos dos ratos estavam estáveis. MiR-499-5p agomir e seu NC, bem como os plasmídeos correspondentes de Sox6, foram adquiridos de Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). Após a transfecção, os camundongos foram separados em gaiolas e alimentados por 1 d, e então sacrificados. Os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico a 1% por injeção intraperitoneal, fixados em posição supina e, em seguida, sacrificados por venossecção da aorta abdominal. A pele dos camundongos foi desinfetada localmente, a cavidade torácica foi aberta, a traqueia e o brônquio fonte direito foram ligados, o brônquio principal direito foi desconectado e o pulmão direito removido. O lobo inferior do pulmão direito foi colocado em formalina neutra a 10% para exame patológico, o lobo médio foi pesado rapidamente para calcular o peso úmido (W) e cozido a 56 ℃, e o peso seco (D) foi calculado após 72 h, assim, a razão W / D foi calculada. O lobo superior direito foi armazenado em nitrogênio líquido para mRNA e detecção de proteínas. O pulmão esquerdo foi lavado três vezes com 0,4 mL de solução salina normal e cerca de 1 mL de fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) foi coletado, transferido para um tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL e colocado em gelo. O BALF foi centrifugado a 1.500 rpm por 5 min e transferido para um novo tubo de EP e, em seguida, armazenado a -80 ℃ para detecção de fatores inflamatórios.

Além disso, os ratos foram divididos em 3 grupos ( n =10 / grupo):grupo sham, grupo modelo e grupo miR-499-5p agomir (50 μL de miR-499-5p agomir foram instilados na traqueia 1 h antes da cirurgia). A taxa de sobrevivência foi monitorada a cada 12 horas, totalmente por 7 dias. O status de sobrevivência dos camundongos em 7 d foi observado, e a toxicidade de miR-499-5p foi determinada [16].

Pontuação de Coloração e Lesão por Hematoxilina-Eosina (H&E)

Os tecidos pulmonares foram preparados em secções de parafina, corados com H&E e observados ao microscópio óptico. A lesão pulmonar foi pontuada (congestão alveolar, hemorragia, infiltração ou agregação de neutrófilos na cavidade alveolar ou parede do vaso, espessamento da parede alveolar e / ou formação de membrana hialina) pelo sistema de pontuação patológica para lesão pulmonar emitido pela American Thoracic Society. 0 ponto indica nenhuma lesão ou lesões muito leves; 1 ponto indicou lesões leves; 2 pontos indicaram lesões moderadas; 3 pontos indicaram lesões graves; 4 pontos indicaram lesões muito graves. A pontuação total dos quatro itens representou a pontuação total da lesão pulmonar [17].

Coloração de Masson e Pontuação

Os tecidos pulmonares foram feitos em seções de parafina (4 µm) e tratados com coloração de Masson [18]. As fibras de colágeno, o muco e a cartilagem eram azuis, o citoplasma, o músculo, a celulose e a glia eram vermelhos e os núcleos das células eram preto-azulados. No sistema de pontuação Ashcroft semiquantitativo [19], 0 ponto indicava pulmão normal; 1 ponto indicou espessamento fibroso leve da parede alveolar ou brônquica; 3 pontos indicaram espessamento moderado da parede alveolar ou bronquiolar sem danos à estrutura pulmonar; 5 pontos indicaram piora da fibrose acompanhada de dano à estrutura pulmonar, formando bandas ou massas de fibras; 7 pontos indicaram dano severo à estrutura pulmonar e grandes áreas de fibrose, formando bandas ou aglomerados de fibras; 8 pontos indicaram todo o tamponamento fibroso regional.

Coloração terminal de desoxinucleotidil transerase mediada por desoxinucleotidina trifosfato-biotina Nick para marcação final (TUNEL)

A apoptose dos tecidos pulmonares foi testada pelo kit TUNEL (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) e observada ao microscópio óptico. As células apoptóticas foram coradas de marrom no núcleo. O índice de apoptose indicou a porcentagem de células TUNEL-positivas [20].

Imunohistoquímica

As secções de tecido pulmonar foram desparafinizadas com xileno, incubadas com peróxido de hidrogênio 3% e bloqueadas com soro de cabra. Então, Caspase-3 (ab13847, 1:500), Caspase-9 (ab32539, 1:250) e SOX6 (ab30455, 1:500, todos de Abcam, MA, EUA) foram usados ​​como anticorpos para seções de imunocoloração. Um microscópio óptico (Leica Microsystems, IL, EUA) foi utilizado para capturar as imagens que foram analisadas com o software Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MA, EUA) [21].

Reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR)

O kit OMEGA (Solarbio science &technology Co., Ltd., Pequim, China) foi adotado para extração de RNA total nos tecidos pulmonares e determinação da concentração de RNA. O DNA complementar (cDNA) foi composto por transcrição reversa em linha com o kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA). Os primers foram desenhados pela Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA), conforme mostrado na Tabela 1. A reação de PCR foi realizada de acordo com o kit FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche). O experimento foi analisado quantitativamente por 2 ^{- △△ Ct} método. U6 foi o controle de carregamento de miR-499-5p, e GAPDH foi o parâmetro interno de outros genes [22].

Análise de Western Blot

A proteína total foi coletada usando tampão de lise de ensaio de rádio-imunoprecipitação para tratar tecidos pulmonares. A concentração de proteína total foi avaliada pelo método do ácido bicinconínico. A amostra de proteína (30 μg) foi processada por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio a 10%, transferida para a membrana de fluoreto de polivinilideno, bloqueada com leite em pó desnatado a 5% e reagida com anticorpos primários Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase -3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, EUA), Caspase-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), fator de necrose tumoral-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam ), interleucina-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, EUA), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) e GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, EUA). Em seguida, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário (1:2000) e desenvolvida por quimiluminescência aprimorada [23].

Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)

Os níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α no BALF foram determinados pelo kit ELISA (Boster, Hubei, China). A determinação colorimétrica foi realizada a 450 nm.

Detecção de índices de estresse oxidativo

Os tecidos pulmonares em nitrogênio líquido foram pesados ​​e diluídos em uma certa proporção de solução salina sob uma condição de baixa temperatura, depois homogeneizados e centrifugados a 4 ℃, 3000 r / min por 20 min em baixa temperatura, e o sobrenadante foi levado para determinação. A atividade da mieloperoxidase (MPO) foi testada pelo kit de detecção de MPO (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), e malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px) e catalase (CAT) foram testados por kits fornecidos pelo JianCheng Bioengineering Institute.

Ensaio do gene Dual Luciferase Reporter

Sox6 pode ser o gene alvo de miR-499-5p que foi predicado por um site biológico (http://www.targetscan.org/vert_72/). Havia quatro sítios de ligação entre miR-499-5p e região não traduzida 3 'do mRNA Sox6 (UTR). Os vetores do tipo selvagem pmiR-RB-REPORT-Sox6 (WT) e do tipo mutante pmiR-RB-REPORT-Sox6 (MUT) foram construídos por Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Guangdong, China), e os plasmídeos repórter de luciferase correspondentes foram gerado. Células TC-1 (células epiteliais pulmonares de camundongos, 1 × 10 ⁵ células / poço, Shanghai Yiyan biological technology Co., Ltd., Shanghai, China) foram semeadas em uma placa de 24 poços e transfectadas com miR-499-5p agomir ou agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT ou pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT via Lipofectamine2000. O sistema de ensaio do gene repórter da luciferase dupla (Promega, WI, EUA) foi aplicado para medir a atividade da luciferase.

Análise estatística

Todos os dados foram analisados ​​pelo software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EUA). Os dados de medição foram transmitidos por média ± desvio padrão. As comparações entre dois grupos foram conduzidas por t teste, as comparações entre vários grupos foram avaliadas por análise de variância unilateral (ANOVA), e o teste post hoc de Tukey foi usado para comparação de pares após a análise ANOVA. A curva de sobrevivência foi feita pelo método de Kaplan-Meier. P valor <0,05 foi indicativo de diferença estatisticamente significativa.

Resultados

Razão W / D e Sox6 aumentam enquanto miR-499-5p diminui em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse

A toxicidade de miR-499-5p foi testada em camundongos para detectar o tempo de sobrevivência de camundongos sépticos. Os resultados mostraram (Fig. 1a) que a taxa de sobrevivência em 7 dias de camundongos no grupo sham foi de 100%, e a de camundongos sépticos foi reduzida. A taxa de sobrevivência de camundongos sépticos após o tratamento com miR-499-5p foi melhorada. Os resultados da razão W / D dos tecidos pulmonares demonstraram que (Fig. 1b):versus o grupo sham, a razão W / D foi aumentada no grupo modelo ( P <0,05). Em comparação com o grupo agomir NC e o grupo si-NC, a razão W / D foi reduzida no grupo agomir miR-499-5p e no grupo si-Sox6 (ambos P <0,05). A razão W / D foi acentuadamente aumentada no grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 em relação ao grupo miR-499-5p agomir + oe-NC ( P <0,05).

A razão W / D e Sox6 são aumentadas enquanto miR-499-5p é diminuído em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. a Curva de sobrevivência de camundongos feita por Kaplan-Meier. b Razão W / D do tecido pulmonar em cada grupo. c Expressão de miR-499-5p em tecidos pulmonares de camundongos. d Expressão de mRNA de Sox6 em tecidos pulmonares de camundongos. e Banda de proteína de Sox6 por análise de Western blot. f Expressão protéica de Sox6 em tecidos pulmonares de camundongos. g Imuno-histoquímica Sox6 de tecidos pulmonares de camundongos. (a) P <0,05 versus o grupo sham. (b) P <0,05 versus o grupo agomir NC. (c) P <0,05 versus o grupo si-NC. (d) P <0,05 versus o grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Os dados de medição foram representados como média ± desvio padrão e os dados foram avaliados por ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey

A expressão de MiR-499-5p e Sox6 foi detectada e descobrimos que (Fig. 1c-f):em contraste com o grupo sham, miR-499-5p reduzido e Sox6 aumentado no grupo modelo (ambos P <0,05). Em relação ao grupo agomir NC, miR-499-5p aumentou e Sox6 diminuiu no grupo miR-499-5p agomir (ambos P <0,05). Contra o grupo si-NC, Sox6 deprimido no grupo si-Sox6 ( P <0,05). Em comparação com o grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, Sox6 dramaticamente elevado no grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 ( P <0,05).

O conteúdo de proteína de Sox6 em tecidos pulmonares de camundongos sépticos foi determinado por imuno-histoquímica (Fig. 1g). Foi observado que em comparação com o grupo sham, a expressão da proteína Sox6 foi aumentada no grupo Modelo ( P <0,05); em comparação com o grupo agomir NC e o grupo si-NC, a expressão da proteína Sox6 mais baixa foi examinada no grupo agomir miR-499-5p e no grupo si-Sox6 (ambos P <0,05); em relação ao grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, a expressão da proteína Sox6 foi aumentada no grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 ( P <0,05).

MiR-499-5p restaurado ou Sox6 empobrecido alivia a patologia dos tecidos pulmonares, reduz o escore de lesão pulmonar, fibras de colágeno e o grau de fibrose pulmonar na lesão pulmonar induzida por sepse Ratos

Os resultados da coloração HE mostraram que (fig. 2a):no grupo sham, a estrutura do tecido pulmonar estava intacta, o septo alveolar manifestava-se basicamente sem edema ou inflamação e a cavidade alveolar estava límpida. No modelo, os grupos agomir NC, si-NC e miR-499-5p agomir + oe-Sox6, exsudação, edema e hemorragia podem ser vistos na maior parte da cavidade alveolar dos tecidos pulmonares, e infiltração maciça de células inflamatórias no intersticial pulmonar. Nos grupos miR-499-5p agomir, si-Sox6 e miR-499-5p agomir + oe-NC, a lesão dos tecidos pulmonares foi reduzida em relação ao grupo modelo.

MiR-499-5p restaurado ou Sox6 empobrecido alivia a patologia dos tecidos pulmonares, reduz a pontuação de lesão pulmonar, fibras de colágeno e o grau de fibrose pulmonar em camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. a Resultados da coloração HE em tecidos pulmonares de camundongos. b A pontuação de lesão do tecido pulmonar de camundongos em cada grupo. c Coloração de Masson do tecido pulmonar em camundongos. d As pontuações de fibrose pulmonar de camundongos em cada grupo. (a) P <0,05 versus o grupo sham. (b) P <0,05 versus o grupo agomir NC. (c) P <0,05 versus o grupo si-NC. (d) P <0,05 versus o grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Os dados de medição foram representados como média ± desvio padrão e os dados foram avaliados por ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey

A pontuação de lesão pulmonar de camundongos e os resultados de pontuação de Ashcroft semiquantitativos mostraram que (Fig. 2b, d):em relação ao grupo sham, a pontuação de lesão pulmonar e o grau de fibrose pulmonar estavam obviamente aumentados no grupo modelo ( P <0,05). Em comparação com o grupo agomir NC e o grupo si-NC, a pontuação de lesão pulmonar e o grau de fibrose pulmonar foram reduzidos nos grupos agomir miR-499-5p e si-Sox6 (ambos P <0,05). Em contraste com o grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, a pontuação de lesão pulmonar e o grau de fibrose pulmonar foram marcadamente elevados no grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 ( P <0,05).

Os resultados da coloração de Masson revelaram que (Fig. 2c):no grupo sham, os tecidos pulmonares de camundongos continham uma pequena quantidade de fibras de colágeno azuis. No modelo, grupos agomir NC, si-NC e miR-499-5p agomir + oe-Sox6, as fibras de colágeno estavam aumentadas. No grupo miR-499-5p agomir, grupo si-Sox6 e grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, as fibras de colágeno foram diminuídas em relação ao grupo modelo.

MiR-499-5p restaurado ou Sox6 depletado reduz células positivas de TUNEL, expressão de proteínas de caspase-3 e caspase-9 em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse

Os resultados de Western blot, coloração TUNEL e imuno-histoquímica indicaram que (Fig. 3a – f):o núcleo normal era azul e o núcleo apoptótico era marrom em tons diferentes. Em comparação com o grupo sham, as células TUNEL positivas, a expressão da proteína Caspase-3 e Caspase-9 foram aumentadas no grupo modelo (todas P <0,05). Contra os grupos agomir NC e si-NC, as células TUNEL positivas, a expressão da proteína Caspase-3 e Caspase-9 foram reduzidas nos grupos agomir miR-499-5p e si-Sox6 (todos P <0,05). Em comparação com o grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, as células TUNEL positivas, a expressão da proteína Caspase-3 e Caspase-9 foram aumentadas no grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (todos P <0,05).

O miR-499-5p restaurado ou Sox6 esgotado reduz as células TUNEL positivas, a expressão da proteína Caspase-3 e Caspase-9 em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. a Células TUNEL positivas em tecidos pulmonares de camundongos. b Número de células TUNEL positivas em tecidos pulmonares de camundongos. c Imunohistoquímica de Caspase-3 e Caspase-9 em tecido pulmonar de camundongos; d Valor médio de DO de Caspase-3 e Caspase-9 no tecido pulmonar de camundongos. e Bandas de proteínas de Caspase-3 e Caspase-9 em tecidos pulmonares de camundongos. f Expressão da proteína caspase-3 e caspase-9 em tecidos pulmonares de camundongos em cada grupo. (a) P <0,05 versus o grupo sham. (b) P <0,05 versus o grupo agomir NC. (c) P <0,05 versus o grupo si-NC. (d) P <0,05 versus o grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Os dados de medição foram representados como média ± desvio padrão e os dados foram avaliados por ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey

MiR-499-5p restaurado ou Sox6 depletado diminui o conteúdo de TNF-α, IL-1β e IL-6 no BALF e nos tecidos pulmonares de lesão pulmonar induzida por sepse Ratos

Foi exibido por ELISA e resultados de ensaio de Western blot que (Fig. 4a-g):Os conteúdos de TNF-α, IL-1β e IL-6 foram aumentados no grupo modelo em relação ao grupo sham (todos P <0,05). Contra os grupos agomir NC e si-NC, os teores de TNF-α, IL-1β e IL-6 foram diminuídos nos grupos agomir miR-499-5p e si-Sox6 (todos P <0,05). Contra o grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, os conteúdos de TNF-α, IL-1β e IL-6 foram aumentados no grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (todos P <0,05).

O miR-499-5p restaurado ou o Sox6 esgotado reduzem os conteúdos de TNF-α, IL-1β e IL-6 em BALF e tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. a Conteúdo de TNF-α no BALF de camundongos em cada grupo. b Conteúdo de IL-1β no BALF de camundongos em cada grupo. c Conteúdo de IL-6 no BALF de camundongos em cada grupo. d bandas de proteínas de TNF-α, IL-1β e IL-6 em tecidos pulmonares de camundongos em cada grupo. e expressão de proteínas de TNF-α em tecidos pulmonares de camundongos em cada grupo. f expressão da proteína de IL-1β em tecidos pulmonares de camundongos em cada grupo. G expressão da proteína de IL-6 em tecidos pulmonares de camundongos em cada grupo. (a) P <0,05 versus o grupo sham. (b) P <0,05 versus o grupo agomir NC. (c) P <0,05 versus o grupo si-NC. (d) P <0,05 versus o grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Os dados de medição foram representados como média ± desvio padrão e os dados foram avaliados por ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey

MiR-499-5p restaurado ou Sox6 esgotado aumenta as atividades de SOD, CAT e GSH-Px, bem como reduz os conteúdos de MDA e MPO em tecidos pulmonares por sepse induzida Ratos com lesão pulmonar

Os resultados da detecção dos índices de estresse oxidativo apresentaram que (Fig. 5a-e):versus o grupo sham, as atividades de SOD, CAT e GSH-Px foram prejudicadas enquanto os conteúdos de MDA e MPO aumentaram no grupo modelo (todos P <0,05). Contra o agomir NC e os grupos si-NC, as atividades SOD, CAT e GSH-Px aumentaram enquanto os conteúdos de MDA e MPO reduziram nos grupos agomir miR-499-5p e si-Sox6 (todos P <0,05). Em comparação com o grupo miR-499-5p agomir + oe-NC, as atividades de SOD, CAT e GSH-Px foram suprimidas enquanto os conteúdos de MDA e MPO aumentaram no grupo miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (todos P <0,05).

MiR-499-5p restaurado ou Sox6 esgotado aumenta as atividades de SOD, CAT e GSH-Px, bem como reduz os conteúdos de MDA e MPO em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. a Atividade de SOD em tecidos pulmonares de camundongos. b Conteúdo de MDA no tecido pulmonar de camundongos. c Atividade de GSH-Px em tecidos pulmonares de camundongos. d Atividade de CAT nos tecidos pulmonares de cada grupo de camundongos. e Conteúdo de MPO em tecidos pulmonares de camundongos. (a) P <0,05 versus o grupo sham. (b) P <0,05 versus o grupo agomir NC. (c) P <0,05 versus o grupo si-NC. (d) P <0,05 versus o grupo miR-499-5p agomir + oe-NC. Os dados de medição foram representados como média ± desvio padrão e os dados foram avaliados por ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey

miR-499-5p Diretamente Alvo para Sox6

Previmos por meio do site de bioinformática TargetScan que havia locais de ligação direcionados entre miR-499-5p e SOX4 / 6. Usando RT-qPCR, verificou-se que em comparação com o grupo sham, a expressão de SOX2 / 4/6 aumentou no grupo modelo, e a expressão de SOX6 aumentou principalmente (todos P <0,05); versus o grupo agomir NC, o grupo miR-499-5p agomir não demonstrou nenhuma alteração na expressão de SOX2 enquanto mostrou expressão de SOX4 reduzida, principalmente SOX6 diminuída (arquivo adicional 1:Fig. S1a, b). Portanto, finalmente selecionamos SOX6 como o gene alvo de miR-499-5p. O site de previsão biológica (http://www.targetscan.org/vert_72/) revelou que miR-499-5p pode ter como alvo Sox6 (Fig. 6a). O ensaio do gene repórter de luciferase dupla demonstrou que (Fig. 6b) versus o grupo de controle, a atividade da luciferase foi obviamente destruída após o vetor pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT e miR-499-5p agomir co-transfectado em células TC-1 ( P ( P > 0,05), sugerindo que miR-499-5p poderia se ligar diretamente a Sox6 3′UTR WT e, em seguida, inibir a atividade da luciferase.

miR-499-5p visa diretamente ao Sox6. a A relação de destino entre miR-499-5p e Sox6 predicado pelo site biológico. b Os resultados da verificação do ensaio do gene repórter de luciferase dupla. * P <0,05 versus o grupo NC mímico. Os dados de medição foram representados como média ± desvio padrão, e as comparações entre dois grupos foram conduzidas por t teste

Discussão

A sepse é uma causa crítica de choque e síndrome de disfunção de múltiplos órgãos, entre as quais a LPA é a complicação orgânica mais frequente e significativa [24]. A LPA induzida por sepse aparece não apenas a mais precoce, a maior incidência, mas também progride rapidamente, a taxa de fatalidade é alta e não há terapia eficaz no momento [25]. Um estudo anterior sugeriu que a regulação positiva de miR-218 atenuou a secreção de fatores inflamatórios e preveniu a lesão pulmonar induzida por sepse [26]. Além disso, a promoção dos níveis de miR-146a pode reduzir a inflamação em ALI [27] e a restauração de miR-125b melhora a sobrevivência de camundongos com ALI e suprime a inflamação [28]. Embora estudos tenham destacado o papel dos miRNAs na lesão pulmonar, o mecanismo detalhado de miR-499-5p na lesão pulmonar induzida por sepse foi pouco investigado, portanto, focamos no miR-499-5p para descobrir seu potencial terapêutico na lesão pulmonar induzida por sepse TODOS. Além disso, um estudo forneceu uma prova de que o aumento de Sox6 estava envolvido na apoptose cardíaca induzida por sepse [10]. Efforts should be made to deeply understand sepsis-induced lung injury. We aim to discuss the protective effect of miR-499-5p targeting Sox6 on sepsis-induced lung injury mice.

The W/D ratio of lung tissues was calculated in our study, and the expression of Sox6 and miR-499-5p in mouse lung tissues was assessed. The results showed that W/D ratio and Sox6 were increased while miR-499-5p was decreased in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. A recent study has proposed that miR-499-5p expression in patients with mild sepsis, severe sepsis and septic shock was dramatically decreased relative that in normal controls [9]. Another study has presented that miR-499-5p expression was markedly declined in non-small cell lung cancer (NSCLC) tissues and linked to poor clinical outcomes [29]. It is reported that the Sox6 expression was raised in lung cancer tissues in comparison with normal tissues [30]. Similarly, a previous study has revealed that the expression of Sox6 was remarkably elevated in the kidney tissues of mice with diabetic kidney disease [31]. Our study also presented that miR-499-5p directly targeted to Sox6. An important finding was that Sox6 is a target gene of miR-499 [10]. Another study provided data of that Sox6 was a target gene of miR-499-5p, and restoration of miR-499-5p suppressed the expression of Sox6 [32]. However, the target relation of miR-499-5p and Sox6 in lung tissues of sepsis-induced mice has not been uncovered yet.

In addition, it was revealed that restored miR-499-5p or depleted Sox6 alleviated lung tissues pathology, reduced lung injury score, collagen fibers and the degree of pulmonary fibrosis, and reduced TUNEL positive cells, Caspase-3 and Caspase-9 protein expression in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. It has been previously suggested that up-regulating miR-499-5p suppresses cell proliferation and promotes apoptosis in vivo and in vitro of NSCLC [29]. Another study has verified that restoring miR-499-5p and depleting Sox6 attenuated hypoxia/re-oxygenation-induced cell apoptosis and reduced Caspase-3 expression [32]. It was presented that down-regulating Sox6 alleviates the pathological injury and represses neuronal apoptosis in hippocampal tissues of Alzheimer’s disease [33]. Moreover, a study revealed that depletion of Sox6 inhibited high glucose-induced cell apoptosis and renal interstitial fibrosis in mouse renal mesangial cells [31]. Another study demonstrated that low expression of Sox6 declined the activity of Caspase-3 and the percentage of apoptotic cells in mouse P19CL6 cells [34]. In addition, we verified that restored miR-499-5p or depleted Sox6 declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in BALF and lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. Xia et al. illuminated that TNF-α and IL-6 levels were dramatically raised in sepsis-induced lung injury mice [35]. A study has demonstrated that low expression of Sox6 declines the inflammatory reaction in hippocampal tissues of Alzheimer’s disease [33]. Another result in this study implied that restored miR-499-5p or depleted Sox6 raised SOD, CAT and GSH-Px activities as well as reduced MDA and MPO contents in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. It was presented that CLP-induced ALI was featured by inflammation in morphology, enhanced W/D ratio, raised protein concentration in BALF, higher level of MPO and MDA contents as well as lower level of SOD, GSH-Px and CAT activities in lungs after CLP [36]. It was suggested that the activity of SOD and CAT were decreased in sepsis-induced ALI in mice [37]. Furthermore, a study reported that the overexpressed miR-499-5p and low expressed Sox6 decreased the level of MDA [32].

Conclusion

In conclusion, we found that high expression of miR-499-5p can attenuate the apoptosis of lung tissues cells and inhibit inflammation of sepsis-induced lung injury mice via depleting Sox6, which may have important therapeutic implications in the treatment of sepsis-induced lung injury. Nevertheless, clinical researches are needed to detect the efficacy for the treatment of sepsis-induced lung injury.

Availability of data and material

Não aplicável.

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