Andaimes nHAC/PLGA Integrados com Óxido de Grafeno Promovem Proliferação de Osteoblastos e Regeneração Óssea

Resumo

Andaimes porosos biodegradáveis são centrais na engenharia de tecido ósseo. Neste estudo, nano-hidroxiapatita/colágeno (nHAC) misturado com poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) e quantidades variadas de óxido de grafeno (GO) foram fabricados por liofilização. Os compósitos resultantes exibiram rede de poros tridimensional contínua. GO aumentou ligeiramente a hidrofilicidade e aumentou significativamente o módulo de Young, com amostra de 1,5% em peso GO atingindo 10,20 ± 1,28 GPa comparado a 7,53 ± 1,25 GPa para andaime sem GO. In vitro, osteoblastos MC3T3-E1 exibiram adesão e proliferação marcadamente maiores no andaime de 1,5% GO, confirmado por ensaios CCK-8 e imagem SEM. Estes achados demonstram que andaimes nHAC/PLGA/GO combinam excelente citocompatibilidade com desempenho mecânico superior, posicionando-os como candidatos promissores para aplicações de regeneração óssea.

Introdução

Andaimes porosos tridimensionais que emulam a matriz extracelular óssea são essenciais para reparo ósseo bem-sucedido. Técnicas convencionais de fabricação — eletrofiação, design topológico computacional (CTD) combinado com fabricação livre de forma sólida (SFF), e liofilização — oferecem graus variados de controle estrutural e escalabilidade. A liofilização, em particular, fornece rota direta para gerar poros altamente interconectados por sublimação de solvente congelado sob vácuo.

Osso nativo consiste em montagem hierárquica de colágeno e hidroxiapatita (HA). Compósitos nano-hidroxiapatita/colágeno (nHAC) imitam esta arquitetura natural, entregando biocompatibilidade e biorreabsorvabilidade favoráveis. No entanto, a fragilidade intrínseca do colágeno e degradação rápida limitam seu uso. Poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) introduz robustez mecânica e taxas de degradação ajustáveis, enquanto GO oferece propriedades físico-químicas únicas — alta área de superfície, reforço mecânico e grupos funcionais que podem modular comportamento celular.

Trabalhos prévios mostraram que andaimes aprimorados com GO melhoram diferenciação osteogênica e proliferação celular. Aqui, avaliamos sistematicamente como carga incremental de GO (0,0, 0,5, 1,0 e 1,5% em peso) afeta desempenho estrutural, mecânico, hidrofílico e biológico de compósitos nHAC/PLGA.

Resultados e Discussão

Estrutura de Andaimes Compósitos nHAC/PLGA/GO

O processo de fabricação envolveu dissolução de colágeno tipo I em ácido acético, co-precipitação de íons Ca e P para formar nHAC, mistura com PLGA e GO disperso, seguida por liofilização. Microscopia eletrônica de varredura (SEM) revelou arquitetura altamente porosa com poros interconectados variando de 0 a 200 nm. A distribuição de poros foi quantificada por analisador automático de área de superfície, confirmando predominância de poros sub-100 nm, faixa de tamanho propícia à infiltração de osteoblastos.

Caracterização Físico-Química e Mecânica

Difração de raios X em pó (XRD) confirmou presença de HA hexagonal; sinais de GO não discerníveis devido à sua baixa carga. Espectros FT-IR exibiram bandas amida características do colágeno e picos de fosfato, com deslocamentos sutis indicando interação química entre colágeno, HA, PLGA e GO.

Medidas nano-mecânicas quantitativas por AFM (QNM-AFM) revelaram aumento monótono do módulo de Young com teor de GO: 7,53 ± 1,25 GPa (0%), 8,34 ± 1,00 GPa (0,5%), 9,15 ± 0,85 GPa (1,0%) e 10,20 ± 1,28 GPa (1,5%). O andaime de 1,5% GO exibiu vantagem de rigidez estatisticamente significativa sobre o sem GO, refletindo efeito reforçador do GO.

Medidas de ângulo de contato mostraram diminuição gradual de 125,1° (sem GO) para 101,4° (1,5%), indicando molhabilidade superficial melhorada devido aos grupos funcionais hidrofílicos do GO.

Cultura Celular e Citotoxicidade

Osteoblastos MC3T3-E1 semeados nos andaimes exibiram atividade metabólica crescente ao longo de 7 dias (ensaio CCK-8). Embora proliferação inicial nos andaimes de 0,5% e 1,0% GO fosse ligeiramente menor que controle sem GO, o andaime de 1,5% GO igualou e superou o controle nos dias 3, 5 e 7. Imagens SEM confirmaram espalhamento celular extenso e formação de rede, com células nos andaimes com GO exibindo morfologias maiores e mais achatadas.

Fibroblastos NIH-3T3 expostos a suspensões de andaimes por 24 h não mostraram citotoxicidade significativa; viabilidade permaneceu acima de 97% em todas as cargas de GO, afirmindo biocompatibilidade dos compósitos.

Conclusões

A liofilização permitiu fabricação de andaimes nHAC/PLGA/GO com porosidade interconectada, rigidez mecânica aprimorada e hidrofilicidade melhorada. O andaime de 1,5% GO demonstrou adesão e proliferação superiores de osteoblastos mantendo excelente citocompatibilidade, sublinhando seu potencial como andaime de engenharia de tecido ósseo.

Métodos

Materiais

Colágeno tipo I, PLGA (75:25, Mw = 95 kDa), GO e reagentes de cultura celular foram obtidos de fornecedores estabelecidos. Osteoblastos MC3T3-E1 e fibroblastos NIH-3T3 de bancos de células respeitáveis.

Preparação do Andaime

Colágeno dissolvido em ácido acético 0,5 M (4 g L⁻¹). Soluções de cálcio e fosfato (Ca/P = 1,66) adicionadas gota a gota a 100 gotas min⁻¹, agitadas e tituladas a pH 9 com amônia a 37 °C. Após 24 h, precipitado coletado, liofilizado e moído para produzir pó nHAC.

GO disperso em dioxano (0,0, 0,5, 1,0, 1,5 g L⁻¹) via ultrassonicação, misturado com PLGA (10% m/v) e agitado 12 h. nHAC adicionado na razão 1:1 em peso para PLGA, seguido por 4 h ultrassonicação. Mistura congelada a –20 °C durante noite e liofilizada para obter andaimes finais.

Caracterização

SEM, AFM (modo QNM), FT-IR, XRD, ângulo de contato e medidas de porosidade conduzidas usando protocolos padrão. Todos dados coletados em triplicata.

Cultura Celular e Ensaios

Células MC3T3-E1 semeadas a 2,5 × 10⁴ células mL⁻¹ em discos de andaime e cultivadas em DMEM +10% FBS +3% antibióticos a 37 °C, 5% CO₂. Proliferação avaliada por CCK-8 nos dias 1, 3, 5 e 7. Para SEM, células fixadas com 4% paraformaldeído, desidratadas, secas em ponto crítico e metalizadas com ouro.

Teste Citotoxicidade

Células NIH-3T3 expostas a 100 mg mL⁻¹ suspensões de andaime por 24 h, seguido por ensaio CCK-8. Viabilidade celular calculada relativa a culturas controle.

Análise Estatística

Dados expressos como média ± DP. Teste t de Student aplicado; p < 0,05 considerado significativo.