Nanopartículas Luminescentes Persistentes no Infravermelho Próximo Co-dopadas Cr³⁺/Eu³⁺ de Longa Duração para Imageamento Celular Avançado

Resumo

Nanopartículas luminescentes persistentes emissoras no infravermelho próximo (NIR) foram desenvolvidas como agentes potenciais para bioimageamento. No entanto, sintetizar nanopartículas uniformes com afterglow longo para imageamento de longo prazo é carente. Aqui, demonstramos síntese de nanopartículas de estrutura espinélio Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺ (ZGGO:Cr³⁺) e Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺,Eu³⁺ (ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺) por método sol-gel em combinação com calcinação subsequente livre de atmosfera redutora. Amostras foram investigadas via caracterizações detalhadas por técnicas combinadas de DRX, MET, STEM, difração de elétrons de área selecionada, espectroscopia de fotoluminescência de excitação (PLE)/fotoluminescência (PL), e análise de PL dependente de temperatura. Nanopartículas monocristalinas são solução sólida homogênea, possuindo forma cúbica uniforme e tamanho lateral de ~80-100 nm. Sob excitação UV a 273 nm, ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ exibiu banda de emissão NIR a 697 nm (transição ²E → ⁴A₂ de íons Cr³⁺ distorcidos em galogermanato), na ausência de emissão de Eu³⁺. Luminescência persistente NIR da amostra pode durar mais de 7200 s e ainda manter intensidade intensa. Incorporação de Eu³⁺ aumentou intensidade de luminescência persistente e tempo de afterglow de ZGGO:Cr³⁺, mas não afetou significativamente a estabilidade térmica. Nanopartículas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ obtidas possuíram excelente capacidade de imageamento para células in vitro.

Introdução

Materiais luminescentes persistentes podem emitir por longo tempo até horas após cessação da excitação. Principalmente devido a seus grandes interesses de pesquisa, fosfóres foram comercializados como materiais de visão noturna ou ambientes escuros para ampla gama de aplicações como sinais de segurança, sinalização de rotas de emergência, marcadores de identificação, ou diagnósticos médicos. Fosfóres persistentes de longa duração típicos são emissores de cor primária comercializados, como vermelho Y₂O₂S:Eu³⁺,Mg²⁺,Ti⁴⁺ ou CaS:Eu²⁺,Tm³⁺,Ce³⁺, verde SrAl₂O₄:Eu²⁺,Dy³⁺ ou MgAl₂O₄:Mn²⁺, e azul CaAl₂O₄:Eu²⁺,Nd³⁺ ou SrMgSi₂O₆:Eu²⁺,Dy³⁺. Embora muitos sucessos tenham sido feitos em fosfóres persistentes visíveis, investigação e desenvolvimento de fosfóres persistentes na região do infravermelho próximo (NIR) (~700-2500 nm) são insuficientes. Nos últimos anos, aplicações potenciais de fosfóres persistentes mostrando luminescência vermelha ou NIR expandiram de sinais de segurança de visão noturna para sistemas de bioimageamento in vivo.

Materiais luminescentes persistentes com fotossensibilizadores anexados como agente in vivo foram primeiramente tentados por Chen e Zhang para terapia fotodinâmica. Então, Scherman et al. relataram trabalho marco em bioimageamento in vivo com fosfóro emissor NIR de Ca₀,₂Zn₀,₉Mg₀,₉Si₂O₆:Eu²⁺,Mn²⁺,Dy³⁺. Logo após, dois novos fosfóres emissores NIR de CaMgSi₂O₆:Eu²⁺,Mn²⁺,Pr³⁺ e Ca₂Si₅N₈:Eu²⁺,Tm³⁺ com desempenho melhorado foram desenvolvidos pelo mesmo grupo. Recentemente, fosfóres persistentes dopados Cr³⁺ de galato com emissão NIR e afterglow longo, incluindo espinélio ZnGa₂O₄:Cr³⁺ e suas variantes, como Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺, Zn₃Ga₂GeO₈:Cr³⁺,Yb³⁺,Er³⁺, e ZnGa₂₋ₓ(Ge/Sn)ₓO₄:Cr³⁺, foram preparados por método de estado sólido. Amostras de disco cerâmico exibiram tempo de afterglow até 360 h na região NIR, mas materiais volumosos são inadequados para bioimageamento in vivo. Nanopartículas luminescentes persistentes emissoras NIR de ZnGa₂O₄:Cr³⁺, ZnGa₂O₄:Cr³⁺,Sn⁴⁺, e Zn₂,₉₄Ga₁,₉₆Ge₂O₁₀:Cr³⁺,Pr³⁺ foram sintetizadas por método sol-gel em combinação com calcinação subsequente livre de atmosfera redutora. A luminescência persistente do pó de nanopartículas exibe brilhante luminescência NIR na janela de transparência biológica com tempo de afterglow superlongo. PEGilação melhora grandemente biocompatibilidade e solubilidade em água das nanopartículas, que mantêm grande potencial para aplicação de bioimageamento in vivo de longo prazo com alto SNR sem necessidade de excitação in situ. Acredita-se que íons selecionados de grupo consistindo de íons terra alcalina, íons lantânidos, e Li⁺ co-dopagem com Cr³⁺ em galato de zinco e galogermanato de zinco resultariam em notável luminescência persistente NIR. Eu³⁺ em hospedeiros óxido sempre exibe emissão vermelha a ~700 nm surgindo da transição intra-4f ⁵D₀-⁷F₄ sob excitação UV curta na banda de transferência de carga (CT) a 250 nm. Por outro lado, Cr³⁺ é centro luminescente favorável em sólidos devido às suas emissões de banda estreita (geralmente a 700 nm) devido à transição spin-proibida ²E-⁴A₂, ou emissão de banda larga (650-1600 nm) devido à transição spin-permitida ⁴T₂-⁴A₂. Em vista disto, co-dopagem Cr³⁺/Eu³⁺ em galato de zinco e galogermanato de zinco resultaria em intensa luminescência persistente NIR, devido a que banda de transferência de carga (CTB) de O²⁻-Eu³⁺ sobrepõe com CTB de O²⁻-Ga³⁺, e emissão a ~700 nm de transição ⁵D₀-⁷F₄ de Eu³⁺ sobrepõe com a de transição ²E-⁴A₂ de Cr³⁺. Além disso, íons Eu³⁺ substituindo íons Ga³⁺ em sítios octaédricos distorcidos podem produzir força de campo cristalino adequada ao redor de íons Cr³⁺, afetando assim emissão NIR. Neste trabalho, nanopartículas Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺,Eu³⁺ (termedas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺) foram sintetizadas por método sol-gel em combinação com calcinação subsequente livre de atmosfera redutora, que seriam usadas como nanoprobes promissores para futuro bioimageamento. Amostras foram investigadas via caracterizações detalhadas por técnicas combinadas de difratometria de raios-X (DRX), microscopia eletrônica de transmissão (MET), STEM, difração de elétrons de área selecionada (SAED), espectroscopia de fotoluminescência de excitação (PLE)/fotoluminescência (PL), e análise de PL dependente de temperatura. Nas seções seguintes, reportamos síntese, caracterização e aplicação das nanopartículas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺.

Experimental

Síntese

Fontes metálicas iniciais são Zn(NO₃)₂·6H₂O, Cr(NO₃)₃·9H₂O, Ga₂O₃, Eu₂O₃, e GeO₂ todos produtos 99,99% puros comprados da Sinopharm (Xangai, China). Outros reagentes são grau analítico e comprados da Fábrica de Reagentes Químicos de Shenyang (Shenyang, China). Zn(NO₃)₂·6H₂O e Cr(NO₃)₃·9H₂O foram dissolvidos em água desionizada. Ga₂O₃ e Eu₂O₃ foram dissolvidos em solução de ácido nítrico. GeO₂ e ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) foram dissolvidos em hidróxido de amônio diluído. À mistura, solução EDTA foi adicionada lentamente sem precipitação, e razão molar de íons metálicos totais para EDTA foi mantida em 1:2. Razão molar atômica de Zn:Ga:Ge:Cr:Eu foi fixada em 3:1,984:2:0,01:0,006. Solução final foi vigorosamente agitada à temperatura ambiente por 1 h, então aquecida em forno a 85 °C para evaporação lenta de água até solução tornar-se sol que finalmente tornou-se gel. Gel obtido foi aquecido a 200 °C por 3 h para formar materiais porosos pretos. Finalmente, materiais porosos foram moídos e recozidos sob fluxo de gás O₂ (200 mL/min) a temperaturas selecionadas por 2 h.

Funcionalização de Superfície

Pó ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ foi moído por 30 min, então 150 mg da amostra obtida foi adicionado em 50 mL de solução 0,1 mol/L NaOH. Após sonicação por 1 h, suspensão foi vigorosamente agitada por 24 h à temperatura ambiente. Solução coloidal resultante foi centrifugada a 1000 rpm por 10 min para remover partículas de grande tamanho, e sobrenadante foi centrifugado a 10.000 rpm por 10 min para coletar precipitado. Nanopartículas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-OH obtidas foram lavadas com água desionizada três vezes.

Dez miligramas de nanopartículas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-OH foram dispersos em 4 mL de dimetilformamida (DMF) com assistência de sonicação por 10 min. Então, 40 µl de 3-aminopropil-trietoxisilano (APTES) foi adicionado sob agitação vigorosa por 24 h à temperatura ambiente. Nanopartículas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ obtidas foram coletadas por centrifugação a 10.000 rpm por 10 min e lavadas com DMF três vezes para remover APTES não reagido.

Imageamento Celular

Células Hek293T foram cultivadas em DMEM com 10% FBS e semeadas em pratos de cultura de 35 mm por 2 h em incubadora de CO₂. Nanopartículas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ obtidas foram dispersas em meio de cultura (50 mg/mL), que foram excitadas por 10 min por lâmpada UV de 254 nm e então movidas para pratos de cultura tratados por 1 h. Após remover meio de cultura, 0,1 mL de formaldeído-PBS 1% foi adicionado e células foram coradas com 0,5 mL corante DAPI no escuro por 10 min. Finalmente, células foram lavadas com PBS várias vezes para caracterização adicional.

Todos estudos envolvendo animais foram aprovados pelo comitê de cuidado e uso de animais da universidade.

Técnicas de Caracterização

Identificação de fase foi realizada por DRX (modelo SmartLab; Rigaku, Tóquio, Japão) operando a 40 kV/40 mA usando radiação Cu Kα filtrada por níquel e velocidade de varredura de 6,0° 2θ/min. Morfologias dos produtos foram observadas via MET (modelo JEM-2000FX; JEOL, Tóquio). Fotoluminescência dos fosfóres foi analisada com fluorospetrofotômetro FP-8600 (JASCO, Tóquio). Sinais de luminescência persistente foram obtidos usando Horiba JY FL3-21. Imagens de decaimento de afterglow foram registradas em quarto escuro usando sistema Kodak In-Vivo Imaging System FX Pro. Imageamento celular foi conduzido por microscópio confocal a laser (LEICA TCS SP2, Alemanha).

Todos estudos envolvendo animais foram aprovados pelo comitê de cuidado e uso de animais da universidade.

Resultados e Discussão

Pureza de fase das amostras foi primeiro investigada por DRX. Figura 1 (acima) mostra padrões de DRX dos ZGGO:Cr³⁺ e ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ preparados calcinados a 1000 °C, identificados junto com Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀ de estrutura espinélio. Estrutura cristalina de Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀ é a mesma de ZnGa₂O₄ (JCPDS No. 38-1240), que é solução sólida de ZnGa₂O₄ e Zn₂GeO₄. Na estrutura de Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀, Ge desempenha papel de substituição de Ga, conducente à formação de armadilhas, enquanto ZnGa₂O₄ é estrutura cristalina dominante. Existem dois tipos de cátions em uma célula unitária; Zn²⁺ e Ga³⁺ são cercados por quatro e seis ânions oxigênio formando tetraedro e octaedro, respectivamente (Fig. 1, abaixo). Cálculos dos dados de difração resultando em constantes de célula para ZGGO:Cr³⁺ são a = b = ~0,8335 nm, próximo ao de espinélio ZnGa₂O₄ (a = b = ~0,8335 nm, JCPDS No. 38-1240). Devido aos maiores raios iônicos de Eu³⁺ (para coordenação seis vezes, r_Eu³⁺ = 0,0947 nm e r_Ga³⁺ = 0,062 nm), valor maior de a = b = ~0,8336 nm foi observado para ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺. Análise de alargamento de perfil da reflexão Bragg (311) foi conduzida aplicando equação de Scherrer para tamanhos médios de cristalitos de 83 ± 6 nm para amostras ZGGO:Cr³⁺ e ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺. Na Fig. 1 (acima), também encontramos que produtos resultantes calcinados a 900 °C são mistura de fase espinélio (JCPDS No. 38-1240) e romboédrica (JCPDS No. 11-0687), indicando temperatura de calcinação ≥ 1000 °C necessária para produzir Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀ espinélio em forma fase pura.

Figura 2 (esquerda) mostra morfologia MET para partículas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺, indicando claramente que consistem inteiramente de partículas cúbicas, com tamanhos laterais de ~80-100 nm. Cantos agudos e franjas de rede bem resolvidas sugerem sua excelente cristalinidade, enquanto espaçamentos de ~0,29 nm correspondem bem ao plano (220) de ZnGa₂O₄ estruturado espinélio (d(220) = ~0,29 nm, JCPDS No. 38-1240) (inseto na Fig. 2). Como tamanhos de partícula são próximos aos tamanhos médios de cristalitos calculados dos dados de DRX, amostras obtidas podem ser monocristalinas. Análise SAED (Fig. 2 direita) confirmou ainda que nanopartículas sob análise são monocristalinas. Nanopartículas investigadas aqui são soluções sólidas diretas em vez de mistura mecânica. Mapeamento elementar de Zn, Ga, Ge, Cr, e Eu fornece evidência desta solução sólida, como revelado na Fig. 3 para ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺. Não apenas cada partícula contém Zn, Ga, Ge, Cr, e Eu, mas todos elementos são uniformemente distribuídos entre partículas.

Figura 4 mostra espectros de excitação de ZGGO:Cr³⁺ e ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ em pó à temperatura ambiente. Espectro de excitação monitorado a 697 nm cobre região espectral muito ampla (200 a 650 nm) e consiste de quatro bandas principais de excitação com picos a 273, 328, 410 e 569 nm, respectivamente. Banda de excitação a 273 nm é atribuída à banda de transferência de carga de O²⁻-Ga³⁺ no hospedeiro ZnGa₂O₄, enquanto bandas posteriores originam de transições internas de Cr³⁺, incluindo banda de 328 nm originando de transição ⁴A₂ → ⁴T₁(te²), banda de 410 nm de ⁴A₂ → ⁴T₁(t²e), e banda de 569 nm de ⁴A₂ → ⁴T₂(t²e). Incorporação de Eu³⁺ não alterou apreciavelmente posições das bandas PLE mas aumentou significativamente intensidades das transições internas de Cr³⁺, com I₄₁₀/I₂₇₃ aumentando de 0,18 para 0,56. Resultados acima indicam que incorporação de Eu³⁺ é conducente à excitação por luz visível. No entanto, banda de excitação mais forte a 273 nm também revelou que banda de transferência de carga de O²⁻-Ga³⁺ é comprimento de onda de excitação mais efetivo. Excitação do pó a 273 nm deu banda de emissão NIR a 697 nm (Fig. 5) devido à transição ²E → ⁴A₂ em íons Cr³⁺ distorcidos em galogermanato, na ausência de emissão de Eu³⁺.

Curvas de decaimento de luminescência persistente NIR de ZGGO:Cr³⁺ e ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ nanopartículas foram monitoradas a 697 nm após iluminação UV 254 nm (lâmpada de xenônio como fonte de luz) por 5 min à temperatura ambiente como mostrado na Fig. 6. Resultado demonstra que luminescência persistente NIR da amostra ZGGO:Cr³⁺ pode durar mais de 7200 s e ainda manter intensidade apreciável. Intensidade de luminescência persistente de ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ aumenta com incorporação de íon Eu³⁺. Acredita-se que íons lantânidos co-dopagem com Cr³⁺ em galogermanato de zinco resultariam em notável luminescência persistente NIR, por causa de seu papel importante em aumentar quantidade de defeitos anti-sítio que é responsável por luminescência persistente de Cr³⁺ em hospedeiro galogermanato de zinco. Por outro lado, luminescência persistente NIR de amostra ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ pode durar mais que ZGGO:Cr³⁺, indicando que incorporação de Eu³⁺ pode aumentar tempo de afterglow. Figura 7 mostra imagens de decaimento de afterglow NIR de pós ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ obtidas por sistema Kodak In-Vivo Imaging System FX Pro em diferentes tempos após parar irradiação UV, confirmando ainda que afterglow pode durar mais de 120 min e manter intensidade intensa de emissão NIR.

Para avaliar desempenho de aplicação de fosfór, especialmente para aplicações de alta potência, estabilidade térmica é parâmetro chave. Para avaliar comportamento de quenching térmico dos fosfóres neste trabalho, espectros PL foram analisados a temperaturas variando de 298 a 573 K (Fig. 8). Para todas amostras, elevar temperatura resultou em diminuição nas intensidades de emissão a 697 nm. Para obter imagem mais abrangente do comportamento de quenching térmico e estimar valor de sua energia de ativação (E_a), equação de Arrhenius (Eq. 1) foi empregada:

$$ {I}_{\mathrm{T}}=\frac{I_0}{1+c\exp \left(-\frac{E_{\mathrm{a}}}{kT}\right)} $$ (1)

onde I₀ e I_T são intensidades das temperaturas inicial e final, respectivamente; c é constante de taxa; E_a é energia de ativação; e k é constante de Boltzmann (8,629 × 10⁻⁵ eV K⁻¹). Figura 8 mostra linhas de relação In(I₀ / I_T − 1) vs 10.000 / T para banda de emissão centrada a 697 nm para ZGGO:Cr³⁺ e ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺. Energias de ativação similares foram calculadas: E_a = 0,23 eV para ZGGO:Cr³⁺ e E_a = 0,25 eV para ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺. Probabilidade que transição não-radiativa ocorra por unidade de tempo (α) pode ser definida segundo Eq. (2):

$$ \alpha =s\ \exp \left(-\frac{E_{\mathrm{a}}}{kT}\right) $$ (2)

onde s é fator de frequência (s⁻¹), k é constante de Boltzmann, e T é temperatura. Pode-se ver que menor energia de ativação (E_a) leva a maior probabilidade (α) de transição não-radiativa. Devido à energia de ativação similar, ZGGO:Cr³⁺ e ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ exibiram estabilidade térmica próxima, indicando incorporação de Eu³⁺ não afetou significativamente estabilidade térmica. No entanto, bandas laterais de fônons (PSBs) associadas centradas a 670 nm tornaram-se dominantes a temperatura mais alta, induzindo picos de emissão aprimorados.

Também investigamos espectros de excitação e emissão PL da dispersão aquosa de ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ (Fig. 9). Comparado ao pó ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺, dispersão aquosa exibiu quase mesmo perfil de curvas de excitação e emissão PL exceto intensidade de excitação relativamente fraca a 300 e 600 nm. Intensidade enfraquecida é provavelmente devido a efeito de quenching de vibração O-H da água.

Células Hek293T foram empregadas aqui para teste de imageamento in vitro. Nanopartículas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ obtidas foram dispersas em meio de cultura (50 mg/mL), que foram excitadas por 10 min por lâmpada UV 254 nm e então movidas para pratos de cultura tratados por 1 h. Figura 10 (esquerda, cor vermelha) mostra imageamento de luminescência celular coletado em microscópio confocal a laser na ausência de excitação. Sinal de luminescência afterglow de células Hek293T ainda era forte o suficiente para ser precisamente medido após 1 h, embora sinais de luminescência afterglow diminuíssem gradualmente ao longo do tempo. Para comparação, imageamento de luminescência celular foi coletado em microscópio confocal a laser por outro modo das mesmas células coradas com 0,5 mL corante DAPI (direita na Fig. 10, excitação simultânea. Sinais de imageamento similares sugeriram que nanopartículas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ possuíam excelente capacidade de imageamento para células in vitro.

Conclusões

Neste trabalho, nanopartículas ZGGO:Cr³⁺ e ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ de estrutura espinélio foram sintetizadas por método sol-gel em combinação com calcinação subsequente livre de atmosfera redutora. Amostras foram investigadas via caracterizações detalhadas por técnicas combinadas de DRX, MET, STEM, SAED, espectroscopia PLE/PL, e análise de PL dependente de temperatura. Nanopartículas com forma cúbica uniforme e tamanho lateral de ~80-100 nm são monocristalinas e solução sólida homogênea. Excitação do pó a 273 nm deu banda de emissão NIR a 697 nm devido à transição ²E → ⁴A₂ em íons Cr³⁺ distorcidos em galogermanato, na ausência de emissão de Eu³⁺. Luminescência persistente NIR de ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ pode durar mais de 7200 s e ainda manter intensidade intensa. Intensidade de luminescência persistente de ZGGO:Cr³⁺ e tempo de afterglow aumentam com incorporação de íon Eu³⁺. No entanto, incorporação de Eu³⁺ não afetou significativamente estabilidade térmica. Finalmente, nanopartículas ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ obtidas possuíram excelente capacidade de imageamento para células in vitro.

Abreviações

NIR

Infravermelho próximo

ZGGO

Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀

PLE

Fotoluminescência de excitação

PL

Fotoluminescência

SAED

Difração de elétrons de área selecionada

STEM

Microscopia eletrônica de transmissão de varredura

HRTEM

Microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução

EDTA

Ácido etilenodiaminotetraacético

APTES

3-aminopropil-trietoxisilano

DMF

Dimetilformamida

PBS

Salina fosfatada tamponada

LSCM

Microscopia confocal a laser