MicroRNA-499-5p Restaura Função Pulmonar em Lesão Induzida por Sepse Alvejando Sox6

Resumo

Contexto

MicroRNAs (miRs) são conhecidos por participar na sepse; portanto, nosso objetivo é discutir o efeito protetor do miR-499-5p alvejando a caixa de mobilidade alta relacionada à região determinante do sexo Y 6 (Sox6) na lesão pulmonar induzida por sepse em camundongos.

Métodos

O modelo de lesão pulmonar induzida por sepse foi estabelecido por ligadura e punção cecal. A razão peso úmido/seco (W/D), miR-499-5p, Sox6, Caspase-3 e expressão de Caspase-9 em tecidos pulmonares de camundongos foram testados. Escore de lesão pulmonar, fibras de colágeno e grau de fibrose pulmonar em tecidos pulmonares foram determinados. Além disso, a apoptose celular em tecidos pulmonares foi medida. O conteúdo de fatores inflamatórios e índices de estresse oxidativo no fluido de lavado broncoalveolar (BALF) e tecidos pulmonares foram detectados via ensaios de perda e ganho de função. A relação de alvo entre miR-499-5p e Sox6 foi verificada.

Resultados

A razão W/D e Sox6 foram aumentados enquanto miR-499-5p foi diminuído em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. miR-499-5p restaurado ou Sox6 depletado aliviou a patologia de tecidos pulmonares, reduziu escore de lesão pulmonar, fibras de colágeno, grau de fibrose pulmonar, células TUNEL positivas, expressão de proteína Caspase-3 e Caspase-9 e conteúdo de fatores inflamatórios no BALF e tecidos pulmonares, bem como resposta de estresse oxidativo em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. miR-499-5p alvejou Sox6.

Conclusão

Alta expressão de miR-499-5p pode atenuar apoptose celular em tecidos pulmonares e inibir inflamação de lesão pulmonar induzida por sepse em camundongos via depleção de Sox6, sendo um potencial marcador candidato e alvo terapêutico para lesão pulmonar induzida por sepse.

Introdução

Sepse é uma inflamação sistêmica que surge como resultado de infecção e causa disfunções de múltiplos órgãos, contendo síndrome do desconforto respiratório agudo [1]. É caracterizada por hipotensão profunda, hipoxemia progressiva, dano tecidual e mudanças inflamatórias [2]. O pulmão é o órgão mais crítico e vulnerável na sepse, e lesão pulmonar aguda (LPA) é uma doença inflamatória frequente induzida por sepse [3]. A gravidade da LPA induzida por sepse pode ser atribuída à permeabilidade prejudicada da rede alveocapilar, resultando em suprimento reduzido de oxigênio [4]. Apoptose de células pulmonares é um fator crítico na lesão pulmonar induzida por sepse [5]. A fisiopatologia da LPA induzida por sepse é desconhecida, medidas de suporte e antibióticos são os únicos tratamentos disponíveis em pacientes com sepse e LPA, e seu impacto nas altas taxas de mortalidade por sepse é limitado [6].

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos segmentos não codificantes de RNAs expressos endogenamente, consistindo de aproximadamente 18-24 nucleotídeos, que podem controlar uma ampla gama de funções celulares e ligar-se a regiões alvo de um gene particular para controlar sua expressão através da inibição ou ativação da tradução/transcrição de mRNA [7]. MiR-499-5p é um membro recentemente descoberto de miRNAs codificados por miosina [8]. Um estudo relatou que os níveis séricos de miR-499-5p poderiam ser utilizados para indicar falência de órgãos em pacientes com sepse [9]. Outro estudo revelou que a expressão de miR-499-5p participa na apoptose cardíaca induzida por sepse [10]. A família caixa de mobilidade alta (HMG) relacionada à região determinante do sexo Y (SRY) (SOX) é definida por um conjunto de genes incluindo um domínio de ligação a DNA de classe HMG, cuja identidade de sequência com SRY é maior que 50% [11]. O fator de transcrição Sox6 é parte da família caixa HMG relacionada a SRY e expresso em múltiplos tecidos durante a progressão, onde serve papel crítico na transição de células progenitoras proliferantes para células funcionalmente maduras [12]. Há um estudo relatando que Sox6 elevado está implicado em apoptose cardíaca induzida por sepse [10]. Estudos mostraram que expressão de Sox2 e expressão de Sox4 estão aumentadas em câncer de pulmão de pequenas células humano [13, 14]. Mas a relação entre Sox6 e lesão pulmonar induzida por sepse precisa de mais estudo. Assim, nosso estudo foi explorar o efeito protetor de miR-499-5p na lesão pulmonar induzida por sepse em camundongos alvejando Sox6.

Materiais e Métodos

Conformidade com Padrões Éticos

Todos os experimentos com animais estavam em conformidade com o Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi permitido pelo Comitê de Ética de Experimentos com Animais do Hospital Municipal de Weihai, Faculdade de Medicina Cheeloo, Universidade de Shandong.

Animais de Experimento

Camundongos machos saudáveis, livres de patógenos específicos, grau BABL/c (idade 6-8 semanas, peso 18-22 g) foram comprados do centro de animais experimentais da Universidade de Shandong (Shandong, China). O ambiente foi definido a 24 ± 2 °C com ciclo luz-escuro de 12 h alternadamente. Camundongos foram tratados com acesso livre a alimento asséptico e água estéril. Experimentos foram iniciados após alimentação adaptativa por 7 dias.

Estabelecimento do Modelo de Lesão Pulmonar Induzida por Sepse por Ligadura e Punção Cecal (CLP) em Camundongos

Camundongos foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos: grupo sham (n = 8) e grupo modelo. Camundongos jejuaram por 12 h antes da operação e então anestesiados com 1% pentobarbital sódico (70 mg/kg) por injeção intraperitoneal. O efeito da anestesia foi observado; a respiração e batimento cardíaco dos camundongos foram notados. A cabeça e membros dos camundongos foram fixados em posição supina, e a pele abdominal foi preparada e desinfetada por bolas de algodão iodadas. Camundongos no grupo modelo foram tratados com incisão longitudinal (1,0 cm) no segmento médio da linha mediana abdominal, a cavidade abdominal foi aberta, e o ceco foi puxado para fora da cavidade abdominal evitando injuriar vasos mesentéricos. Foi ligado com fio de seda 1-0 a 1/2 da extremidade do ceco, e o ceco foi punção na margem contralateral do mesentério com agulha de punção No. 16. Uma quantidade adequada de conteúdo intestinal foi extrudada, o ceco foi recolocado, e a incisão foi suturada. Após abrir a cavidade abdominal, camundongos no grupo sham tiveram o ceco puxado apenas, e então o ceco foi recolocado. Camundongos foram injetados subcutaneamente com 1 mL de solução de cloreto de sódio 0,9% pós-operatório, separados em gaiolas e alimentados rotineiramente.

Transfeção In Vivo

Antes da modelagem, camundongos foram designados em 7 grupos (n = 8): grupo modelo, grupo agomir miR-499-5p, grupo controle negativo (NC) agomir, grupo pequeno RNA interferente (si)-Sox6, grupo si-NC, grupo agomir miR-499-5p + superexpressão (oe)-Sox6 e grupo agomir miR-499-5p + oe-NC. Uma hora antes da modelagem, camundongos foram tratados de acordo com o agrupamento. Camundongos foram anestesiados com 1% pentobarbital sódico por injeção intraperitoneal, então fixados em posição supina inclinada a 45°, e a língua dos camundongos foi movida para o outro lado da boca para garantir patência do trato respiratório. A pele anterior do pescoço dos camundongos foi desinfetada e cortada para expor a traqueia. Complexo de transfeção (50 μL) foi absorvido por um microamostrador (gotado de acordo com o grupo, a mesma quantidade de tampão fosfato salino (PBS) foi gotejada no grupo modelo) e então lentamente gotejado na traqueia. Após a transfeção, os camundongos foram rotacionados verticalmente e o complexo de transfeção foi totalmente distribuído nos pulmões [15]. Durante o processo de transfeção, a respiração e batimento cardíaco dos camundongos foram observados. Se ocorreu parada respiratória e cardíaca, a transfeção foi interrompida imediatamente, e o trato respiratório foi desobstruído. A transfeção foi continuada quando a respiração e batimento cardíaco dos camundongos estabilizaram. Agomir miR-499-5p e seu NC, bem como os plasmídeos correspondentes de Sox6, foram comprados da Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). Após transfeção, camundongos foram separados em gaiolas e alimentados por 1 dia, e então eutanasiados. Camundongos foram anestesiados com 1% pentobarbital sódico por injeção intraperitoneal, fixados em posição supina e então eutanasiados por veneseção da aorta abdominal. A pele dos camundongos foi desinfetada localmente, a cavidade torácica foi aberta, a traqueia e brônquio principal direito foram ligados, o brônquio principal direito foi desconectado, e o pulmão direito foi removido. O lobo inferior do pulmão direito foi colocado em formalina neutra 10% para exame patológico, o lobo médio foi rapidamente pesado para calcular o peso úmido (W) e assado a 56℃, e o peso seco (D) foi calculado após 72 h, assim a razão W/D foi calculada. O lobo superior direito foi armazenado em nitrogênio líquido para detecção de mRNA e proteína. O pulmão esquerdo foi lavado três vezes com 0,4 mL de soro fisiológico normal, e cerca de 1 mL de fluido de lavado broncoalveolar (BALF) foi coletado, movido para um tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL e colocado em gelo. BALF foi centrifugado a 1500 rpm por 5 min e transferido para novo tubo EP, então armazenado a -80℃ para detecção de fatores inflamatórios.

Além disso, os camundongos foram divididos em 3 grupos (n = 10/grupo): grupo sham, grupo modelo e grupo agomir miR-499-5p (50 μL agomir miR-499-5p instilado na traqueia 1 h antes da cirurgia). A taxa de sobrevivência foi monitorada a cada 12 h, totalizando 7 dias. O status de sobrevivência dos camundongos dentro de 7 dias foi observado, e a toxicidade de miR-499-5p foi determinada [16].

Coloração Hematoxilina-Eosina (H&E) e Escore de Lesão

Tecidos pulmonares foram preparados em secções de parafina, corados com H&E e observados sob microscópio óptico. A lesão pulmonar foi pontuada (congestão alveolar, hemorragia, infiltração ou agregação de neutrófilos na cavidade alveolar ou parede vascular, espessamento da parede alveolar e/ou formação de membrana hialina) pelo sistema de pontuação patológica para lesão pulmonar emitido pela Sociedade Torácica Americana. 0 ponto indicou lesões inexistentes ou muito leves; 1 ponto indicou lesões leves; 2 pontos indicaram lesões moderadas; 3 pontos indicaram lesões graves; 4 pontos indicaram lesões muito graves. A pontuação total dos quatro itens representou a pontuação total de lesão pulmonar [17].

Coloração de Masson e Escore

Tecidos pulmonares foram feitos em secções de parafina (4 µm) e tratados com coloração de Masson [18]. Fibras de colágeno, muco e cartilagem foram azuis, citoplasma, músculo, celulose e glia foram vermelhos, e núcleos celulares foram azul-negros. No sistema de pontuação semi-quantitativa de Ashcroft [19], 0 ponto indicou pulmão normal; 1 ponto indicou espessamento fibroso leve da parede alveolar ou brônquica; 3 pontos indicaram espessamento moderado da parede alveolar ou bronquiolar sem dano à estrutura pulmonar; 5 pontos indicaram fibrose piorando acompanhada de dano à estrutura pulmonar, formando bandas ou massas de fibra; 7 pontos indicaram dano grave à estrutura pulmonar e grandes áreas de fibrose, formando bandas ou aglomerados de fibra; 8 pontos indicaram empacotamento fibroso de todas as regiões.

Marcação TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated Deoxyuridine Triphosphate-Biotin Nick End-Labeling)

A apoptose de tecidos pulmonares foi testada por kit TUNEL (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e observada por microscópio óptico. As células apoptóticas foram coradas de marrom no núcleo. O índice de apoptose indicou a porcentagem de células TUNEL-positivas [20].

Imuno-histoquímica

As secções de tecido pulmonar foram desparafinizadas com xileno, incubadas com 3% peróxido de hidrogênio e bloqueadas com soro de cabra. Então, Caspase-3 (ab13847, 1:500), Caspase-9 (ab32539, 1:250) e SOX6 (ab30455, 1:500, todos da Abcam, MA, EUA) foram usados como anticorpos para imunomarcar secções. Microscópio óptico (Leica Microsystems, IL, EUA) foi utilizado para capturar imagens que foram então analisadas com software Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MA, EUA) [21].

Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa Quantitativa (RT-qPCR)

Kit OMEGA (Solarbio science & technology Co., Ltd., Beijing, China) foi adotado para extração de RNA total em tecidos pulmonares e determinação da concentração de RNA. O DNA complementar (cDNA) foi composto por transcrição reversa de acordo com Kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA). Os primers foram desenhados pela Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA), conforme mostrado na Tabela 1. Reação de PCR foi realizada de acordo com kit FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche). O experimento foi analisado quantitativamente pelo método 2^−ΔΔCt. U6 foi o controle de carga de miR-499-5p, e GAPDH foi o parâmetro interno de outros genes [22].

Análise de Western Blot

Proteína total foi coletada usando tampão de lise de radioimunoprecipitação para tratar tecidos pulmonares. A concentração total de proteína foi medida pelo método de ácido bicinconínico. A amostra de proteína (30 µg) foi processada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 10%, transferida para membrana de fluoreto de polivinilideno, bloqueada com 5% leite em pó desnatado e reagida com anticorpos primários Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase-3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, EUA), Caspase-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), fator de necrose tumoral-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam), interleucina-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, EUA), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) e GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, EUA). Então, a membrana foi incubada com anticorpo secundário (1:2000) e desenvolvida por quimioluminescência aprimorada [23].

Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA)

Os níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α no BALF foram determinados por kit ELISA (Boster, Hubei, China). Determinação colorimétrica foi realizada a 450 nm.

Detecção de Índices de Estresse Oxidativo

Os tecidos pulmonares em nitrogênio líquido foram pesados e diluídos em certa proporção de soro fisiológico sob condição de baixa temperatura, então homogeneizados e centrifugados a 4℃, 3000 r/min por 20 min a baixa temperatura, e o sobrenadante foi tomado para determinação. A atividade de mieloperoxidase (MPO) foi testada por kit de detecção MPO (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), e malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px) e catalase (CAT) foram testados por kits fornecidos pelo JianCheng Bioengineering Institute.

Ensaio de Reporter Luciferase Duplo

Sox6 pode ser o gene alvo de miR-499-5p predito por um site biológico (https://www.targetscan.org/vert_72/). Havia quatro sítios de ligação entre miR-499-5p e região 3' não traduzida (UTR) do mRNA de Sox6. Os vetores pmiR-RB-REPORT-Sox6 tipo selvagem (WT) e pmiR-RB-REPORT-Sox6 tipo mutante (MUT) foram construídos pela Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Guangdong, China), e os plasmídeos reporter luciferase correspondentes foram gerados. Células TC-1 (células epiteliais pulmonares de camundongo, 1 × 10⁵ células/poço, Shanghai Yiyan biological technology Co., Ltd., Shanghai, China) foram semeadas em placa de 24 poços, e transfectadas com agomir miR-499-5p ou agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT ou pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT via Lipofectamine2000. Sistema de ensaio de reporter luciferase duplo (Promega, WI, EUA) foi aplicado para medir atividade luciferase.

Análise Estatística

Todos os dados foram analisados pelo software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EUA). Dados de medição foram expressos por média ± desvio padrão. Comparações entre dois grupos foram conduzidas por teste t, comparações entre múltiplos grupos foram avaliadas por análise de variância unidirecional (ANOVA), e teste post hoc de Tukey foi usado para comparação pareada após análise ANOVA. Curva de sobrevivência foi feita pelo método Kaplan-Meier. Valor P < 0,05 indicou diferença estatisticamente significativa.

Resultados

Razão W/D e Sox6 Aumentados Enquanto miR-499-5p Diminuído em Tecidos Pulmonares de Camundongos com Lesão Pulmonar Induzida por Sepse

A toxicidade de miR-499-5p foi testada em camundongos para detectar o tempo de sobrevivência de camundongos sépticos. Os resultados mostraram (Fig. 1a) a taxa de sobrevivência dentro de 7 dias de camundongos no grupo sham foi 100%, e a de camundongos sépticos foi reduzida. A taxa de sobrevivência de camundongos sépticos após tratamento com miR-499-5p foi melhorada. Os resultados da razão W/D de tecidos pulmonares demonstraram que (Fig. 1b): versus grupo sham, razão W/D foi elevada no grupo modelo (P < 0,05). Em comparação com grupo agomir NC e grupo si-NC, razão W/D foi reduzida no grupo agomir miR-499-5p e grupo si-Sox6 (ambos P < 0,05). Razão W/D foi marcadamente aumentada no grupo agomir miR-499-5p + oe-Sox6 relativo ao grupo agomir miR-499-5p + oe-NC (P < 0,05).

Expressão de miR-499-5p e Sox6 foram detectadas e encontramos que (Fig. 1c-f): em contraste com grupo sham, miR-499-5p reduziu e Sox6 aumentou no grupo modelo (ambos P < 0,05). Em relação ao grupo agomir NC, miR-499-5p aumentou e Sox6 diminuiu no grupo agomir miR-499-5p (ambos P < 0,05). Versus grupo si-NC, Sox6 deprimido no grupo si-Sox6 (P < 0,05). Por comparação com grupo agomir miR-499-5p + oe-NC, Sox6 dramaticamente elevado no grupo agomir miR-499-5p + oe-Sox6 (P < 0,05).

O conteúdo proteico de Sox6 em tecidos pulmonares de camundongos sépticos foi determinado por imuno-histoquímica (Fig. 1g). Observou-se que versus grupo sham, expressão proteica de Sox6 foi aumentada no grupo Modelo (P < 0,05); comparado com grupo agomir NC e si-NC, menor expressão proteica de Sox6 foi examinada no grupo agomir miR-499-5p e grupo si-Sox6 (ambos P < 0,05); relativo ao grupo agomir miR-499-5p + oe-NC, expressão proteica de Sox6 foi aumentada no grupo agomir miR-499-5p + oe-Sox6 (P < 0,05).

miR-499-5p Restaurado ou Sox6 Depletado Alivia Patologia de Tecidos Pulmonares, Reduz Escore de Lesão Pulmonar, Fibras de Colágeno e Grau de Fibrose Pulmonar em Camundongos com Lesão Pulmonar Induzida por Sepse

Resultados de coloração HE apresentaram que (Fig. 2a): no grupo sham, a estrutura do tecido pulmonar estava intacta, o septo alveolar basicamente manifestado sem edema ou inflamação, e a cavidade alveolar clara. No grupo modelo, agomir NC, si-NC e agomir miR-499-5p + oe-Sox6, exsudação, edema e hemorragia podiam ser vistos na maioria das cavidades alveolares de tecidos pulmonares, e infiltração massiva de células inflamatórias mostrou no interstício pulmonar. Nos grupos agomir miR-499-5p, si-Sox6 e agomir miR-499-5p + oe-NC, a lesão de tecidos pulmonares foi reduzida versus grupo modelo.

Escore de lesão tecidual pulmonar de camundongos e resultados de escore semi-quantitativo de Ashcroft mostraram que (Fig. 2b,d): em relação ao grupo sham, escore de lesão pulmonar e grau de fibrose pulmonar foram obviamente aumentados no grupo modelo (P < 0,05). Versus grupo agomir NC e si-NC, escore de lesão pulmonar e grau de fibrose pulmonar foram reduzidos nos grupos agomir miR-499-5p e si-Sox6 (ambos P < 0,05). Em contraste com grupo agomir miR-499-5p + oe-NC, escore de lesão pulmonar e grau de fibrose pulmonar foram marcadamente elevados no grupo agomir miR-499-5p + oe-Sox6 (P < 0,05).

Os resultados de coloração de Masson revelaram que (Fig. 2c): no grupo sham, tecidos pulmonares de camundongos continham pequena quantidade de fibras de colágeno azuis. No grupo modelo, agomir NC, si-NC e agomir miR-499-5p + oe-Sox6, as fibras de colágeno aumentaram. No grupo agomir miR-499-5p, grupo si-Sox6 e grupo agomir miR-499-5p + oe-NC, as fibras de colágeno diminuíram versus grupo modelo.

miR-499-5p Restaurado ou Sox6 Depletado Reduz Células TUNEL Positivas, Expressão de Proteína Caspase-3 e Caspase-9 em Tecidos Pulmonares de Camundongos com Lesão Pulmonar Induzida por Sepse

Resultados de Western blot, coloração TUNEL e imuno-histoquímica indicaram que (Fig. 3a-f): núcleo normal era azul e núcleo apoptótico marrom em diferentes tons. Versus grupo sham, células TUNEL positivas, expressão de proteína Caspase-3 e Caspase-9 foram aumentadas no grupo modelo (todos P < 0,05). Versus grupos agomir NC e si-NC, células TUNEL positivas, expressão de proteína Caspase-3 e Caspase-9 foram reduzidas nos grupos agomir miR-499-5p e si-Sox6 (todos P < 0,05). Versus grupo agomir miR-499-5p + oe-NC, células TUNEL positivas, expressão de proteína Caspase-3 e Caspase-9 foram aumentadas no grupo agomir miR-499-5p + oe-Sox6 (todos P < 0,05).

miR-499-5p Restaurado ou Sox6 Depletado Diminui Conteúdo de TNF-α, IL-1β e IL-6 no BALF e Tecidos Pulmonares de Camundongos com Lesão Pulmonar Induzida por Sepse

Foi exibido por resultados de ELISA e Western blot que (Fig. 4a-g): TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaram no grupo modelo relativo ao grupo sham (todos P < 0,05). Versus grupos agomir NC e si-NC, TNF-α, IL-1β e IL-6 diminuíram nos grupos agomir miR-499-5p e si-Sox6 (todos P < 0,05). Versus grupo agomir miR-499-5p + oe-NC, TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaram no grupo agomir miR-499-5p + oe-Sox6 (todos P < 0,05).

miR-499-5p Restaurado ou Sox6 Depletado Aumenta Atividades de SOD, CAT e GSH-Px Bem Como Reduz Conteúdo de MDA e MPO em Tecidos Pulmonares de Camundongos com Lesão Pulmonar Induzida por Sepse

Os resultados de detecção de índices de estresse oxidativo apresentaram que (Fig. 5a-e): versus grupo sham, atividades de SOD, CAT e GSH-Px prejudicadas enquanto conteúdo de MDA e MPO aumentaram no grupo modelo (todos P < 0,05). Versus grupos agomir NC e si-NC, atividades de SOD, CAT e GSH-Px aumentaram enquanto conteúdo de MDA e MPO reduziram nos grupos agomir miR-499-5p e si-Sox6 (todos P < 0,05). Versus grupo agomir miR-499-5p + oe-NC, atividades de SOD, CAT e GSH-Px suprimidas enquanto conteúdo de MDA e MPO aumentaram no grupo agomir miR-499-5p + oe-Sox6 (todos P < 0,05).

miR-499-5p Alveja Diretamente Sox6

Previemos através do site de bioinformática TargetScan que havia sítios de ligação alvo entre miR-499-5p e SOX4/6. Usando RT-qPCR, encontrou-se que comparado com grupo sham, expressão de SOX2/4/6 aumentou no grupo modelo, e expressão de SOX6 aumentou principalmente (todos P < 0,05); versus grupo agomir NC, grupo agomir miR-499-5p demonstrou nenhuma mudança na expressão de SOX2 enquanto mostrou redução na expressão de SOX4, principalmente diminuição de SOX6 (Arquivo adicional 1: Fig. S1a, b). Portanto, finalmente selecionamos SOX6 como gene alvo de miR-499-5p. O site de predição biológica (https://www.targetscan.org/vert_72/) revelou que miR-499-5p poderia alvejar Sox6 (Fig. 6a). Ensaio de reporter luciferase duplo demonstrou que (Fig. 6b) versus grupo controle, a atividade luciferase foi obviamente destruída após co-transfeção do vetor pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT e agomir miR-499-5p em células TC-1 (P < 0,05), enquanto a atividade luciferase não mostrou diferença distinta após co-transfeção de agomir miR-499-5p com vetor pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT ou agomir-NC co-transfectado com vetor pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT (P > 0,05), sugerindo que miR-499-5p poderia ligar diretamente a 3'UTR WT de Sox6, e então inibir a atividade luciferase.

Discussão

Sepse é causa crítica de choque e síndrome de disfunção de múltiplos órgãos, entre as quais LPA é a complicação orgânica mais frequente e significativa [24]. LPA induzida por sepse aparece não apenas a mais precoce, maior incidência, mas também progride rapidamente, a taxa de fatalidade é alta, e não há terapia eficaz atualmente [25]. Um estudo anterior propôs que a up-regulação de miR-218 atenuou a secreção de fatores inflamatórios e preveniu lesão pulmonar induzida por sepse [26]. Além disso, promover níveis de miR-146a poderia reduzir inflamação em LPA [27] e restauração de miR-125b melhora sobrevivência de camundongos com LPA e suprime inflamação [28]. Embora estudos tenham destacado o papel de miRNAs em lesão pulmonar, o mecanismo detalhado de miR-499-5p em lesão pulmonar induzida por sepse tem sido pouco investigado, assim focamos em miR-499-5p para descobrir seu potencial terapêutico em LPA induzida por sepse. Também, um estudo forneceu prova que Sox6 aumentado estava envolvido em apoptose cardíaca induzida por sepse [10]. Esforços devem ser feitos para entender profundamente lesão pulmonar induzida por sepse. Nosso objetivo é discutir o efeito protetor de miR-499-5p alvejando Sox6 em camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse.

A razão W/D de tecidos pulmonares foi calculada em nosso estudo, e a expressão de Sox6 e miR-499-5p em tecidos pulmonares de camundongo foi avaliada. Os resultados mostraram que razão W/D e Sox6 aumentaram enquanto miR-499-5p diminuiu em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. Um estudo recente propôs que expressão de miR-499-5p em pacientes com sepse leve, sepse grave e choque séptico foi dramaticamente diminuída relativa àquela em controles normais [9]. Outro estudo apresentou que expressão de miR-499-5p foi marcadamente declinada em tecidos de câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) e ligada a desfechos clínicos ruins [29]. Relata-se que expressão de Sox6 foi elevada em tecidos de câncer de pulmão em comparação com tecidos normais [30]. Similarmente, estudo anterior revelou que expressão de Sox6 foi notavelmente elevada em tecidos renais de camundongos com doença renal diabética [31]. Nosso estudo também apresentou que miR-499-5p alvejou diretamente Sox6. Uma descoberta importante foi que Sox6 é gene alvo de miR-499 [10]. Outro estudo forneceu dados de que Sox6 era gene alvo de miR-499-5p, e restauração de miR-499-5p suprimiu expressão de Sox6 [32]. No entanto, a relação alvo de miR-499-5p e Sox6 em tecidos pulmonares de camundongos sépticos induzidos não foi descoberta ainda.

Além disso, foi revelado que miR-499-5p restaurado ou Sox6 depletado aliviou patologia de tecidos pulmonares, reduziu escore de lesão pulmonar, fibras de colágeno e grau de fibrose pulmonar, e reduziu células TUNEL positivas, expressão de proteína Caspase-3 e Caspase-9 em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. Foi previamente sugerido que up-regulação de miR-499-5p suprime proliferação celular e promove apoptose in vivo e in vitro de CPNPC [29]. Outro estudo verificou que restaurar miR-499-5p e depletar Sox6 atenuou apoptose celular induzida por hipóxia/re-oxigenação e reduziu expressão de Caspase-3 [32]. Foi apresentado que down-regulação de Sox6 alivia lesão patológica e reprime apoptose neuronal em tecidos hipocampais de doença de Alzheimer [33]. Além disso, estudo revelou que depleção de Sox6 inibiu apoptose celular induzida por alta glicose e fibrose intersticial renal em células mesangiais renais de camundongo [31]. Outro estudo demonstrou que baixa expressão de Sox6 declinou atividade de Caspase-3 e porcentagem de células apoptóticas em células P19CL6 de camundongo [34]. Adicionalmente, verificamos que miR-499-5p restaurado ou Sox6 depletado declinou TNF-α, IL-1β e IL-6 no BALF e tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. Xia et al. iluminaram que níveis de TNF-α e IL-6 foram dramaticamente elevados em camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse [35]. Um estudo demonstrou que baixa expressão de Sox6 declina reação inflamatória em tecidos hipocampais de doença de Alzheimer [33]. Outro resultado neste estudo implicou que miR-499-5p restaurado ou Sox6 depletado aumentou atividades de SOD, CAT e GSH-Px bem como reduziu conteúdo de MDA e MPO em tecidos pulmonares de camundongos com lesão pulmonar induzida por sepse. Foi apresentado que LPA induzida por CLP foi caracterizada por inflamação em morfologia, razão W/D aumentada, concentração de proteína elevada no BALF, nível mais alto de MPO e MDA bem como nível mais baixo de atividades de SOD, GSH-Px e CAT em pulmões após CLP [36]. Foi sugerido que atividade de SOD e CAT foram diminuídas em LPA induzida por sepse em camundongos [37]. Além disso, estudo relatou que miR-499-5p superexpressado e Sox6 pouco expressado diminuíram nível de MDA [32].

Conclusão

Em conclusão, encontramos que alta expressão de miR-499-5p pode atenuar apoptose de células de tecidos pulmonares e inibir inflamação de lesão pulmonar induzida por sepse em camundongos via depleção de Sox6, o que pode ter importantes implicações terapêuticas no tratamento de lesão pulmonar induzida por sepse. No entanto, pesquisas clínicas são necessárias para detectar a eficácia para o tratamento de lesão pulmonar induzida por sepse.