Melhoria da seletividade do transdutor amperométrico usando filmes de fenilenodiamina nanométricos

Resumo

Neste trabalho, estudamos as condições de deposição de uma membrana semipermeável à base de polifenilenodiamina (PPD) em eletrodos de disco amperométrico de platina. Restringindo o acesso de substâncias interferentes à superfície do eletrodo, a membrana evita seu impacto na operação do sensor. Dois métodos de deposição de membrana por eletropolimerização foram comparados - em potencial variável (voltametria cíclica) e em potencial constante. A voltametria cíclica mostrou-se mais fácil de executar e proporcionando melhores propriedades da membrana. A dependência da eficácia da membrana PPD no número de voltamogramas cíclicos e concentração de fenilenodiamina foi analisada. Foi demonstrado que o impacto de substâncias interferentes (ácido ascórbico, dopamina, cisteína, ácido úrico) na operação do sensor pode ser completamente evitado usando três voltamogramas cíclicos em fenilenodiamina 30 mM. Por outro lado, ao trabalhar com amostras diluídas, ou seja, em concentrações mais baixas de substâncias eletroativas, é razoável diminuir a concentração de fenilenodiamina para 5 mM, o que resultaria em uma maior sensibilidade dos transdutores ao peróxido de hidrogênio devido a uma camada de PPD mais fina . A membrana PPD foi testada durante operação contínua e armazenamento de 8 dias e mostrou-se eficiente em sensores e biossensores.

Histórico

Biossensores são novos dispositivos analíticos; cujo uso é uma alternativa à cromatografia, espectroscopia e colorimetria. Os biossensores são muito mais baratos e fáceis de usar do que esses métodos tradicionais, porém, muitas vezes inferiores a eles pelas características analíticas. Atualmente, a pesquisa no campo dos biossensóricos está em andamento [1].

De acordo com a definição clássica da Associação Internacional de Pesquisadores em Química Fundamental e Aplicada, um biossensor é um dispositivo integrado baseado em receptor e transdutor, que é capaz de fornecer análises quantitativas ou semiquantitativas usando elemento de reconhecimento biológico [2]. Pelo tipo de transdutor, os biossensores são classificados em vários grupos (eletroquímicos, ópticos, piezoelétricos, etc.), entre os quais os biossensores eletroquímicos são um dos maiores grupos e por sua vez são divididos em amperométricos, potenciométricos, condutométricos e impedimétricos [3] .

Uma das características analíticas importantes dos biossensores é a sua seletividade, ou seja, a capacidade de identificar apenas o composto alvo. A seletividade do biossensor é determinada pela seletividade do material biológico e seletividade do transdutor. Basicamente, enzimas e anticorpos usados em biossensores eletroquímicos como biomateriais são muito seletivos, enquanto os eletrodos, que funcionam como transdutores, são bastante não seletivos. A seletividade do biossensor é de particular importância quando se trabalha com fluidos biológicos reais ou outras amostras complexas; portanto, sua investigação é uma etapa necessária no desenvolvimento de biossensores.

No soro sanguíneo, urina, líquido cefalorraquidiano, etc., existem substâncias interferentes que podem sofrer reações químicas na superfície dos transdutores, causando falsos resultados na medição do biossensor da substância alvo. Os principais interferentes em amostras biológicas são ácido ascórbico, cisteína, homocisteína, ácido úrico, dopamina, glutationa, etc. Suas concentrações no soro de sangue humano são mostradas na Tabela 1.

Existem duas abordagens principais para evitar a oxidação de substâncias interferentes na superfície do eletrodo - uma diminuição do potencial de trabalho pela introdução de substâncias adicionais na membrana biosseletiva ou deposição de membranas semipermeáveis adicionais, o que permite o acesso seletivo da substância alvo à superfície do eletrodo [ 4]. A deposição de membranas semipermeáveis é metodologicamente mais simples e afeta levemente o funcionamento do biossensor.

Em biossensores, o peróxido de hidrogênio oxida ou reduz no eletrodo e, assim, o sinal do biossensor é gerado. Portanto, um problema atual é o desenvolvimento de filmes nanoporosos, que são permeáveis ao peróxido de hidrogênio e evitam a penetração de outras substâncias. Dentre essas membranas, os filmes poliméricos à base de fenilenodiamina (PD) atraem considerável atenção [5]. A membrana à base de polifenilenodiamina (PPD) tem nanoporos; seu tamanho é suficiente para penetrar compostos de baixo peso molecular, incluindo peróxido de hidrogênio, através da membrana até a superfície do eletrodo. Por outro lado, a membrana não permite a passagem ou oxidação de substâncias maiores, como o ácido ascórbico ou a dopamina. Assim, a membrana melhora a seletividade ao peróxido de hidrogênio, o que, por sua vez, aumenta a precisão do biossensor. Em vários trabalhos, diferentes isômeros de PD e métodos de polimerização de PD foram estudados. Particularmente, as membranas PPD foram formadas em microeletrodos de fibra de carbono revestidos de rutênio por eletrodeposição a um potencial constante (+ 0,7 V) ao criar biossensores baseados em glicose oxidase, lactato oxidase e glutamato oxidase [6]. Três isômeros PD foram testados; os resultados com metaisômero foram os melhores. Como ainda permanecia alguma sensibilidade ao ácido ascórbico, foi adicionado ascorbato oxidase para eliminá-lo completamente. Em [7], os autores estudaram membranas PPD depositadas em cilindros de Pt-Ir por CV ou amperometria de potencial constante. A sensibilidade ao ácido ascórbico diminuiu notavelmente com as membranas baseadas em meta- e orto-isômeros oxidados em um potencial constante, enquanto a sensibilidade ao peróxido de hidrogênio diminuiu em apenas 10%. Os resultados obtidos com membranas PPD depositadas em eletrodos de disco de paládio foram bem diferentes [8]. Eletrodeposição de m -PD por CV causou a formação de filmes com permeabilidade ao peróxido de hidrogênio três vezes maior em comparação com m -PD oxidação em potencial constante. Assim, m -PD mostrou-se preferível entre todos os isômeros. O sensor de peróxido de hidrogênio relatado recentemente usando o depositado em CV O filme -PD com nanopartículas de Au [9] demonstrou boa prevenção de efeitos de interferência. Geralmente, pode-se concluir que m -PD é superior a outros para todos os eletrodos, enquanto o procedimento de polimerização PD deve ser otimizado em cada caso particular. Além disso, as membranas baseadas em PD também podem ser usadas em sensores sem o elemento biológico. Como foi demonstrado recentemente, a albumina sérica bovina pode ser detectada por um sensor baseado em copolímeros conjugados de PD e outros compostos aromáticos (foi observada extinção da fluorescência da proteína após a ligação com o copolímero) [10].

Assim, o objetivo do presente trabalho foi comparar diferentes métodos de m deposição de -fenilenodiamina e selecionar um procedimento ideal de formação de PPD nos eletrodos do disco de platina.

Métodos

Materiais

Ácido ascórbico, cisteína, ácido úrico, dopamina, peróxido de hidrogênio, m -fenilenodiamina e HEPES foram adquiridos na Sigma-Aldrich Chemie (EUA). Todos os outros produtos químicos eram de p.a. grau.

As amostras de soro de sangue humano foram obtidas no Centro Científico e Prático Municipal de Kyiv de Nefrologia e Hemodiálise (Ucrânia).

Projeto de transdutores amperométricos

Neste trabalho, eletrodos de disco de platina feitos por você mesmo serviram como transdutores amperométricos. Fio de platina com 0,4 mm de diâmetro e 3 mm de comprimento foi selado em uma extremidade de um capilar de vidro com um diâmetro externo de 3,5 mm. Uma extremidade aberta do fio era a superfície de trabalho do transdutor. Uma extremidade interna do fio de platina foi soldada pela liga de Wood a uma extremidade de um fio de prata dentro do capilar; sua outra extremidade estava conectada a um potenciostato. Os eletrodos foram usados repetidamente; antes do uso, sua superfície de trabalho foi tratada com HCl por 30 s, lavada com etanol e polida com lixa P1500 PS 8A.

Métodos de medição

Os espectros de absorção de UV-vis das amostras foram medidos no espectrômetro Thermo Evolution 600 na faixa de comprimentos de onda de 200–900 nm no modo de refletância difusa usando uma esfera de integração. O padrão de refletância difusa Spectralon e o disco de platina foram usados como amostras em branco para m pó de fenilenodiamina e camada de PPD na superfície do eletrodo de Pt, respectivamente.

Para as medições eletroquímicas, os eletrodos de trabalho foram colocados em uma célula eletroquímica clássica com eletrodos auxiliares (fio de platina) e de referência (Ag / AgCl em KCl saturado) conectados ao potenciostato PalmSens (Palm Instruments BV, Holanda). A utilização do multiplexador de oito canais (do mesmo produtor), conectado ao potenciostato, permitiu o monitoramento simultâneo dos sinais de oito eletrodos; entretanto, em nosso trabalho, geralmente usamos três eletrodos por causa do pequeno tamanho da célula de trabalho.

As medidas cronoamperométricas (técnica de “detecção amperométrica”) foram realizadas à temperatura ambiente em uma célula de vidro aberta de 3 mL com agitação permanente por um agitador magnético e com potencial constante de 0,6 V versus eletrodo de referência Ag / AgCl. Dez milimolares de HEPES, pH 7,4, foram usados como tampão de trabalho em todos os experimentos. As concentrações de substrato na célula de trabalho foram obtidas por adição de alíquotas de soluções estoque (peróxido de hidrogênio 50 mM, ácido ascórbico 20 mM, cisteína 3 mM, ácido úrico 4,5 mM, dopamina 2,1 mM). Novas soluções foram preparadas pouco antes do experimento. Todas as substâncias eletroativas, exceto o ácido úrico, foram dissolvidas no tampão de trabalho; o ácido úrico devido à sua pequena solubilidade foi dissolvido em água destilada com NaBrO 5 mM ₃ . A fenilenodiamina foi dissolvida em tampão fosfato 40 mM, pH 7,4.

A voltametria cíclica foi realizada na mesma célula de medição sem agitação. O potencial inicial era 0 V, o potencial final era +0,9 V, a taxa de varredura (taxa de mudança potencial) 20 mV / s e a etapa de mudança potencial 5 mV.

Todos os experimentos foram realizados em três repetições. Os dados nas tabelas e figuras representam um valor médio de experimentos ± desvio padrão, calculado pelo programa OriginLab OriginPro 8.5.

Resultados e discussão

Para confirmar os motivos da deposição de membrana adicional no transdutor amperométrico para melhoria de sua seletividade ao peróxido de hidrogênio, foi necessário verificar a sensibilidade e seletividade deste transdutor em relação a possíveis interferentes.

Os biossensores podem ser empregados para medições em amostras diluídas e não diluídas. A opção de diluição depende da concentração da substância a ser analisada e da sensibilidade do biossensor:se o biossensor consegue identificar a substância alvo em concentrações dezenas de vezes inferiores às reais nas amostras, esta deve ser diluída para diminuir o conteúdo de interferentes e, assim, melhorar a precisão da matriz. Além disso, permite uma redução de dezenas de vezes do volume do substrato necessário para as medições.

Às vezes, a concentração da substância analisada é muito baixa ou a diluição é indesejável por razões técnicas. Para melhor compreensão da função do transdutor amperométrico, foram usados materiais eletroativos de três concentrações:(1) relevantes para o soro sanguíneo, (2) 20 vezes menor do que (1), ou seja, diluição 20 vezes, e (3) 100- diluição de vezes. As respostas do biossensor às substâncias eletroativas de três concentrações foram recebidas usando o transdutor nu antes da deposição do filme PPD, e a sensibilidade do transdutor foi calculada (Tabela 2). Como visto, a sensibilidade à dopamina e ao ácido ascórbico foi a mais alta, à cisteína - a mais baixa. No entanto, os ácidos ascórbico e úrico podem ser considerados os principais interferentes devido às suas concentrações essencialmente mais elevadas nas amostras biológicas. As respostas do transdutor a essas substâncias são uma ordem de magnitude maior do que a resposta à substância-alvo, o peróxido de hidrogênio. Portanto, o transdutor simples não é adequado para medições em amostras biológicas devido ao impacto pronunciado de interferentes. Por outro lado, após a diluição de 100 vezes, as respostas à cisteína e dopamina tornaram-se insignificantes, e a resposta a todos os interferentes no total foi de apenas cerca de 20% da resposta ao peróxido de hidrogênio, o que significa que em alguns casos, o sensor pode ser usado mesmo sem modificações adicionais.

Atualmente, há apenas informações fragmentadas sobre os métodos de deposição de membrana PPD em transdutores. Portanto, na próxima etapa do trabalho, foi avaliado qual dos dois métodos mais comuns e promissores é mais viável.

No primeiro método, membranas de PPD foram depositadas na superfície do eletrodo do disco de platina via eletropolimerização de moléculas do monômero fenilenodiamina usando potencial variável (voltametria cíclica). Os transdutores com eletrodos de referência e auxiliares foram colocados em uma célula de trabalho com solução de fenilenodiamina, e diversos voltamogramas cíclicos foram obtidos [7]. Um exemplo do experimento é mostrado na Fig. 1. Durante o primeiro voltamograma cíclico (CVA), um aumento significativo na corrente foi observado no potencial variando de 0,5 a 0,9 V devido à oxidação da fenilenodiamina. Durante o segundo CVA e os subsequentes, a corrente diminuiu significativamente, indicando uma velocidade mais baixa de eletropolimerização. No entanto, como os seguintes experimentos mostraram, a formação da membrana PPD durou todo o CV.

Voltamogramas cíclicos obtidos na eletropolimerização de fenilenodiamina na superfície do transdutor

O segundo método de deposição da membrana PPD consiste na oxidação da fenilenodiamina a um potencial constante de + 0,7 V em um tempo fixo (40 min) [11]. A comparação das respostas do transdutor ao usar os dois métodos de deposição é mostrada na Tabela 3. A seguir, as respostas às substâncias eletroativas sem a membrana PPD foram consideradas como 100%. As membranas, depositadas por ambos os métodos, impediram os interferentes de maneira bastante eficaz - apenas uma fraca sensibilidade à cisteína foi observada. Por outro lado, a sensibilidade do transdutor ao peróxido de hidrogênio após a voltametria aumentou 2,6 vezes. Isso pode ser explicado pela eletroativação da platina durante a voltametria, mas não pelo efeito da membrana PPD. Esse aumento da sensibilidade ao peróxido de hidrogênio foi observado também após a obtenção de voltamogramas cíclicos em tampão fosfato sem fenilenodiamina. Após a deposição da membrana em um potencial constante, nenhuma eletroativação foi revelada e as respostas ao peróxido de hidrogênio não mudaram. Assim, o uso de voltametria cíclica revelou-se preferível por três razões - menos tempo para uma deposição (20 vs. 40 min), impedimento mais eficiente de cisteína e respostas crescentes ao peróxido de hidrogênio.

No entanto, a voltametria cíclica tem uma desvantagem - os voltamogramas podem ser obtidos simultaneamente em um eletrodo apenas (mesmo usando o multiplexador), enquanto a deposição da membrana em um potencial constante permite a conexão simultânea de 8-16 eletrodos de trabalho (dependendo do tipo de multiplexador). Portanto, trabalhos futuros devem ser focados na otimização das condições dos voltamogramas cíclicos para diminuir o tempo de pré-tratamento do transdutor.

A eletropolimerização de PD por CV e amperometria de potencial constante deve ocorrer por diferentes vias através de um mecanismo bastante complicado [12]. Assim, o CV envolve alto potencial aplicado, o que leva à geração de oligômeros menos conjugados de DP. Por esse motivo, supõe-se que na polimerização de PD por CV, os poros são maiores e a permeabilidade da camada de PPD é maior se comparada à polimerização em potencial constante [8, 13]. No entanto, conforme observado na seção “Antecedentes”, diferentes autores chegaram a conclusões contraditórias sobre o método preferencial de deposição de DP e, em muitos casos, o CV deu bons resultados. Em nossa opinião, tanto CV quanto amperometria de potencial constante podem fornecer a geração de membranas PPD com boas propriedades permseletivas, e a otimização é necessária para cada caso particular.

A membrana PPD era claramente visível na superfície do eletrodo como um filme marrom dourado transparente uniforme. Para confirmar que é PPD de fato, a polimerização de PD foi adicionalmente confirmada por espectroscopia. O espectro de refletância difusa UV-vis do filme (Fig. 2) demonstra bandas de absorvância intensa em 222 e 315 nm, semelhantes às bandas do monômero e relacionadas às transições de elétrons nos anéis aromáticos [14], enquanto a absorvância sem características. em 400-800 nm, diminuindo constantemente com o comprimento de onda relacionado a π - π * transições de elétrons em sistema aromático altamente conjugado de polímero PPD condutor.

Espectros de refletância difusa de UV-vis de m -fenilenodiamina e membrana PPD, formada no eletrodo de Pt

Para melhor interpretação dos resultados obtidos, seria útil estimar o tamanho dos poros nas membranas PPD produzidas por diferentes métodos. No entanto, a determinação direta do tamanho dos poros na membrana PPD é quase impossível, uma vez que a membrana consiste em várias camadas de PD e os poros nas camadas inferiores podem ter tamanhos diferentes. Killoran e O’Neill determinaram que a espessura da membrana efetiva de m -PD foi de 15 nm, e a área de seção transversal de uma fita polimérica oligomérica estimada por del Valle et al. foi de 1 nm [7, 15]. Assim, a membrana PPD contém cerca de 15 camadas de polímero. Uma vez que a membrana PPD tem propriedades hidrofóbicas e de isolamento, a membrana deve ter nanoporos perfurantes que se estendem até a superfície do eletrodo e permitem o desvio das moléculas de peróxido de hidrogênio, caso contrário, H ₂ O ₂ não pode ser oxidado e gerar sinal amperométrico. Os poros definitivamente não são uniformes e o diâmetro mínimo dos poros deve ser inferior a 1 nm para rejeitar moléculas eletroativas e, portanto, é muito difícil analisar os poros, mesmo com microscópios eletrônicos ou de força atômica. Por essas razões técnicas, é muito mais fácil estimar a eficácia da membrana PPD avaliando a permeabilidade da membrana para diferentes moléculas. Essa abordagem indireta é amplamente difundida e permite a comparação de características práticas de diferentes membranas.

A eficácia das membranas PPD depositadas usando vários números de voltamogramas cíclicos foi testada (Fig. 3).

Eficiência de membranas PPD depositadas usando diferentes números de CVAs

A membrana PPD depositada por um CVA era obviamente insuficiente para eliminar a influência dos interferentes. No entanto, aqui, o efeito da eletroativação da platina foi o mais forte. Com o aumento posterior do número dos voltamogramas, as respostas aos interferentes diminuíram, mas, ao mesmo tempo, a sensibilidade do transdutor ao peróxido de hidrogênio também diminuiu, provavelmente por causa da camada de PPD muito espessa, que impede a difusão da substância. Três CVAs foram suficientes para o desaparecimento completo das respostas à dopamina e ácido úrico, e diminuição significativa nas respostas ao ácido ascórbico e cisteína. Portanto, três CVAs foram considerados ótimos e a concentração de fenilenodiamina foi aumentada até a eliminação completa do impacto do interferente (Fig. 4).

Eficiência das membranas PPD depositadas em diferentes concentrações de fenilenodiamina

Notavelmente, o uso de fenilenodiamina 5 mM foi suficiente para eliminar as respostas a interferentes de pequenas concentrações remanescentes após a diluição da amostra, mas deficiente para trabalhar com amostras não diluídas. Um aumento da concentração de fenilenodiamina para 20 mM e três CVAs revelou-se suficiente para a eliminação completa do impacto da cisteína e uma diminuição das respostas ao ácido ascórbico para o nível mais baixo (0,1% da resposta ao ácido ascórbico sem membrana PPD). O uso de concentração de fenilenodiamina mais alta (até 100 mM) resultou na redução em duas vezes da sensibilidade do transdutor ao peróxido de hidrogênio, provavelmente devido à camada de PPD muito espessa. Assim, a deposição de membrana PPD usando três CVAs em fenilenodiamina 30 mM é um procedimento ideal. Como um voltamograma durou cerca de 2 min, a deposição da membrana em um sensor levou 6 min.

Em seguida, a estabilidade da membrana PPD foi estudada. Após a deposição das membranas PPD, os sensores foram colocados no tampão de trabalho por 2 h, e as respostas ao peróxido de hidrogênio, ácido ascórbico e cisteína foram medidas para avaliar as mudanças na permseletividade da membrana (Fig. 5). Verificou-se que as respostas ao peróxido de hidrogênio aumentaram ligeiramente durante o trabalho, ao passo que pequenas respostas aos interferentes tornaram-se ainda menores. Provavelmente, isso aconteceu porque o ácido ascórbico e a cisteína obstruíram gradualmente alguns poros grandes na camada de PPD. Este experimento demonstrou que a membrana PPD pode ser utilizada sem perda significativa em sua seletividade ao peróxido de hidrogênio durante pelo menos 2 h.

Estabilidade da membrana PPD durante 2 horas. As respostas a três substâncias foram normalizadas para a resposta inicial à substância correspondente após a deposição de PPD

A estabilidade de armazenamento da membrana PPD foi investigada. Os sensores com membranas de PPD depositadas foram armazenados secos durante 8 dias a -18 ° C; periodicamente, os sensores eram descongelados e as respostas ao peróxido de hidrogênio, ácido ascórbico e cisteína eram medidas (Fig. 6). Durante este período, a sensibilidade dos sensores ao peróxido de hidrogênio aumentou 2,5 vezes; a sensibilidade ao ácido ascórbico e cisteína não mudou. Este efeito pode ser explicado pelo inchaço lento da membrana PPD que levou a uma melhoria da difusão do peróxido de hidrogênio através da camada de PPD.

Estabilidade de armazenamento da membrana PPD. As respostas foram normalizadas para responder a H ₂ O ₂ no primeiro dia

Finalmente, a eficácia da membrana PPD foi validada na análise de amostras biológicas reais. Os transdutores sem membranas demonstraram sinais fracos após adição de soro sanguíneo à célula de trabalho devido à presença de compostos eletroativos. No entanto, após a deposição da membrana, nenhuma resposta foi obtida. Resultados semelhantes foram obtidos com o lisado de neurônios. Esses experimentos demonstram que o método desenvolvido de deposição de PPD em eletrodos de disco de platina é eficaz e os transdutores modificados podem ser usados para trabalhar com amostras biológicas complexas.

É útil comparar o método de deposição de PPD desenvolvido neste trabalho com os métodos relatados anteriormente (Tabela 4).

Como visto, o método apresentado é o mais rápido e as propriedades de bloqueio da membrana obtida são melhores ou pelo menos não piores do que as de outras membranas PPD.

Conclusões

Nós investigamos as condições de deposição de uma membrana semipermeável à base de polifenilenodiamina com o objetivo de diminuir o impacto de substâncias interferentes no funcionamento do biossensor. Foi demonstrado que a eletropolimerização da fenilenodiamina por voltametria cíclica foi mais fácil e proporcionou melhores propriedades da membrana se comparada à eletropolimerização a potencial constante. A dependência da eficácia da membrana PPD no número de voltamogramas cíclicos e concentração de fenilenodiamina foi investigada. Foi demonstrado que o impacto de substâncias interferentes na operação do sensor pode ser completamente eliminado usando três voltamogramas cíclicos em fenilenodiamina 30 mM. Por outro lado, ao trabalhar com amostras diluídas, isto é, concentrações mais baixas de substâncias eletroativas, é razoável diminuir a concentração de fenilenodiamina para 5 mM, o que resultaria em maior sensibilidade do transdutor ao peróxido de hidrogênio devido a uma camada de PPD mais fina. A membrana PPD pode ser usada sem perda significativa em sua seletividade ao peróxido de hidrogênio durante pelo menos 2 h de operação contínua e pode ser armazenada por pelo menos 8 dias. Foi demonstrado que o transdutor com membrana PPD não é sensível às substâncias eletroativas presentes nas amostras biológicas e pode ser utilizado para a criação do biossensor.

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