Desvendando Macromoléculas Específicas de Genótipo de E. coli via Mapeamento Nanomecânico AFM

Resumo

A categorização de cepas microbianas baseia-se convencionalmente em métodos moleculares, sendo raras as características morfológicas estudadas. Nesta pesquisa, revelamos estruturas macromoleculares da superfície bacteriana via mapeamento mecânico AFM, cuja resolução não foi determinada apenas pelo tamanho da ponta na nanoescala, mas também pelas propriedades mecânicas da amostra. Esta técnica permitiu estudo nanoescalado de estruturas membranosas de cepas microbianas com preparo simples de amostra e ambientes de trabalho flexíveis, superando as múltiplas restrições da microscopia eletrônica e métodos bioquímicos dependentes de marcação. Macromoléculas características localizadas na superfície celular foram consideradas proteínas de camada superficial (S-layer) e mostraram-se específicas aos genótipos de Escherichia coli, com tamanhos moleculares médios variando de 38 a 66 nm de diâmetro e formas reniformes ou arredondadas. Concluímos que as estruturas macromoleculares superficiais têm características únicas ligadas ao genótipo de E. coli, sugerindo que efeitos genômicos na morfologia celular podem ser identificados rapidamente via mapeamento mecânico AFM.

Introdução

Devido à resolução inferior da microscopia óptica e ao ambiente restrito da microscopia eletrônica, pesquisadores da área microbiana raramente consideram a aparência de células bacterianas, adotando métodos analíticos moleculares ou químicos para identificação de fragmentos genômicos, expressão de proteínas, etc. Esses métodos apresentam desvantagens, como serem intensivos em mão de obra e demorados, necessitando abordagens mais diretas, eficientes e flexíveis. Inventado em 1982 por Binnig et al., o microscópio de força atômica (AFM) usa sonda na nanoescala monitorada por feixe laser para observação da superfície da amostra com resolução nanoscópica ou atômica. A imagem da morfologia via sonda física supera limites de resolução e restrições ambientais de ambas microscopia óptica e eletrônica, oferecendo vantagens como preparo simples de amostra e ambientes flexíveis em ar ou fluido. Ainda, em estudos microbianos, aplicações atuais de AFM envolvem principalmente imagem qualitativa de morfologias estáticas ou dinâmicas de células bacterianas ou expressão de flagelos e pili, enquanto poucos estudos focam na ultraestrutura superficial de células microbianas e análise quantitativa de propriedades celulares.

Nesta pesquisa, AFM foi selecionado para estudo superficial de células de Escherichia coli (E. coli), observando formas e dimensões de bactérias individuais por imagens topográficas e de fase AFM. Além disso, mapeamento mecânico simultâneo revelou informações biomecânicas adicionais sobre componentes superficiais, onde pequenas diferenças nas características adesivas entre macromoléculas e matriz circundante puderam ser detectadas durante cada contato físico entre ponta e amostra. Aplicando tais técnicas avançadas à microbiologia, examinamos três genótipos de E. coli contendo uma cepa laboratorial e duas cepas patogênicas humanas para identificação de macromoléculas superficiais. Resultados mostraram que a técnica oferece resolução de imagem excedendo a escala da ponta AFM ao detectar distribuição mecânica da amostra. Concluímos que tal desenvolvimento em ciência de superfícies não apenas fornece detalhes da aparência celular a pesquisadores da área microbiana, mas também contribui para conhecimento das características superficiais de outros sistemas bio ou nanomateriais.

Métodos

Amostras Microbianas

Três cepas de E. coli testadas foram isoladas clinicamente e fornecidas pelo laboratório do Prof. Ching-Hao Teng no Instituto de Medicina Molecular, Universidade Nacional Cheng Kung. MG1655 é a cepa intestinal e selvagem laboratorial de E. coli K-12; as outras duas são patógenos humanos — CFT073, principal causa de infecções urinárias, e RS218, associada a meningite neonatal em lactentes.

Substrato Funcionalizado

Duas etapas de modificação superficial foram aplicadas para ligação covalente entre superfície sólida e células microbianas. Primeiro, solução de 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES, Sigma-Aldrich) formou camada inicial funcionalizada com NH₂ na superfície, onde revestimento APTES estável deve-se a ligações Si-O estáveis — Si do APTES e O da superfície oxidada. Possuindo duas funções COOH, glutaraldeído combina-se à função NH₂ do APTES com um COOH e atua com NH₂ na superfície bacteriana com o outro COOH.

Substratos limpos foram imersos em solução APTES (5% APTES em etanol) por uma hora e enxaguados com etanol e água ddH₂O. Lâminas secas com fluxo de nitrogênio foram colocadas em solução de glutaraldeído (2% em PBS) durante a noite, e lavadas com PBS.

Preparo de Amostra

Colônias únicas das cepas de E. coli foram selecionadas de placas de ágar caldo lisogênico (LB) e incubadas em caldo LB. Após 12 h de cultivo, a solução bacteriana foi diluída 1:100 em caldo LB pré-equilibrado fresco. Após mais 12 h de cultivo, a solução foi centrifugada a 1500×g (4000 rpm) por 3 min e ressuspensa em caldo LB, repetindo o processo duas vezes. Duzentos microlitros da solução bacteriana foram depositados no substrato funcionalizado e deixados em repouso por 30 min. A amostra foi submersa em água destilada duas vezes para remover células não aderidas e imediatamente imageada sob AFM em ar ambiente.

Caracterização AFM

Instrumento AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, EUA) e sonda de nitreto de silício com constante de mola calibrada de 0,7 N/m e raio de ponta de 10 nm foram selecionados para exame superficial de amostras microbianas. Taxa de varredura AFM e pixels de linha foram 0,5 Hz e 256 linhas para tamanho de varredura de 10 µm para primeira detecção topográfica, e parâmetros ajustados para 0,3 Hz e 512 linhas para tamanho de varredura de 2 µm para observação detalhada. Modo PeakForce nanomecânico quantitativo (QNM) foi usado para mapeamento nanomecânico, onde propriedades adesivas superficiais foram calculadas a partir da força atrativa máxima entre curvas força-distância de retração.

Nosso estudo prévio em Streptococcus mutans mostrou evolução mecânica na superfície bacteriana por 2 h, monitorada por mapeamento mecânico AFM contínuo, e amostras microbianas verificadas como vivas durante tal duração. Para garantir viabilidade das amostras de E. coli neste trabalho, pré-estudos foram conduzidos, e mudança contínua na adesão superficial por 4 h implicou que células permanecem vivas por pelo menos 4 h após preparo (mostrado no Arquivo Adicional 1). Consequentemente, amostras microbianas testadas foram medidas por AFM dentro de 2 h após preparo. Todos genótipos de E. coli foram cultivados individualmente e em tempos diferentes, e medições AFM conduzidas imediatamente após preparo. Dados quantitativos para cada cepa foram coletados de medições dentro de 2 h neste estudo.

Análise Estatística

Prism (GraphPad Software, EUA) foi usado para análise estatística. Comprimentos celulares e tamanhos macromoleculares apresentados como valores médios com erro padrão da média (SEM). Comparações múltiplas entre genótipos processadas via ANOVA one-way ordinária. Nível de confiança 95% (p < 0,05) selecionado, asteriscos indicam grau de diferença significativa. Número de amostras n de cada cepa > 40.

Resultados e Discussão

Ultraestrutura Superficial por Mapeamento Múltiplo

Ao escanear com AFM em escala de observação de 10 µm em amostra bacteriana, várias células únicas de E. coli MG1655 puderam ser vistas, e forma celular tridimensional observada da imagem topográfica (Fig. 1a); contornos claros das células em duas dimensões obtidos por imagem de erro de deflexão (Fig. 1b), e vários túbulos além das células bacterianas encontrados. Filamentos ondulados (Fig. 1c) consistentes com aparência de flagelos microbianos relatada em outro trabalho, confirmando tal achado como flagelos, e pili mais curtos e semelhantes a cabelos também visíveis. Ao diminuir área de observação da sonda para estudo detalhado de células microbianas únicas, topografia mostrou leve diferença na direção vertical entre superfícies celulares (Fig. 1d), e imagem de erro de deflexão pareceu fornecer mais informação morfológica enquanto ruído ambiental coletado era excessivo para investigar ultraestrutura superficial celular (Fig. 1e). Quando propriedades biomecânicas simultâneas da amostra foram medidas durante contato entre ponta e objeto testado, descobriu-se que superfície bacteriana era composta por enorme quantidade de macromoléculas com forma e tamanho específicos, reveladas pelo mapeamento de força adesiva (Fig. 1f); assim, resolução morfológica em imagens topográficas e de erro de deflexão foi melhorada com informação biomecânica.

Na Fig. 2a, expressão de flagelos por E. coli MG1655 evidentemente visível, onde tamanho de filamentos similar aos da Fig. 1b, com propriedades de adesão relativamente menores que substrato. Além disso, superfície bacteriana composta por componentes circulares caracterizados como menos adesivos comparados à matriz circundante. Observação similar a achados prévios em camadas teciduais de pele de camundongo, e grãos recorrentes e comparáveis considerados macromoléculas, cuja estrutura mais densa e consistente que regiões intermoleculares permite detectar facilmente diferenças no desempenho adesivo. Camada mais externa do envelope celular em bactérias Gram-negativas é camada de proteínas de auto-montagem, ilustrada na Fig. 2b, conhecida como proteína de camada superficial (S-layer). Estruturas S-layer tradicionalmente medidas por microscopia eletrônica enquanto requisitos de vácuo e revestimento condutor perdiam informação nativa e tempo real sobre proteínas. Embora algumas pesquisas extraíssem proteínas S-layer e remontassem em substrato mica para varredura AFM, resultados careciam de desempenho in situ e tempo real da estrutura S-layer. Baseado na arquitetura celular e algumas imagens prévias de superfície microbiana por microscopia eletrônica, consideramos macromoléculas observadas como proteínas S-layer.

Comparando medições AFM e microscopia eletrônica de transmissão (MET), a primeira tem várias vantagens: preparo de amostra mais simples, requisitos experimentais menos restritivos, aplicações de imagem mais biologicamente amigáveis. Seleção de MET na área biológica geralmente deve-se à capacidade de ver organelas intracelulares e imagem de ultra-resolução (tipicamente nanômetro ou sub-nanômetro). Mapeamento de adesão AFM no trabalho atual melhorou resolução de características e apresentou arranjos de macromoléculas superficiais de forma não dependente do tamanho da ponta, mas da estrutura intrínseca da amostra. Além disso, esta abordagem permite resolução nanoescalada de superfície microbiana em área de dezenas de micrômetros quadrados.

Diferenças Genômicas nas Características Morfológicas

Após observar ultraestrutura superficial de células E. coli MG1655, questão de interesse é como macromoléculas se arranjam em outras cepas. Patógenos humanos E. coli CFT073 e RS218 examinados por AFM com mesmos parâmetros experimentais, sem diferenças significativas em formas e dimensões celulares entre três genótipos em tamanho de característica de 10 µm (Fig. 3a–c). Mapeamento de força adesiva usado para identificar proteínas S-layer, detectando estruturas dissimilares com várias formas e tamanhos entre diferentes cepas E. coli (Fig. 3d–f). Para facilitar comparação, imagens detalhadas de mapeamento de adesão das cepas exibidas na Fig. 3g–i. Macromoléculas superficiais caracterizadas como forma arredondada em células MG1655 e RS218, embora com diâmetros moleculares diferentes: 38 ± 1,1 nm (n = 80) para MG1655 e 58 ± 2,7 nm (n = 46) para RS218. Por outro lado, células CFT073 possuíam forma única de proteínas S-layer, reniformes com diferença de comprimento entre dois pontos finais de 66 ± 3,2 nm (n = 44). Após analisar tamanhos das proteínas S-layer destes três genótipos para comparações múltiplas, resultados demonstraram diferenças significativas entre cepas (Fig. 4).

S-layers microbianas desempenham papéis importantes em várias funções: proteção de células contra ambientes severos, ataques de fagocitose e bactérias predadoras. Além disso, S-layers servem como adesinas permitindo colonização eficaz. Estruturas S-layer bem estudadas por MET e categorizadas em vários tipos de rede com espaçamento centro-a-centro na faixa 4–35 nm. Variação entre nossos resultados AFM e relatos MET da literatura atribuída a diferentes metodologias de imagem: MET dá morfologia 2D da estrutura S-layer, AFM captura topografia 3D incluindo múltiplas influências contribuídas por raio celular, rugosidade e geometria da sonda AFM.

Diferentes tipos de estruturas S-layer originalmente pensados como possíveis características taxonômicas para distinguir espécies bacterianas, embora depois descoberto que mesmo para espécie única, cepas microbianas poderiam possuir diferentes redes de proteínas. Enquanto alguns estudos investigaram papel de S-layer em formação de filamentos, tipos de proteínas em membranas celulares e diversidades genômicas em tamanho entre genótipos E. coli, diferenças em proteínas S-layer raramente foram notadas. Resultados do estudo atual revelaram diferenças nas características morfológicas entre E. coli MG1655, CFT073 e RS218, sugerindo que aparências de macromoléculas superficiais são provavelmente específicas a genótipos individuais de E. coli.

Conclusões

Neste trabalho, informação nanoestrutural genômico-específica sobre superfície bacteriana foi detectada por mapeamento mecânico AFM, distinguindo diferenças adesivas entre macromoléculas e matriz circundante. Macromoléculas superficiais de células microbianas consideradas proteínas de camada superficial, segundo arquitetura molecular de micróbios Gram-negativos. Arranjos e tamanhos destas macromoléculas mostraram-se específicos aos genótipos testados de E. coli com formas e tamanhos distintos, diferenças comprovadas significativas por análise estatística. Concluímos que estrutura S-layer bacteriana é genoma-dependente e pode ser método potencial para diagnóstico rápido de doenças associadas a micróbios ou cepas microbianas. Para implementar aplicação prática de característica S-layer, exame de mais genótipos bacterianos necessário para catálogo complementar. Atualmente estabelecendo banco de dados conectando características morfológicas bacterianas e desempenhos fisiológicos/patológicos, acreditando que será progresso promissor para aplicação prática de exame AFM.

Abreviações

AFM:

Microscópio de força atômica

ANOVA:

Análise de variância unidirecional

APTES:

3-Aminopropiltrietoxissilano

LB:

Caldo lisogênico

QNM:

Nanomecânica quantitativa

S-layer:

Camada superficial

MET:

Microscopia eletrônica de transmissão