Óxido de grafeno hibridizado nHAC / PLGA Scaffolds facilitam a proliferação de células MC3T3-E1

Resumo

Os andaimes de biomateriais porosos biodegradáveis desempenham um papel crítico na regeneração óssea. Neste estudo, os andaimes compostos de nano-hidroxiapatita / colágeno / poli (ácido lático-co-glicólico) / óxido de grafeno (nHAC / PLGA / GO) contendo diferentes quantidades de GO foram fabricados pelo método de liofilização. Os resultados mostram que os scaffolds sintetizados possuem uma estrutura tridimensional porosa. GO melhora ligeiramente a hidrofilia dos andaimes e reforça sua resistência mecânica. O módulo de Young do andaime incorporado de GO de 1,5% em peso é muito aumentado em comparação com a amostra de controle. Os experimentos in vitro mostram que o nHAC / PLGA / GO (1,5% em peso) estrutura significativamente a adesão celular e a proliferação de células de osteoblastos (MC3T3-E1). O presente estudo indica que os scaffolds nHAC / PLGA / GO apresentam excelente citocompatibilidade e capacidade de regeneração óssea, portanto, apresentam alto potencial para serem utilizados como scaffolds na área de engenharia de tecidos ósseos.

Histórico

A engenharia de tecido ósseo combinando estruturas porosas tridimensionais e células ósseas tem sido amplamente estudada como uma abordagem atraente no tratamento de tecidos com defeito ou perda de tecido [1]. Os andaimes biodegradáveis, que imitam a natureza do osso, desempenham um papel importante para acomodar as células, controlando a adesão e proliferação celular e facilitando a regeneração óssea [2]. Até agora, vários métodos, incluindo eletrofiação, integração de projeto de topologia computacional (CTD) e fabricação de forma livre sólida (SFF) e liofilização foram aplicados para fabricar diferentes estruturas porosas tridimensionais (3D) [3,4,5 , 6,7]. Electrospinning é capaz de fazer andaimes nanofibrosos ou microfibrosos com estruturas complexas (alinhadas, fibras semelhantes a molas) e composições [7]. No entanto, a eficiência de produção dele é um pouco baixa. A integração de CTD e SFF permite o projeto de andaimes anatômicos 3D com arquitetura porosa e melhor propriedade mecânica. Mas este método requer um forte conhecimento profissional [4]. Comparado a esses dois métodos, o método de liofilização permite a fabricação de estruturas porosas com um processo muito mais simples pela sublimação da fase líquida congelada sob vácuo para fabricar uma estrutura porosa [8].

Os ossos naturais possuem arquitetura hierárquica complexa com dois componentes principais, colágeno e hidroxiapatita [9,10,11]. Na engenharia de tecido ósseo, a fabricação de uma biomimética ideal da matriz extracelular óssea acomodando-se à adesão e proliferação celular para o tratamento de disfunções ainda é um desafio [12]. Estruturas biodegradáveis à base de nano-hidroxiapatita / colágeno (nHAC) que imitam o osso natural podem fornecer melhor biocompatibilidade, afinidade celular e bioreabsorvibilidade [13]. No entanto, as desvantagens do colágeno, incluindo as propriedades mecânicas pobres e de rápida degradação, permanecem um obstáculo para sua aplicação na engenharia de tecido ósseo [14]. Polímeros alifáticos biodegradáveis, como ácido poli (lático-co-glicólico) (PLGA), com alta resistência mecânica, excelente biocompatibilidade, biodegradabilidade e boa solubilidade em solventes orgânicos, são materiais compensados ideais para a construção de andaimes porosos 3D para engenharia de tecido ósseo [15 , 16]. Um arcabouço poroso híbrido contendo colágeno e polímeros sintéticos combina as vantagens do colágeno e dos polímeros e supera suas fraquezas, que é amplamente utilizado para o reparo e regeneração óssea [17,18,19]. Por exemplo, Liao et al. desenvolveram uma estrutura óssea preparada por nHAC e poli (ácido lático) (PLA) para promover a regeneração óssea [17]. Niu et al. fabricaram estruturas compostas de nHAC / poli (ácido L-láctico) / quitosana para aumentar a proliferação de osteoblastos [19].

Recentemente, o óxido de grafeno (GO), uma nova folha de carbono com espessura de um átomo [20, 21], tem atraído grande interesse no campo biológico por possuir boa biocompatibilidade. Os scaffolds hibridizados GO são capazes de enriquecer tanto as propriedades mecânicas do scaffold quanto os comportamentos celulares, como propagação e proliferação celular [22, 23]. Luo et al. relataram que a incorporação de GO em nanofibras de PLGA aumentou a proliferação e a diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (MSCs) [20]. Jing et al. relataram que a adição de 1,0% em peso de GO ao poliuretano termoplástico poderia facilitar a proliferação de células de fibroblastos de camundongo suíço [24]. Comparado com a adição de agentes químicos de reticulação (genipina, glutaraldeído, carbodiimida, etc . ) [25, 26], que têm certa citotoxicidade, para melhorar a propriedade mecânica dos andaimes compostos, a pequena quantidade de andaimes hibridizados com GO mostram boa biocompatibilidade. Portanto, a hibridização do GO e do nHAC / PLGA poderia ser um novo arcabouço artificial para tecidos ósseos.

Neste estudo, os andaimes porosos de nano-hidroxiapatita / colágeno / poli (ácido lático-co-glicólico) / óxido de grafeno (nHAC / PLGA / GO), que contém diferentes proporções de peso de GO (0,0, 0,5, 1,0 e 1,5 em peso %) foram fabricados e caracterizados. Os andaimes de hibridização apresentam estruturas porosas. A adição de GO modifica a propriedade hidrofílica e a propriedade mecânica dos andaimes de hibridização. Para investigar o efeito do andaime nHAC / PLGA / GO na engenharia de tecido ósseo, as células MC3T3-E1 foram cultivadas nos andaimes de hibridização porosa. Os resultados mostram que os andaimes de hibridização dopados com GO de 1,5% em peso facilitam a adesão, crescimento e proliferação celular, indicando ainda que o andaime nHAC / PLGA / GO pode ser considerado um candidato promissor na engenharia de tecido ósseo.

Resultados e discussão

Estrutura dos andaimes compostos nHAC / PLGA / GO

A Figura 1 ilustra o processo de fabricação de andaimes nHAC / PLGA / GO. Os detalhes do processo de fabricação são mostrados na seção experimental. O nHAC foi sintetizado antes de fabricar os andaimes compostos nHAC / PLGA / GO. A imagem do microscópio eletrônico de varredura (SEM) do pó do nHAC mostra sua nanoestrutura. Os espectros de espectroscopia de raios-X de dispersão de energia (EDS) correspondentes de nHAC também são mostrados (Arquivo adicional 1:Figura S1), que revela a presença de Ca, Cu, P, C e O. Os sinais de cobre devem ser contribuições do amostras de apoio. Assim, o nHAC é composto por Ca, P, C, O, e a razão molar Ca:P do pó nHAC é 1,41, que é menor do que a da hidroxiapatita (HA) (1,66). Isso indica que o HA sintetizado é do tipo com deficiência de cálcio [27], o que levará à redução da dureza, módulo de elasticidade e tenacidade no nHAC. Para aumentar as propriedades mecânicas do andaime composto, o PLGA e o GO foram adicionados ao pó nHAC. A visão geral óptica dos andaimes nHAC / PLGA / GO fabricados com diferentes quantidades de GO é mostrada na Fig. 2a. A amostra é um cilindro com um diâmetro de 14 mm. É evidente que os andaimes compostos sem GO são na cor branca. Conforme o GO aumenta, os andaimes compostos tornam-se cada vez mais escuros. As morfologias detalhadas de diferentes andaimes nHAC / PLGA / GO são reveladas por SEM (Fig. 2b-e). Isso mostra significativamente que todos os andaimes formam estruturas porosas e as superfícies de quatro andaimes diferentes são bastante rugosas. A fim de caracterizar as informações desses furos, utilizamos um testador automático de área superficial e porosidade para avaliar. Os resultados da distribuição dos orifícios foram mostrados na Fig. 2f. O tamanho dos quatro orifícios do andaime está entre 0 e 200 nm. E o número de buracos que dezenas de nanômetros são maiores do que aqueles com algumas centenas de nanômetros em quatro andaimes. Foi relatado que a porosidade dos andaimes de biomateriais não é trivial para a formação óssea in vitro e in vivo [28]. Para otimizar a integração no tecido circundante, os suportes para a osteogênese devem imitar a morfologia, estrutura e função óssea [4]. Assim, a estrutura porosa 3D dos andaimes compostos nHAC / PLGA / GO é crítica para a regeneração óssea. As imagens SEM em grande escala dos quatro andaimes compostos também são mostradas (Arquivo adicional 1:Figura S2), que ilustra a visão geral das estruturas de diferentes superfícies.

Diagrama esquemático do processo de fabricação para andaimes nHAC / PLGA / GO

a Imagem ótica dos scaffolds nHAC / PLGA / GO sintetizados com diferentes quantidades de GO. b - e Imagens SEM de b nHAC / PLGA, c nHAC / PLGA / GO (0,5% em peso), d nHAC / PLGA / GO (1,0% em peso) e e andaimes nHAC / PLGA / GO (1,5% em peso). f Distribuição de orifícios de nHAC / PLGA / GO (0, 0,5, 1,0 e 1,5% em peso)

Caracterizações físico-químicas e mecânicas de andaimes compostos nHAC / PLGA / GO

O mecanismo do processo de síntese pode ser revelado pelos espectros de difração de raios-X (XRD) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) de várias substâncias únicas e compostos (Fig. 3). Conforme indicado na Fig. 3a, a fase inorgânica foi determinada como HA de acordo com o arquivo de difração de pó (cartão PDF nº 09–0432), uma vez que nenhum pico de outros materiais Ca-P estavam presentes no padrão de XRD. Em comparação com nHA, os picos de difração ampliados de nHAC implicaram em um pequeno tamanho de grão e baixa cristalinidade. Semelhante ao nHAC, o padrão de nHAC / PLGA / GO com diferentes quantidades de GO também apresentou baixa cristalinidade. No entanto, o pico de GO não apareceu nos compósitos nHAC / PLGA / GO, o que pode ser devido à pequena quantidade de GO em comparação com o bulk. A Figura 3b mostra os espectros FT-IR de várias substâncias únicas e compostos. Na Fig. 3b, as bandas típicas de colágeno podem ser observadas, como N – H alongamento em 3336 cm ⁻¹ para amida A; C – H alongamento em 3079 cm ⁻¹ para amida B; C =O alongamento em 1656 cm ⁻¹ para a amida I; Deformação N – H em 1548 cm ⁻¹ para a amida II e pico de absorção em 1238 cm ⁻¹ para amida III. Conforme a formação de nHAC, a amida A se move de 3336 cm ⁻¹ até cerca de 3411 cm ⁻¹ , a amida B foi enfraquecida, a amida I, amida II, amida III se moveram de 1656, 1548 e 1238 cm ⁻¹ a 1654, 1542 e 1240 cm ⁻¹ , respectivamente. Assim, confirma a reação química entre o colágeno e o AH. Além disso, os picos em 1033, 601 e 563 cm ⁻¹ são os picos típicos para (PO4) ³⁻ grupo, que indica a nova formação de HA no colágeno por causa do HA comercializado possuindo apenas picos característicos de (PO4) ³⁻ em 1033, 603 e 565 cm ⁻¹ . Os picos caracterizados de PLGA em torno de 2996 e 2944 cm ⁻¹ foram atribuídos a −CH ₂ , 1752 cm ⁻¹ foi atribuído a C =O, 1183 e 1093 cm ⁻¹ foram atribuídos a C – O, são vistos claramente. Comparado com o andaime PLGA, os picos do andaime nHAC / PLGA se movem de 1752 e 1183 cm ⁻¹ a 1760 e 1187 cm ⁻¹ , respectivamente, que demonstram a reação química entre o poder PLGA e nHAC. Comparado com o andaime nHAC / PLGA, os picos dos andaimes nHAC / PLGA dopados com GO mudaram de 1760 para 1762 cm ⁻¹ ; ocorreu um desvio para o vermelho que demonstra a reação química entre GO e nHAC / PLGA.

a XRD e b Espectros FT-IR de diferentes componentes

A nanoestrutura e as propriedades mecânicas dos andaimes nHAC / PLGA / GO com diferentes quantidades de GO foram caracterizadas por microscópio de força atômica nano-mecânica quantitativa (QNM-AFM) [29,30,31,32,33,34], que é capaz de fornecem a morfologia e a rigidez espontaneamente e é amplamente utilizado para detectar as propriedades mecânicas de vários materiais, incluindo osso [30], dentes [35], córnea [36], etc. A Figura 4a-d mostra a tomografia de quatro tipos de compósito andaimes. Devido à limitação das áreas de digitalização, as imagens AFM mostram apenas a estrutura da superfície local. Assim, a estrutura porosa não é óbvia. No entanto, as imagens AFM também mostram a morfologia da superfície rugosa semelhante às imagens SEM. A rugosidade tem um efeito importante na proliferação e diferenciação celular. A superfície com superfície rugosa foi benéfica para a proliferação e diferenciação celular [37,38,39]. Os perfis de linha (Fig. 4e-h) derivados da morfologia (Fig. 4a-d) mostram as diferenças máximas de altura por si só, diferentes direções de linha. É claramente mostrado que as diferenças máximas de altura variam de ~ 200 a ~ 600 nm. A distribuição de rigidez correspondente (Fig. 4i) mostra o módulo de Young de quatro andaimes diferentes são 7,53 ± 1,25, 8,34 ± 1,00, 9,15 ± 0,85 e 10,20 ± 1,28 GPa, respectivamente. Para mostrar claramente as diferenças de rigidez, o gráfico de barras correspondente também é fornecido (Fig. 4j). Embora o módulo de Young dos andaimes nHAC / PLGA / GO com uma pequena diferença de quantidade de GO não sejam significativamente diferentes, por exemplo, o nHAC / PLGA / GO com a quantidade de GO de 0,0 e 0,5% em peso (7,53 ± 1,25 e 8,34 ± 1,00 GPa), de 0,5 e 1,0% em peso (8,34 ± 1,00 e 9,15 ± 0,85 GPa), de 1,0 e 1,5% em peso (9,15 ± 0,85 e 10,20 ± 1,28 GPa), o módulo de Young dos andaimes nHAC / PLGA / GO com um A diferença de quantidade de GO de bits grandes (0,0% em peso e 1,5% em peso) são significativamente diferentes (7,53 ± 1,25 e 10,20 ± 1,28 GPa). Isso indica que a propriedade mecânica do andaime nHAC / PLGA / GO aumenta com o aumento da quantidade de GO.

Imagens AFM de a nHAC / PLGA, b nHAC / PLGA / GO (0,5% em peso), c nHAC / PLGA / GO (1,0% em peso) e d andaimes nHAC / PLGA / GO (1,5% em peso). e - h Perfis de linha derivados das imagens morfológicas. eu Distribuição de rigidez dos quatro andaimes diferentes medidos por QNM-AFM. j O gráfico de barras do módulo de Young versus a quantidade de GO. k Os ângulos de contato correspondentes de quatro tipos de andaimes medidos pelo método da gota séssil

A hidrofilicidade dos andaimes desempenha um papel fundamental na interação com as células. A adição de GO não só aumenta a propriedade mecânica dos andaimes compostos, mas também altera a hidrofobicidade de quatro tipos de andaimes. A Figura 4f mostra os ângulos de contato de diferentes andaimes nHAC / PLGA / GO. Os ângulos de contato dos andaimes nHAC / PLGA eram ~ 125,1 °, enquanto para nHAC / PLGA / GO com diferentes quantidades de GO (0,5. 1,0 e 1,5% em peso) são ~ 113,4 °, ~ 103,4 ° e ~ 101,4 °, respectivamente. Conforme o aumento da quantidade de GO, os ângulos de contato dos andaimes compostos diminuem ligeiramente por causa dos grupos hidroxila e dos grupos carregados negativamente, como grupos de ácido carboxílico na superfície do GO [40]. Assim, GO pode fornecer bioatividade notável para andaimes 3D nHAC / PLGA.

Em geral, scaffolds para engenharia de tecidos não requerem apenas a exibição de morfologia e propriedades biocompatíveis, mas também estrutura porosa e força física [41]. Os andaimes 3D nHAC / PLGA / GO liofilizados possuem estrutura porosa devido à sublimação do solvente. Os grupos funcionais, incluindo espécies de hidroxila (OH), epóxi (C-O-C) e carboxila (COOH) em superfícies de andaimes [40] induzem boa hidrofilicidade. A adição de PLGA e GO fornece força física suficiente. Assim, os andaimes 3D nHAC / PLGA / GO podem ser um candidato promissor para a engenharia de tecidos.

Cultura de células

É bem sabido que os scaffolds usados para o tecido ósseo devem ser biocompatíveis, proliferativos celulares e exclusivos da resposta imune [21]. O nHAC / PLGA / GO, que contém os componentes do osso natural (colágeno e HA) e possui propriedades mecânicas e hidrofilicidade adequadas, deve ser um candidato ideal para a engenharia de tecido ósseo. Para investigar a proliferação celular desses scaffolds, as células de osteoblastos MC3T3-E1 foram cultivadas neste trabalho. A Figura 5 mostra a viabilidade celular em função do tempo de cultura avaliada pelo ensaio do kit-8 de contagem de células (CCK-8). A proliferação de células aumentou consistentemente durante todo o período de cultura para todos os grupos. Mais especificamente, a proliferação celular de MC3T3-E1 em andaimes nHAC / PLGA / GO (0,5 e 1,0% em peso) é significativamente diminuída no dia 1, enquanto que nos andaimes nHAC / PLGA / GO (1,5% em peso) é semelhante àquela em andaimes nHAC / PLGA. Conforme o tempo aumenta, a proliferação celular de MC3T3-E1 em nHAC / PLGA / GO (1,5% em peso) aumenta significativamente nos dias 3, 5 e 7. No entanto, a proliferação celular de MC3T3-E1 em nHAC / PLGA / GO (0,5 e 1,0% em peso) os andaimes não são significativamente diferentes em comparação com os andaimes nHAC / PLGA.

Comparação das células MC3T3-E1 em diferentes superfícies de andaimes; asteriscos duplos indicam p <0,01, número de amostras N =4

A evidência de crescimento celular, proliferação em diferentes suportes também foi capturada por SEM. A Figura 6 mostra a morfologia da superfície de células de osteoblastos em quatro estruturas diferentes após serem cultivadas por 1, 3, 5, 7 dias, respectivamente. No dia 1, todas as células são uniformemente e isoladas distribuídas em quatro suportes diferentes. Com o passar do tempo (dias 3, 5 e 7), todos os grupos de células cresceram, proliferaram e começaram a se integrar em diferentes suportes, formando uma grande camada de células. Em comparação com as morfologias celulares em diferentes suportes, as células nas superfícies dos suportes nHAC / PLGA / GO eram muito maiores e esticadas do que na superfície dos suportes nHAC / PLGA. Não há diferença significativa na situação de disseminação das células, adesão entre as células no nHAC / PLGA / GO com quantidades diferentes (0,5, 1,0 e 1,5% em peso) de acordo com as imagens do MEV.

a - p Imagens SEM de células MC3T3-E1 cultivadas em quatro suportes diferentes por 1, 3, 5 e 7 dias. As barras de escala são de 50 μm em todas as imagens. O asterisco branco representa as células osteoblásticas MC3T3-E1

Teste de Citotoxicidade

A citotoxicidade do GO é uma preocupação essencial, para sua aplicação no campo da biologia. Assim, avaliamos a citotoxicidade dos quatro scaffolds no tempo de 24 h. Os resultados foram mostrados na Fig. 7. A vitalidade celular de células de fibroblastos (NIH-3T3) em nHAC / PLGA contém 0,5,1, e 1,5% de GO é 99,101,11, e 97,86% está relacionado a nHAC / PLGA, que não têm diferença significativa do que nHAC / PLGA, indicando que o aumento no óxido de grafeno é seguro em 0-1,5%.

A atividade relativa de células HIH-373 em nHAC / PLGA (0,5, 1, 1,5% em peso) está relacionada a nHAC / PLGA

A Tabela 1 resumiu as propriedades mecânicas e propriedades de cultura de células de quatro tipos de andaimes compostos. Conforme o aumento do GO, o módulo de Young dos andaimes aumenta de acordo. No entanto, apenas as propriedades mecânicas de nHAC / PLGA e nHAC / PLGA / GO (1,5% em peso) são distintamente diferentes. A viabilidade celular de quatro tipos de scaffolds mostra a mesma tendência com a propriedade mecânica, ou seja, os valores de DO de todos os grupos aumentam com o aumento do tempo de cultivo celular, mas apenas o nHAC / PLGA e nHAC / PLGA / GO (1,5 em peso %) os grupos mostram diferença significativa. Isso indica que a propriedade mecânica dos andaimes está intimamente relacionada à propriedade da cultura de células. Os resultados podem ser porque as células do tecido podem sentir e responder à rigidez de seus substratos [42,43,44,45]. O ajuste das propriedades mecânicas dos substratos pode promover respostas celulares que afetam as interações da superfície celular junto com o crescimento e a viabilidade celular [46,47,48,49]. Haugh et al. descobriram que a rigidez dos andaimes aumentou a atividade das células MC3T3-E1 (proliferação e migração celular) [50]. Engler et al. demonstraram que um fator físico importante na resposta de muitos tipos de células era a rigidez do substrato [51]. Eles descobriram que as células do músculo liso derivam da aorta de rato (linha A7R5), como outras células dependentes de ancoragem, espalham mais e organizam seu citoesqueleto e aderências focais muito mais em substratos "rígidos" do que em substratos "moles". A propriedade mecânica não afeta apenas o comportamento das células, mas também as atividades dos tecidos. Duncan et al. estudaram a mecanotransdução e a tensão mecânica da resposta funcional no osso. Eles descobriram que a carga mecânica pode inibir a reabsorção óssea e aumentar a formação óssea in vivo [52]. Portanto, os scaffolds nHAC / PLGA / GO mais rígidos (1,5% em peso) poderiam promover a proliferação de células MC3T3-E1.

A citotoxicidade do GO é uma preocupação essencial para sua aplicação no campo da biologia. Até agora, surgiram dois argumentos. Uma alegação de que o GO induzia citotoxicidade e seu efeito depende da concentração. Por exemplo, Chatterjee, et al. relataram a resposta tóxica com dependência de dose diferencial para GO [53]. Pinto, et al. relataram que apenas baixas concentrações de GO podem ser incorporadas com segurança no PLA para facilitar a adesão e proliferação celular [6]. Os demais afirmam que uma quantidade ainda maior de GO teria boa biocompatibilidade e potencializaria tanto as propriedades mecânicas dos substratos quanto o comportamento celular. Shin, et al. estudaram os mioblastos esqueléticos C2C12 foram aprimorados em matrizes híbridas de colágeno PLGA-GO do que em matrizes de colágeno PLGA, PLGA [54]. E Luo, et al. relataram que os scaffolds de nanofibras de PLGA dopados com GO podem aumentar a diferenciação osteogênica de MSCs [22]. Neste estudo, o GO foi selecionado com base no primeiro argumento. A quantidade limitada é adicionada aos andaimes compostos para não citotoxicidade e propriedades mecânicas aprimoradas. A conjugação de GO em estruturas de nHAC / PLGA aumentou significativamente o crescimento e a proliferação celular. Embora o número de células em nHAC / PLGA e nHAC / PLGA com pequena quantidade de GO, por exemplo, nHAC / PLGA / GO (0,5% em peso), seja mais ou menos o mesmo, o número de células em nHAC / PLGA / GO (1,5% em peso) o andaime foi maior do que nos andaimes nHAC / PLGA. Estes resultados indicam que os andaimes nHAC / PLGA / GO são biofuncionais com a capacidade de aumentar o crescimento e a proliferação de células MC3T3-E1. Portanto, a excelente biocompatibilidade e biofuncionalidade permitem que o nHAC / PLGA / GO seja empregado como andaimes eficazes para a regeneração óssea.

A natureza do biomaterial e o processo de fabricação são muito importantes para as propriedades do andaime [28]. Até agora, os biomateriais foram extensivamente estudados, incluindo metais [55], cerâmicas [56], vidro [57], polímeros sintetizados quimicamente [58], polímeros naturais [59] e combinações desses materiais para formar compósitos [60] . A alteração de componentes de andaimes compostos induzirá a propriedade de andaimes. Por exemplo, para fabricar a estrutura biomímica do osso natural, o colágeno tipo I foi usado neste estudo. Atualmente, a família do colágeno inclui mais de 20 tipos diferentes de colágeno existentes na pele, osso, cartilagem, etc. Substituindo o colágeno tipo I por outros tipos, é possível fabricar diferentes suportes compostos para diferentes fins. Por exemplo, o colágeno tipo II é um dos colágenos formadores de fibrilas e o tipo de colágeno predominante na cartilagem. A coordenação do colágeno tipo II nas estruturas pode ser capaz de facilitar a regeneração óssea da cartilagem [61]. Além disso, o colágeno com recozimento adequado pode fortalecer ainda mais os andaimes, o que pode induzir um novo material compósito com estruturas funcionais. Além da natureza dos biomateriais, o processamento também determina o funcionamento dos scaffolds, como diferentes métodos de processamento. A química e o processamento do material determinam as propriedades funcionais máximas, bem como a forma como as células interagem com o andaime. Os scaffolds de propriedades e requisitos na engenharia de tecido ósseo foram extensivamente investigados, incluindo degradação [62], propriedades mecânicas [63], liberação de citocinas [64] e combinações de scaffolds e células [65].

Conclusões

Em resumo, scaffolds nHAC / PLGA / GO com diferentes quantidades de GO (0,0, 0,5, 1,0 e 1,5% em peso) foram fabricados pelo método de liofilização. Os andaimes fabricados nHAC / PLGA / GO apresentam estrutura porosa. Além disso, a propriedade mecânica e a hidrofilicidade dos andaimes são aumentadas por causa da adição de PLGA e GO. O estudo in vitro mostra que os andaimes porosos facilitam a adsorção, o crescimento e a proliferação celular. Esses scaffolds nHAC / PLGA / GO podem ser candidatos promissores para aplicações em tecido ósseo.

Métodos

Materiais

O colágeno tipo 1 liofilizado purificado foi obtido de Tianjin Saining Biological Engineering Technology Co., Ltd. PLGA com proporção de lactídeo:glicolídeo de 75:25 e Mw de 95.000 g / mol foi adquirido de Shandong Medical Appliance Factory (China). GO foi adquirido da Shanghai Aladdin bioquímica Polytron Technologies Inc. As células de osteoblastos MC3T3-E1 foram fornecidas pelo banco de células da Shanghai Chinese Academy of Sciences. Soro fetal bovino (FBS), antibiótico-antimicótico, CCK-8 e meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) foram acessados de Tianjin Nobuo Letter Technology Co., Ltd. 1,4-dioxano, solução salina tamponada com fosfato (PBS, 0,1 M, PH 7,4), e todos os outros produtos químicos eram de grau analítico e usados como recebidos sem purificação adicional.

Preparação do nHAC Power e dos andaimes compostos nHAC / PLGA / GO

O método de composição do pó nHAC foi relatado anteriormente [66,67,68]. Resumidamente, o colágeno foi dissolvido em ácido acético (0,5 mol / L) formando uma solução com a concentração de 4 g / L. O CaCl ₂ e H ₃ PO ₄ (Ca / P =1,66) as soluções foram então adicionadas separadamente por gotas. A taxa de queda é de 100 gotas por minuto. A solução foi suavemente agitada e titulada a 37 ° C com solução de amônia para pH 9. Após 24 h, a deposição de nHAC foi colhida por centrifugação e liofilização. Para a preparação de andaimes de compósito nHAC / PLGA / GO, o GO foi uniformemente disperso em dioxano usando um triturador de células ultrassônico, formando uma concentração final de 0,0, 0,5, 1,0 e 1,5 g / L, respectivamente. O PLGA foi então adicionado às soluções de GO, formando uma concentração final de 10% (m / v). As soluções GO / PLGA foram então agitadas suavemente à temperatura ambiente durante 12 h. A solução final foi formada adicionando a potência nHAC à solução GO / PLGA a uma razão de peso nHAC:PLGA de 1:1. A solução nHAC / PLGA / GO formada foi então agitada e submetida a ultrassom por 4 h. Depois de congelados a -20 ° C durante a noite, as estruturas compostas nHAC / PLGA / GO foram obtidas por liofilização para remover dioxano.

Caracterizações

Os andaimes compostos foram revestidos com ouro e foram observados em MEV (JSM-7100F). Pulverizamos ouro por 20 s para a preparação de amostras de microscopia eletrônica. A topografia e as propriedades mecânicas das matrizes foram caracterizadas por microscopia de força atômica (AFM, Multimode VIII, Bruker, Alemanha) no ar. A análise de imagem foi realizada usando Gwyddion and Nanoscope Analysis Software. A análise da composição dos andaimes compostos nHAC / PLGA / GO foi realizada por um espectrofotômetro FT-IR (VECTOR22, Bruker, Alemanha). Todos os espectros foram registrados no modo de absorção na faixa de comprimento de onda de 1000–2200 cm ⁻¹ com uma resolução de 4,0 cm ⁻¹ e varredura de 16 vezes. Os ângulos de contato das amostras foram medidos por meio de um sistema de medição de ângulos de contato pelo método da gota séssil (EasyDrop, modelo DAS30, Kruss, Alemanha). Os padrões de XRD foram medidos usando o difratômetro de raios-X (D8 DISCOVER). A radiação Cu-Kα (λ =0,154 nm) é de 40 kV e 30 mA. A taxa de varredura das medições é de 8 ° min ⁻¹ na faixa 2θ de 5–80 ° em RT. A porosidade dos scaffolds foi medida por um analisador automático de área superficial e porosidade (ASAP 2460, Micromeritics, GA, USA).

Cultura de células

Células de osteoblastos MC3T3-E1 foram incubadas em DMEM suplementado com 10% de FBS e solução de antibiótico-antimicótico a 3% a 37 ° C e 5% de CO ₂ em uma incubadora de células. A fixação inicial e a proliferação foram testadas usando CCK-8 de acordo com as instruções do fabricante, em que o número de células viáveis foi diretamente proporcional aos produtos da reação metabólica obtidos no ensaio de CCK-8 [69]. Resumidamente, as células de osteoblastos MC3T3-E1 foram semeadas a uma densidade de 2,5 × 10 ⁴ células por poço nas matrizes nHAC / PLGA, nHAC / PLGA / GO (0,5% em peso), nHAC / PLGA / GO (1,0% em peso) e nHAC / PLGA / GO (1,5% em peso) incorporadas em cultura de células de 48 poços placa. As células foram incubadas com a solução de CCK-8 nas últimas 2 h dos períodos de cultivo (1, 3, 5 e 7 dias) para a proliferação a 37 ° C no escuro. A absorbância foi medida no comprimento de onda de 450 nm usando um leitor de ELISA (DNM-9602).

As amostras de células para medição em MEV foram fixadas com formaldeído, e as amostras foram então desidratadas através de uma série graduada de etanol (30, 50, 75, 95 e 100%) por 15 min em cada concentração. Em seguida, as amostras foram secadas por ponto crítico, permitindo-se que a secagem ocorresse com analisador de dióxido de carbono (Hitachi, HCP-2). Por fim, as amostras com recobrimento de ouro foram observadas em MEV.

Teste de citotoxicidade

A concentração de células de fibroblastos foi ajustada para 1 × 10 ⁴ /ml and was inoculated into 96-well plates at 200 ul per well. Then, the well plates were incubated at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for 24 h. The samples (nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%), nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) and nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%)) were powdered to make a 100 mg/ml suspension. The experiment group with 100 ul suspension and control group with equal volume of DMEM complete medium were incubated for 24 h and were further incubated for 4 h after the CCK-8 was added to the incubator. The cell viability was obtained by measuring the absorbance at the wavelength of 450 nm using an ELISA reader. The cell viability was calculated by using the following formula,
$$ \mathrm{Cell}\ \mathrm{viability}\ \left(\%\right)=\left[\mathrm{A}\ \left(\mathrm{experiment}\right)-\mathrm{A}\ \left(\mathrm{blank}\right)\right]/\left[\mathrm{A}\ \left(\mathrm{control}\right)-\mathrm{A}\ \left(\mathrm{blank}\right)\right]\times 100\% $$
Where A (experiment) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution and power samples solution; A (blank) represents absorbance of wells with medium and CCK-8 solution without cells and A (control) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution without power samples solution.

Análise estatística

Quantitative results were expressed as the mean value from at least triplicate samples ± standard deviation (SD). Student’s t test was used to the statistical analysis. A value of p < 0.05 was considered statistically significant. Data are marked ** to indicate p < <0.01.

Abreviações

3D:: Three-dimensional
AFM:: Força atômica microscópica
CCK-8:: Cell counting kit-8
CTD:: Computational topology design
DMEM:: Dulbecco’s modified Eagle media
EDS:: X-ray spectroscopy
FBS:: Fetal bovine serum
FT-IR:: Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
GO:: Graphene oxide
HA:: Hydroxyapatite
MC3T3-E1:: Osteoblast cells
MSCs:: Mesenchymal stem cells
nHAC:: Nano-hydroxyapatite/collagen
NIH-3T3:: Fibroblast cells
PBS:: Phosphate-buffered saline
PLA:: Poly(lactic acid)
PLGA:: poly(lactic-co-glycolic acid)
QNM-AFM:: Quantitative nano-mechanical atomic force microscope
SD:: Standard deviation
SEM:: Microscópio eletrônico de varredura
SFF:: Olid free-form fabrication
XRD:: Difração de raios X

Nanopetais de óxido de níquel mesoporoso (NiO) para detecção ultrassensível de glicose Síntese fácil de óxido de estanho mesoporoso semelhante a buraco de minhoca via auto-montagem induzida por evaporação e propriedades aprimoradas de detecção de gás

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias