Melhoria da Seletividade de Transdutores Amperométricos com Filmes Nanométricos de Polifenilenodiamina

Resumo

Neste estudo, otimizamos a eletropolimerização de uma membrana semipermeável de polifenilenodiamina (PPD) em eletrodos de disco de platina para suprimir interferências em sensoriamento amperométrico. Duas rotas de deposição foram comparadas: voltametria cíclica (VC) e oxidação a potencial constante. A VC mostrou-se mais simples de executar e produziu uma membrana superior. Investigamos como o número de varreduras de VC e a concentração de fenilenodiamina (PD) influenciam o desempenho da membrana. Três varreduras de VC em PD 30 mM eliminaram completamente as respostas a interferentes comuns, como ácido ascórbico, dopamina, cisteína e ácido úrico. Para análises que exigem maior sensibilidade — por exemplo, amostras diluídas —, a redução da concentração de PD para 5 mM produz uma camada de PPD mais fina e melhora a detecção de peróxido de hidrogênio. Os eletrodos modificados com PPD mantiveram sua seletividade durante 2 h de operação contínua e conservaram funcionalidade após 8 dias de armazenamento a –18 °C, tornando-os adequados para aplicações em biossensores.

Introdução

Biossensores oferecem alternativa custo-efetiva à cromatografia, espectroscopia e colorimetria, mas muitas vezes ficam aquém no desempenho analítico. A pesquisa em biossensores está em rápida evolução [1]. Segundo a Associação Internacional de Pesquisadores em Química Fundamental e Aplicada, um biossensor é um dispositivo integrado que acopla um elemento de reconhecimento biológico a um transdutor para fornecer análise quantitativa ou semi-quantitativa [2]. Biossensores eletroquímicos — amperométricos, potenciométricos, condutométricos e impedimétricos — constituem o maior subgrupo [3].

A detecção seletiva é crítica ao analisar matrizes biológicas complexas, como soro sanguíneo, urina ou líquido cefalorraquidiano, onde moléculas endógenas (ácido ascórbico, cisteína, homocisteína, ácido úrico, dopamina, glutationa) podem gerar sinais falsos. A seletividade de um biossensor provém tanto do receptor biológico quanto do transdutor; enzimas e anticorpos são inerentemente seletivos, enquanto eletrodos são tipicamente não seletivos. Portanto, estratégias para proteger o eletrodo de interferências são essenciais.

Duas estratégias principais existem: reduzir o potencial de operação ou adicionar uma membrana semipermeável que permita o analito-alvo enquanto repele interferentes maiores [4]. A deposição de filmes poliméricos nanoestruturados é direta e afeta minimamente o desempenho do sensor. Entre membranas poliméricas, derivados de fenilenodiamina (PD) têm atraído atenção por sua arquitetura nanoestruturada que permite a difusão de peróxido de hidrogênio enquanto bloqueia espécies maiores [5]. Filmes de polifenilenodiamina (PPD) exibem poros que acomodam moléculas pequenas como H₂O₂, mas excluem moléculas maiores como ácido ascórbico ou dopamina, aumentando a precisão do sensor. Trabalhos prévios exploraram diferentes isômeros de PD e métodos de polimerização; meta-PD (m-PD) geralmente produz as membranas mais permeáveis e seletivas, especialmente quando depositadas por voltametria cíclica [6–9]. Estudos recentes também demonstram membranas baseadas em PD em sensores não enzimáticos, por exemplo, para detecção de albumina sérica bovina via quenching de fluorescência [10].

Nosso objetivo foi comparar duas técnicas comuns de deposição — voltametria cíclica e eletropolimerização a potencial constante — e identificar o protocolo ótimo para criar membranas de PPD em eletrodos de disco de platina.

Métodos

Materiais

Ácido ascórbico, cisteína, ácido úrico, dopamina, peróxido de hidrogênio, m-fenilenodiamina e HEPES foram adquiridos da Sigma‑Aldrich (EUA). Amostras de soro humano foram obtidas do Centro Científico e Prático Municipal de Nefrologia e Hemodiálise de Kiev (Ucrânia).

Projeto dos Transdutores Amperométricos

Eletrodos de disco de platina personalizados foram fabricados selando um fio de platina de 0,4 mm de diâmetro e 3 mm de comprimento em um capilar de vidro de 3,5 mm de diâmetro externo. A extremidade exposta do fio serviu como superfície de trabalho. A extremidade interna foi soldada a um fio de prata usando liga de Wood e conectada ao potenciostato. Antes do uso, os eletrodos foram limpos com HCl por 30 s, enxaguados com etanol e polidos com lixa P1500.

Métodos de Medição

Espectros de reflectância difusa UV‑vis foram registrados em espectrômetro Thermo Evolution 600 (200–900 nm) usando padrão Spectralon. Medidas eletroquímicas empregaram célula convencional de três eletrodos (trabalho, fio de platina auxiliar, referência Ag/AgCl) conectada a potenciostato PalmSens com multiplexador de 8 canais. Cronoamperometria foi realizada a 0,6 V vs. Ag/AgCl em HEPES 10 mM (pH 7,4) com célula de vidro de 3 mL sob agitação contínua. Concentrações de substrato foram preparadas por adição de alíquotas de soluções estoque (50 mM H₂O₂, 20 mM ácido ascórbico, 3 mM cisteína, 4,5 mM ácido úrico, 2,1 mM dopamina). Fenilenodiamina foi dissolvida em tampão fosfato 40 mM (pH 7,4). Voltametria cíclica usou faixa de 0–0,9 V a 20 mV s⁻¹, passos de 5 mV. Todos os experimentos foram triplicados; dados representam média ± DP (OriginPro 8.5).

Resultados e Discussão

Para avaliar o benefício de uma camada de PPD, primeiro avaliamos a sensibilidade e seletividade basal de eletrodos de platina nus em relação a peróxido de hidrogênio e interferentes comuns. Usando três níveis de concentração — (1) concentrações fisiológicas (soro), (2) diluição 20 vezes e (3) diluição 100 vezes —, observamos que dopamina e ácido ascórbico geraram os sinais mais fortes, enquanto cisteína produziu o mais fraco. Mesmo após diluição 100 vezes, as respostas dos interferentes permaneceram cerca de 20 % do sinal de H₂O₂, indicando que um eletrodo nu é insuficiente para amostras biológicas complexas.

Comparamos então duas estratégias de deposição. No método VC, o eletrodo foi submetido a varreduras de potencial sucessivas (CVA) em solução de PD 30 mM; cada CVA levou ~2 min. No método a potencial constante, o eletrodo foi mantido a +0,7 V por 40 min na mesma solução. A Tabela 3 mostra que membranas formadas por VC suprimiram significativamente os interferentes (especialmente cisteína) e aumentaram a sensibilidade para H₂O₂ em 2,6×, provavelmente devido à ativação da superfície de platina. A abordagem a potencial constante não melhorou a sensibilidade e exigiu tempo de deposição mais longo. Portanto, a VC é preferível por sua velocidade, seletividade e ganho de sensibilidade, apesar de sua limitação a um único eletrodo por varredura.

Análise espectroscópica confirmou a formação de PPD: o espectro de reflectância difusa do filme exibe bandas intensas a 222 nm e 315 nm (transições π→π* tipo monômero) e uma cauda larga de 400–800 nm indicativa de conjugação estendida no polímero.

Otimizamos o número de CVAs e a concentração de PD. Uma única CVA produziu membrana insuficiente; o aumento para três CVAs eliminou as respostas de dopamina e ácido úrico, mantendo a sensibilidade para H₂O₂. A redução de PD para 5 mM preservou a seletividade para amostras diluídas, mas comprometeu o desempenho com matrizes não diluídas. Concentração de 30 mM PD com três CVAs resultou em supressão completa de interferências e resposta aceitável de H₂O₂; concentrações maiores (>50 mM) engrossaram a membrana e reduziram a sensibilidade.

Testes de estabilidade revelaram que a membrana manteve sua seletividade durante 2 h de operação contínua, com leve melhora na resposta de H₂O₂ e maior supressão de interferentes — provavelmente devido ao entupimento dos poros por espécies maiores. Armazenamento a –18 °C por 8 dias aumentou a sensibilidade para H₂O₂ em 2,5× sem afetar a rejeição de interferentes, sugerindo que o inchamento lento da membrana melhora a permeabilidade.

Finalmente, a aplicação em amostras biológicas reais (soro e lisado neuronal) demonstrou que eletrodos não modificados produziram sinais ruidosos, enquanto eletrodos modificados com PPD mostraram respostas desprezíveis, confirmando sua adequação para matrizes complexas.

Conclusões

A eletropolimerização de polifenilenodiamina via voltametria cíclica oferece uma forma rápida e eficaz de criar membranas semipermeáveis que suprimem interferências em transdutores amperométricos de disco de platina. Três varreduras de VC em PD 30 mM eliminam completamente o impacto de interferentes comuns, enquanto 5 mM PD é adequado para amostras diluídas, preservando maior sensibilidade para H₂O₂. As membranas resultantes permanecem seletivas por pelo menos 2 h de operação e são estáveis após 8 dias de armazenamento congelado. Esses achados apoiam o uso de eletrodos modificados com PPD no projeto de biossensores confiáveis para fluidos biológicos complexos.