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Nanocompósitos de poli (N-isopropilacrilamida) magnético:efeito do método de preparação nas propriedades antibacterianas

Resumo


A tarefa mais desafiadora na preparação de poli (N-isopropilacrilamida) magnética (Fe 3 O 4 -PNIPAAm) nanocompósitos para bio-aplicações visa maximizar sua reatividade e estabilidade. A polimerização por emulsão, precipitação in situ e adição física foram usadas para produzir Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1, Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3, respectivamente. Suas propriedades foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (morfologia), potencial zeta (carga superficial), análise termogravimétrica (estabilidade), magnetometria de amostra vibratória (magnetização) e espalhamento dinâmico de luz. Além disso, investigamos o efeito antibacteriano de cada nanocompósito contra Escherichia coli Gram-negativa e Staphylococcus aureus Gram-positivo . Ambos Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 e Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm-2 exibiram alta estabilidade térmica, potencial zeta e valores de magnetização, sugerindo sistemas coloidais estáveis. No geral, a presença de Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm, mesmo em concentrações mais baixas, causaram danos significativos a ambos E. coli e S. aureus DNA e levou a uma diminuição da viabilidade celular. Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 exibiu um efeito antimicrobiano mais forte contra ambas as cepas bacterianas do que Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3. Staphylococcus aureus era mais sensível do que E. coli a todos os três nanocompósitos magnéticos PNIPAAm.

Histórico


Nanocompósitos de polímero termorresponsivo magnético têm sido usados ​​para uma ampla gama de aplicações, incluindo tratamento de água e nanomedicina [1,2,3,4]. Cada nanocompósito é projetado especificamente para se beneficiar da combinação de recursos inerentes a ambos os componentes, ou seja, partículas magnéticas e polímeros responsivos à temperatura, criando assim um nanocompósito que é mais específico e controlável. Magnetita (Fe 3 O 4 ) as nanopartículas conferem propriedades magnéticas que permitem uma separação rápida e fácil após a aplicação de um campo magnético externo [5]. Poli (N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) forma um hidrogel tridimensional que sofre uma transição de fase de temperatura de solução crítica inferior reversível (LCST) de uma única bobina com um estado hidratado dilatado para um estado desidratado colapsado e encolhido [6] quando aquecido em água acima de 32 ° C. O capeamento das nanopartículas magnéticas com uma camada de PNIPAAm não só fornece estabilidade coloidal na água, mas também permite a funcionalidade de superfície por ligação com outras moléculas, como drogas, proteínas ou enzimas [7]. A construção de nanocompósitos com resposta dupla é obtida pela combinação de duas propriedades que respondem simultaneamente a uma combinação de temperatura e magnetismo. Os métodos mais comuns usados ​​para síntese de Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm são adição física, precipitação in situ e polimerização em emulsão. A adição física, o método mais simples, requer a mistura física de nanopartículas magnéticas previamente sintetizadas e partículas PNIPAAm. O segundo método, precipitação in situ, envolve a precipitação de nanopartículas magnéticas na presença do nanopolímero PNIPAAm [8]. A terceira (e mais comum) rota, a polimerização em emulsão, requer a polimerização do monômero (N-isopropilacrilamida) na presença de nanopartículas magnéticas [9,10,11]. Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm têm amplo uso em aplicações biomédicas e biotecnológicas. Nanopartículas magnéticas altamente estáveis, controladas e bem dispersas serão necessárias para aumentar a adequação de tais nanocompósitos para aplicações futuras. Uma inovação recente envolve um campo magnético externo que cria uma fonte de calor local para partículas de autoaquecimento, fazendo com que o PNIPAAm encolha e, por sua vez, permitindo a liberação de drogas encapsuladas [12]. Este fenômeno, juntamente com contas magnéticas direcionadas a tumores, abre outras terapias potenciais contra o câncer, como a hipertermia. A hipertermia pode ser iniciada por nanopartículas oscilantes em um campo magnético oscilante em frequências que variam de kilohertz a megahertz. Outro Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm foram recentemente sintetizados para controlar a liberação de moléculas bioativas, como mioglobina ou vitamina B12, e para administração de drogas [13]. Um estudo recente usando Fe superparamagnético revestido com PNIPAAm 3 O 4 nanopartículas foi capaz de mostrar que a agregação induzida termicamente de nanopartículas de óxido de ferro aumenta muito o contraste T2 durante a ressonância magnética [14]. Claramente, Fe 3 O 4 -PNIPAAm mostra grande promessa para desenvolvimentos futuros em aplicações biomédicas e biotecnológicas. Consequentemente, é importante que novos estudos sejam realizados sobre a biocompatibilidade deste material e seu efeito antibacteriano.

Neste estudo, investigamos o efeito de três métodos de preparação nas propriedades físico-químicas do Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm. Ao fazer isso, pretendemos avaliar o método de preparação mais conveniente para a produção de nanocompósitos exibindo propriedades aprimoradas para aplicações biológicas. Pela primeira vez, também descrevemos os efeitos antibacterianos dos três Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm usando uma abordagem multiponto, taxa de crescimento bacteriano, viabilidade, morfologia celular e nível de dano ao DNA.

Métodos

Químicos


Hexa-hidrato de cloreto de ferro (III) (FeCl 3 .6H 2 O, ≥ 98%), cloreto de ferro (II) tetra-hidratado (FeCl 2 .4H 2 O, ≥ 99%), hidróxido de amônio (26% NH 3 em H 2 O), N-isopropil-acrilamida (NiPAM, ≥ 99%), N, N-metilenobis (acrilamida) (BIS, ≥ 99%), dodecil sulfato de sódio (SDS, ≥ 99%) e persulfato de amônio (APS, ≥ 98,5 %) foram todos adquiridos frescos na Sigma-Aldrich, Alemanha.

Preparação de PNIPAAm por polimerização em emulsão


NiPAM (4 g), BIS (0,2 g) e SDS (0,3 g) foram dissolvidos em 350 ml de água desionizada (DI) a 70 ° C sob nitrogênio atmosférico. APS (0,0035 g) foi dissolvido em 1 ml de DI e adicionado ao recipiente de reação para iniciar a reação. Após 4 h, a reação foi interrompida e as partículas preparadas lavadas com água DI. Finalmente, as nanopartículas de PNIPAAm foram separadas por centrifugação (12.000 rpm por 30 min) e usadas em reações posteriores.

Preparação de magnetita (Fe 3 O 4 ) Nanopartículas


FeCl 2 · 4H 2 O (1,9 g) e FeCl 3 · 6H 2 O (5,4 g) (razão molar 1:2) foram dissolvidos em DI (100 ml) e aquecidos a 70 ° C. Hidróxido de amônio (NH 4 OH; 6 ml) foi adicionado rapidamente à solução, que imediatamente produziu um precipitado magnético preto profundo. Finalmente, o Fe 3 O 4 a suspensão de nanopartículas foi agitada durante 30 min a 70 ° C. O produto foi lavado várias vezes com DI, seguido do Fe 3 O 4 as nanopartículas foram secas em evaporador rotativo (25 mbar a 40 ° C) até a formação de um pó fino. Isso foi usado em todas as reações posteriores.

Preparação do nanocompósito magnético PNIPAAm por polimerização em emulsão (Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1)


NiPAM (0,4 g), Fe recém preparado 3 O 4 nanopartículas (0,2 g), BIS (0,2 g) e SDS (0,3 g) foram dissolvidos em 350 ml de DI e aquecidos a 70 ° C sob uma atmosfera de nitrogênio. APS (0,0035 g) foi então dissolvido em 1 ml de DI e adicionado ao recipiente de reação para iniciar a reação. Após 4 h, a reação foi interrompida e o nanocompósito preparado lavado com DI. Finalmente, Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 foi separado por centrifugação (12.000 rpm por 30 min) e depois seco em um evaporador rotativo (25 mbar a 40 ° C). O material em pó foi armazenado no escuro à temperatura ambiente.

Preparação do nanocompósito magnético PNIPAAm por precipitação in situ (Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2)


FeCl 2 (0,148 g), FeCl 3 (0,4 g) e 10 ml DI foram bem misturados e adicionados a 1 g de PNIPAAm. NH 4 OH (3 ml) foi então rapidamente adicionado à solução, o que imediatamente produziu um precipitado magnético negro profundo. A suspensão foi então agitada durante 30 min a 70 ° C. O nanocompósito preparado foi lavado com DI, seguido do Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 foi separado por centrifugação (12.000 rpm por 30 min) e seco em um evaporador rotativo (25 mbar a 40 ° C). O pó resultante foi armazenado no escuro à temperatura ambiente.

Preparação do nanocompósito magnético PNIPAAm por meio da adição física (Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3)


PNIPAAm (1 g) preparado na hora, Fe 3 preparado na hora O 4 nanopartículas (0,5 g) e DI (5 ml) foram bem misturados e a suspensão resultante foi agitada durante 30 min a 70 ° C. O nanocompósito assim preparado foi lavado com DI, seguido do Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 foi separado por centrifugação (12.000 rpm por 30 min) e seco em um evaporador rotativo (25 mbar a 40 ° C). O material em pó foi armazenado no escuro à temperatura ambiente.

Caracterização de nanocompósitos


O tamanho e o potencial zeta do Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm foram medidos após a dissolução completa das nanopartículas em DI (dispersão em DI seguida por sonificação por 2 min em temperatura ambiente). As medições do potencial zeta foram realizadas usando um analisador Zetasizer Nano (Malvern Instruments, EUA) em pH 7. Uma unidade Zetasizer Nano de espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi empregada para medir o diâmetro hidrodinâmico de agregados de partículas em DI. A análise termogravimétrica (TGA) foi realizada a fim de quantificar a quantidade de revestimento e determinar a estabilidade térmica do nanocompósito. Estudos térmicos foram realizados em 3–4 mg de amostra seca em temperaturas variando de 25 a 900 ° C, usando um TGA Q500 (TA Instruments, EUA) sob uma atmosfera de nitrogênio (taxa de aquecimento de 10 ° C / min). As propriedades magnéticas do material foram medidas usando um magnetômetro de amostra vibratória MicroMag ™ 2900 (Princeton Measurement Corporation, EUA). Imagens microscópicas foram obtidas usando um microscópio eletrônico de varredura (SEM), as partículas sendo primeiro completamente dissolvidas em DI e uma gota da solução colocada na grade de cobre de um SEM de emissão de campo Zeiss ULTRA Plus equipado com um cátodo Schottky. Todas as imagens foram analisadas usando o software Smart SEM v 5.05 (Zeiss, Alemanha) para imagens operadas a 1,5 kV.

Cepas e meios bacterianos


Gram-negativa Escherichia coli CCM3954 e Staphylococcus aureus Gram-positivo CCM 3953 (Brno, República Tcheca) foram usados ​​para todos os experimentos. Informações detalhadas sobre as cepas são fornecidas na página da web da ‘Coleção Tcheca de Microorganismos’ (http://www.sci.muni.cz/ccm/). Cada cultura bacteriana foi preparada de fresco e mantida durante a noite em um caldo nutriente de soja (Sigma-Aldrich) antes de realizar os experimentos biológicos.

Danos ao DNA


Os ensaios do cometa foram realizados seguindo a metodologia de Singh et al. [15] e Solanky et al. [16]. Todos os produtos químicos foram adquiridos da PENTA (República Tcheca), a menos que indicado de outra forma. Uma nova cultura bacteriana (ajustada para 10 7 células / ml) foi cultivado durante a noite e, em seguida, incubado com duas concentrações (0,1 e 1 g / l) de PNIPAAm e cada um dos Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm por 30 min a 37 ° C.

Um microgel foi preparado colocando 100 ml de agarose na superfície fosca de uma lâmina e cobrindo-a com uma lamínula de 24 × 50 mm (ThermoFisher Scientific, EUA). As lâminas foram deixadas em temperatura ambiente por 5 min, em seguida as lamínulas foram removidas e as lâminas deixadas secar. Esta camada de agarose seca (primeira camada) forneceu uma base firme para as camadas subsequentes. Depois de expor a bactéria ao PNIPAAm e Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm por 30 min, 2 μl (contendo aproximadamente 10.000 células expostas) foram tomados e misturados com 100 μl de agarose 0,5% recém-preparada. Esta mistura foi pipetada para lâminas congeladas e imediatamente coberta com uma lamínula (segunda camada). As lâminas foram então resfriadas em uma bandeja de aço sobre gelo. Os vidros de cobertura foram removidos após 1 min, e uma terceira camada de 100 μl de lise agarose (incluindo 0,5% de agarose com 5 μg / ml de RNAse A [Ameresco, EUA], 0,25% de N-lauroilsarcosina sódica e 0,5 mg / ml de lisozima) foi produzido, novamente usando uma tampa de vidro. As lâminas foram então deixadas em gelo por 10 min e então colocadas em uma câmara úmida por 30 min a 37 ° C. Após a remoção da lamínula, as lâminas foram imersas em uma solução de lise contendo 2,5 M de NaCl, 100 mM de sal tetrassódico de EDTA, tampão tris 10 mM de pH 10, lauroil sarcosina de sódio 1% e triton X-100 1%. Após 1 h de lise à temperatura ambiente, as lâminas foram transferidas para uma solução de digestão enzimática contendo 2,5 M de NaCl, 10 mM de EDTA e 10 mM de tris pH 7. Quatro tampão com 1 mg / ml de proteinase K. As lâminas foram então incubados a 37 ° C por 2 h, após o que foram colocados na placa horizontal de uma unidade eletroforética (Scie-plas, UK) e equilibrados com 300 mM de acetato de sódio e tampão tris 100 mM pH 9 por 20 min, em seguida, eletroforese em 12 V (0,4 V / cm, aproximadamente 100 mA) por 30 min. Após a eletroforese, as lâminas foram imersas em acetato de amônio 1 M em etanol (5 ml de acetato de amônio 10 M e 45 ml de etanol absoluto) por 20 min, etanol absoluto por 0,5 he etanol 70% por 10 min, após o que as lâminas foram secos ao ar à temperatura ambiente. Para obter uma coloração uniforme, as lâminas foram pré-tratadas com 50 ml de uma solução preparada de fresco de tampão TE 5% e 10 mM de NaH 2 PO 4 . As lâminas foram então coradas com 50 μl de uma solução de corante SYBR 1 mM recém-preparada (Sigma-Aldrich, EUA) em tampão TE por 30 min. A migração de quebras de fita de DNA (cometas) foi visualizada usando um microscópio de fluorescência AxioImager com ampliação de 400 × e software AxioVision v 4 (Zeiss, Alemanha). Normalmente, um comprimento de cauda de 50 cometas foi medido individualmente para cada amostra.

Taxa de crescimento bacteriano, viabilidade celular e morfologia


O protocolo experimental seguiu o descrito em Darwish et al. [17]. Resumidamente, um Fe 3 O 4 A suspensão estoque de nanocompósitos de -PNIPAAm (10 g / l) foi adicionada à cultura bacteriana fresca a fim de obter concentrações finais de 0,01, 0,05, 0,5 e 1 g / l. Cada concentração foi produzida em triplicado em uma placa de 24 poços. Controles negativos, consistindo de células bacterianas apenas em meio de crescimento e Fe 3 O 4 Nanocompósito -PNIPAAm apenas em meio de crescimento, foram executados em paralelo. A placa foi então incubada a 37 ° C, após o que a densidade óptica da amostra foi medida a 600 nm (OD600) a cada 2 h por 6 h usando um leitor de placa Synergy ™ HTX (Biotek, EUA). A taxa de crescimento bacteriano foi definida como a regressão linear R da medição OD600 (unidades de absorvância, AU) versus tempo de incubação em horas. Medidas preliminares de amostras de nanocompósitos sem células (6 h a 600 nm) mostraram valores de absorbância constantes que não interferiram nos valores de absorbância de nanocompósitos medidos com células bacterianas.

A concentração efetiva de nanocompósito a 10% de inibição (EC10) na taxa de crescimento bacteriano ( µ ) foi calculado para cada forma de Fe 3 O 4 -PNIPAAm baseado na equação: I (%) =( µ C - µ T ) / µ C × 100, onde I é a inibição, µ C é o valor médio da taxa de crescimento de controle e µ T é a taxa de crescimento da cultura afetada pelo nanocompósito [18].

Após incubação de 24 h, alíquotas de 100 μl de cada amostra foram coradas usando o kit de viabilidade bacteriana L7007 (Molecular Probes, Invitrogen, EUA) no escuro por 15 min. A determinação da proporção de células vivas (Ex / Em 485/528 nm) e mortas (Ex / Em 485/645 nm) foi realizada usando um leitor de placas Synergy ™ HTX (Biotek, EUA). A porcentagem de células mortas foi calculada como a proporção de células mortas para células vivas. Ao mesmo tempo, imagens de E. coli e S. aureus foram obtidos usando um microscópio de fluorescência AxioImager (Zeiss, Alemanha) com Ex / Em 470 / 490–700 nm. O comprimento de E. coli células e área de S. aureus os agrupamentos de células foram determinados em ampliação de 600 × usando o software AxioVision v 4 (Zeiss, Alemanha).

Análise estatística


Diferenças entre cepas bacterianas incubadas em PNIPAAm, diferentes Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm e amostras de controle sem nanocompósitos foram testados usando ANOVA e teste de Dunnett (GraphPad PRISM, EUA).

Resultados


Neste estudo, sintetizamos Fe 3 O 4 Nanocompósito -PNIPAAm empregando três protocolos diferentes:polimerização em emulsão (Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1), precipitação in situ (Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2) e adição física (Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3). A imagem SEM mostrou que o tipo de protocolo usado teve um efeito claro na morfologia da amostra e tamanho de partícula, com Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1, Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 mostrando uma ampla distribuição de tamanho, aglomeração devido à alta energia de superfície entre as nanopartículas e presença de interações dipolares magnéticas ( Fig. 1 ) .

Imagens de microscópio eletrônico de varredura e histogramas de PNIPAAm ( a ), Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 ( b ), Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 ( c ) e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 ( d ) Barra de escala =200 nm

TGA indicou que o Fe 3 O 4 As amostras de -PNIPAAm tornaram-se relativamente estáveis ​​em temperaturas acima de 400 ° C (Fig. 2). No geral, as nanopartículas de PNIPAAm mostraram menor conteúdo residual do que o Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm. Os valores de potencial zeta para carga superficial foram - 1,58 mV para PNIPAAm, - 15,6 mV para Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1, - 16,4 mV para Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e - 1,8 mV para Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3. Os valores do magnetômetro de amostra vibratória para saturação de magnetização foram 50,4 emu / g para Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1, 53,7 emu / g para Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e 21.0 emu / g para Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3. A dispersão de luz dinâmica acima (45 ° C) e abaixo (25 ° C) LCST indicou um tamanho hidrodinâmico para PNIPAAm de 50 nm a 25 ° C e 27 nm a 45 ° C; 412 nm a 25 ° C e 197 nm a 45 ° C para Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1; 212 nm a 25 ° C e 130 nm a 45 ° C para Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e 122 nm a 25 ° C e 60 nm a 45 ° C para Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 (Fig. 3).

Análise termogravimétrica de PNIPAAm (a), Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 (b), Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 (c) e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 (d)

Espalhamento de luz dinâmico abaixo (25 ° C) e acima (45 ° C) da transição de fase de temperatura da solução crítica inferior para PNIPAAm ( a ), Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 ( b ), Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 ( c ) e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 ( d )

Fe 3 O 4 Efeito do nanocompósito -PNIPAAm no DNA bacteriano


Após uma curta exposição de 30 min, quebras de fita de DNA foram determinadas para ambos E. coli e S. aureus em células tratadas com Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm, 40% EtOH (controle positivo) e células não tratadas (controle negativo). Tudo Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm mostraram um efeito significativo semelhante ( P <0,001) na média E. coli e S. aureus comprimento da cauda do cometa em todas as concentrações (Fig. 4), em comparação com as células de controle incubadas sem nanocompósitos.

Um exemplo de Escherichia coli cauda do cometa , após o tratamento com Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 ( a ) Resultados de quebras de fita de DNA (comprimento da cauda do cometa) para Escherichia coli ( b ) e Staphylococcus aureus ( c ) incubado por 30 min com 40% de EtOH (controle positivo), sem nanocompósitos (controle negativo), PNIPAAm (0,1 e 1 g / l) e (1) Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1, (2) Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e (3) Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 (barras de erro representam SD para comprimento do cometa de 50 células). Nível de significância *** P <0,001

Fe 3 O 4 Efeito antibacteriano nanocompósito -PNIPAAm


As taxas de crescimento indicaram que S. Gram-positivo aureus foi menos resistente do que o E. Gram-negativo coli a todos os nanocompósitos após 6 h de exposição. Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 inibiu fortemente o crescimento bacteriano, em comparação com PNIPAAm e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3, com E. coli taxa de crescimento reduzida significativamente de 0,08 para 0,028 ( P <0,001) com Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e 0,005 ( P <0,001) com Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 (1 g / l). Nenhum efeito foi observado em E. coli taxa de crescimento por PNIPAAm ou Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 (Fig. 5a). Em comparação, a taxa de crescimento de S. aureus foi afetado por todos os Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm e pelas nanopartículas PNIPAAm. Em concentrações mais baixas (0,01 g / le 0,05 g / l), a taxa de crescimento foi apenas ligeiramente reduzida de 0,07 para 0,06 ( P <0,05). Em concentrações mais altas (0,5 e 1 g / l), no entanto, houve uma redução significativa de 0,07 para 0,001 com PNIPAAm, 0,0 com Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1, 0,01 com Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e 0,009 com Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 (todos P <0,001; Fig. 5b). Além disso, o EC10 para todos os Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm e o controle de nanopartículas PNIPAAm foi menor para S. aureus do que para E. coli (Tabela 1).

Taxa de crescimento relativo de Escherichia coli ( a ) e Staphylococcus aureus ( b ) após incubação de 6 h em diferentes concentrações (0,01, 0,05, 0,5 e 1 g / l) de PNIPAAm (círculos vermelhos), Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 (losangos laranja [1]), Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 (triângulos verdes [2]) e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 (triângulos azuis [3]). As barras de erro mostram SD calculado a partir de n =3. Nível de significância *** P <0,001

A porcentagem de mortos E. coli as células aumentaram com o aumento da concentração de Fe 3 O 4 Nanocompósito -PNIPAAm após 24 h. PNIPAAm (0,5 e 1 g / l), por exemplo, causou um aumento significativo em E. coli células mortas (20%) em comparação com culturas sem Fe 3 O 4 Nanocompósito -PNIPAAm (12%). Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 (0,5 g / l) resultou em até 28% de E. coli células e 32% a 1 g / l ( P <0,001). O efeito do Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 foi menor do que Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3, com a porcentagem de células mortas aumentando de 13 a 25% quando expostas a concentrações de 0,01 e 1 g / l, respectivamente ( P <0,001). Tanto a 0,5 quanto a 1 g / l, Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 resultou em cerca de 25% de células mortas ( P <0,001; Fig. 6a). A porcentagem de mortos S. aureus as células só foram significativamente afetadas por 1 g / l Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3, com células mortas atingindo até 50 e 48%, respectivamente ( P <0,001). O controle sem nanocompósitos continha aproximadamente 18% de células mortas, enquanto em concentrações mais baixas de PNIPAAm, Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3, a proporção de células mortas foi ainda menor. PNIPAAm em concentrações de 0,5 e 1 g / l resultou em 25 e 30% ( P <0,005) células mortas, respectivamente. Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 não teve efeito em S. aureus culturas (Fig. 6b).

Porcentagem de mortos Escherichia coli ( a ) e Staphylococcus aureus ( b ) células após exposição de 24 horas a PNIPAAm e (1) Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1, (2) Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e (3) Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3. Barras de erro mostram SD de n =3. Níveis de significância * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,001

Não houve diferença na média E. coli comprimento da célula (5 μm) e média S. aureus área do cluster de células (200 μm 2 ) para qualquer nanocompósito ou o controle PNIPAAm em concentrações mais baixas (0,1 g / l; Fig. 7). Em concentrações mais altas, E. coli o comprimento não mudou na presença de Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2, nem S. aureus área do grupo de células na presença de Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1. No entanto, E. coli comprimento foi significativamente aumentado na presença de 1 g / l de PNIPAAm (5,4 μm, P <0,005), Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 (6 μm, P <0,001) e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 (10 μm, P <0,001) (Fig. 7a), enquanto S. aureus formaram clusters maiores quando expostos a PNIPAAm (1937 μm 2 , P <0,001), Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 (924 μm 2 , P <0,001) e Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 (1722 μm 2 , P <0,001) (Fig. 7b).

Comprimento de Escherichia coli células ( a ) e área do agrupamento de Staphylococcus aureus células ( b ) após incubação de 24 horas com PNIPAAm e (1) Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1, (2) Fe 3 O 4 -PNIPAAm-2 e (3) Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3. As barras de erro mostram SD determinado a partir de n =50. Níveis de significância ** P <0,05 e *** P <0,001

Discussão


Tanto o método de síntese quanto os meios pelos quais as nanopartículas magnéticas foram adicionadas à matriz do polímero tiveram um efeito claro nas propriedades físico-químicas intrínsecas do Fe 3 magnético O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm. A síntese stepwise teve um forte impacto nas propriedades dos nanocompósitos, resultando em mudanças na forma da partícula, distribuição de tamanho, tamanho e química da superfície, junto com mudanças subsequentes nas propriedades magnéticas [19, 20]. Polimerização em emulsão (Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1), um método fácil e preciso, produziu os nanocompósitos estáveis ​​com distribuição de tamanho de partícula estreita e tendência de agregação mais baixa, qualidades particularmente importantes em aplicações biomédicas [17]. Produzidas como resultado da repulsão estérica e coulômbica, as dimensões das partículas eram suficientemente pequenas para evitar a precipitação [21]. O método menos eficaz foi a adição física (Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3). Não apenas foi produzido por meio de três etapas distintas e, portanto, levou mais tempo para ser preparado, o nanocompósito resultante apresentou maior agregação do que qualquer um dos outros dois métodos de produção. Além disso, nossos resultados indicaram que Fe 3 O 4 -PNIPAAm-3 produzido desta forma pode conter PNIPAAm e Fe indesejáveis ​​ 3 O 4 resíduos de nanopartículas.

Os polímeros podem se ligar a nanopartículas magnéticas por ligações físicas (não covalentes) ou covalentes, com o material híbrido resultante exibindo propriedades específicas, dependendo da rota sintética tomada. A ressuspensão significativa de nanopartículas magnéticas ocorre quando a preparação prossegue no solvente no qual ocorre a formação de nanopartículas híbridas, após o que a agregação e a segregação podem se tornar um problema. Nesse caso, a formação in situ de nanopartículas magnéticas pode ser uma alternativa melhor em muitos casos. Além disso, se a concentração de surfactante for muito baixa, a coalescência mudará o tamanho das gotículas, enquanto micelas podem se formar se a concentração for muito alta, levando à nucleação micelar. A este respeito, é importante que a concentração do surfactante seja escolhida cuidadosamente com base na caracterização precisa das propriedades da superfície e extensão da modificação da partícula, a fim de garantir que a superfície da partícula inorgânica seja compatível com a matriz polimérica.

Para avaliar as propriedades magnéticas do Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm, é importante conhecer o conteúdo de MNPs no nanocompósito. O TGA foi empregado para quantificar a quantidade de MNP e para investigar a estabilidade térmica do Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm em comparação com nanopartículas de PNIPAAm isoladamente. Todos os três Fe 3 O 4 Nanocompósitos -PNIPAAm exibiram maior estabilidade térmica do que nanopartículas PNIPAAm, presumivelmente devido à presença de Fe 3 O 4 partículas na matriz (Fig. 2). Resíduos superiores em nanocompósitos magnéticos podem ser atribuídos à presença de Fe inorgânico 3 O 4 compostos nas amostras, que foram sustentados mesmo em temperaturas mais altas.

Fe 3 O 4 -PNIPAAm-1 apresentou maior estabilidade térmica do nanocompósito, junto com a menor perda de peso. Até 200 ° C, a principal fonte de perda de peso era através da perda de água e adsorção física da camada de polímero [22]; acima de 200 ° C, no entanto, as perdas foram principalmente devido à decomposição da camada química que une o PNIPAAm. O resíduo da amostra, que se tornou estável acima de 400 ° C, representou 87% do peso original, o que corresponde à quantidade de nanopartículas magnéticas no nanocompósito. Um dos objetivos desse processo de preparação era produzir um nanocompósito com propriedades magnéticas que impedissem a agregação e possibilitasse sua redispersão rapidamente assim que o campo magnético fosse desligado. Tais propriedades permitiriam seu uso em uma gama de campos diferentes, incluindo tratamento hipertérmico de tumores, como agentes de contraste em imagens de ressonância magnética, em reparo de tecidos, revestimento de dispositivos biomédicos, imunoensaio, separação de células e separação biomagnética de biomoléculas [18, 23,24 , 25,26]. We tested our nanomaterials through magnetisation saturation, which assesses the maximum possible magnetisation of the substance beyond which no further change takes place despite an increase in the magnetic field. Our results showed Fe3 O 4 -PNIPAAm-2 to have the highest magnetisation saturation level of the three nanocomposites tested. Our values were lower (53.7 emu/g) than those previously reported for uncoated Fe3 O 4 nanoparticles (92 emu/g) [27], however, presumably due to surface order/disorder interactions in the magnetic spin moment and an increase in nanocomposite weight and volume due to the presence of the PNIPAAm polymer layer.

Of special interest as regards biomedical application is the behaviour of polymer-water solutions stable below a LCST [28]. After heating the prepared Fe3 O 4 -PNIPAAm nanomaterials above the transition temperature, a coil-to-globule transition occurred, followed by inter-molecular association. All three Fe3 O 4 -PNIPAAm nanomaterials displayed very similar behaviour, with all shrinking as temperature increased. PNIPAAm is widely used as a thermoresponsive polymer due to the proximity of its LCST (~ 30–32 °C) to physiological temperature. Furthermore, the thermo-responsibility of PNIPAAm has proved useful for drug release in vivo [28]. Nanoscale magnetic hydrogels based on PNIPAAm have now been developed for theranostic application, with those embedded with low concentrations of Fe3 O 4 magnetic nanostructures resulting in an LCST of ~ 40 °C, making Fe3 O 4 -PNIPAAm of especial interest for controlled drug release application [29].

SEM nanoparticle histograms displayed a broader size distribution than those using DLS (Fig. 1). Interpretation of DLS data involves the interplay of multiple parameters, however, including the size, concentration, shape, polydispersity and surface properties of the particles. Measurement of the hydrodynamic size of thermoresponsive samples in relation to temperature is a common method of characterising LCST behaviour, with nanoparticles shrinking as temperatures increase, soluble polymers precipitating and particle size increasing. As expected, PNIPAAm had a lower hydrodynamic size than the Fe3 O 4 -PNIPAAm nanocomposites. Of the nanocomposites, Fe3 O 4 -PNIPAAm-3 displayed the lowest hydrodynamic size and a narrow size distribution. Variability in hydrodynamic size is likely to be due to the presence of Fe3 O 4 nanoparticles in the PNIPAM matrix, which increases both the particle dimension and aggregation in water (Fig. 3) [8].

All Fe3 O 4 -PNIPAAm nanocomposites displayed antimicrobial properties (Table 2), with both Gram-negative and Gram-positive bacteria negatively affecting E. coli growth rate in the order Fe3 O 4 -PNIPAAm-1 > Fe3 O 4 -PNIPAAm-2 > Fe3 O 4 -PNIPAAm-3 = PNIPAAm and S. aureus growth rate as Fe3 O 4 -PNIPAAm-1 > Fe3 O 4 -PNIPAAm-2 > Fe3 O 4 -PNIPAAm-3 > PNIPAAm. Similarly, the antibacterial properties desired for medical applications such as biomedical device coatings and wound dressing materials have been confirmed for a number of new PNIPAAm composites, including ZnO-PNIPAAm, Ag-PNIPAAm and chitosan-PNIPAAm [23,24,25,26].

In comparison with the modified Fe3 O 4 nanomaterials described in our earlier studies, the PNIPAAm-1, PNIPAAm-2 and PNIPAAm-3 nanocomposites all showed a stronger effect on both E. coli and S. aureus , with S. aureus EC10 growth inhibition ranging from 0.04 to 0.06 g/l for the three nanomaterials, while modified APTS-, PEG- and TEOS-MNPs ranged between 0.1 and 0.25 g/l [17], and polymer-coated Fe3 O 4 (PEI-mC-, PEI- and OA-MNPs) had a value of 0.15 g/l [18]. Inhibition of bacterial growth could have been caused by several factors, including cell membrane damage, oxidative stress and cell elongation, resulting in the production of lethal cells. The cells could, on the other hand, survive such unfavourable conditions by employing repair enzymes, antioxidants and/or transient growth arrest. This could partly explain the phenomenon that in lower concentrations (0.01 and 0.05 g/l) of PNIPAAm, Fe3 O 4 -PNIPAAm-1 and Fe3 O 4 -PNIPAAm-3, the proportion of dead cells of S. aureus was lower after 24-h incubation than in control where no such factor inducing mobilisation of the defence/repair system was present. Higher concentrations of PNIPAAm and nanocomposites caused indeed significant increase in dead cells of E. coli and S. aureus corresponding well with significant decrease in growth rate of the cell cultures.

Exposure to 1 g/l of the nanocomposite resulted in changes to bacterial cell morphology, with greatest change to E. coli cell length caused by Fe3 O 4 -PNIPAAm-3 > Fe3 O 4 -PNIPAAm-1 > PNIPAAm > Fe3 O 4 -PNIPAAm-2, and Fe3 O 4 -PNIPAAm-3 > Fe3 O 4 -PNIPAAm-2 > PNIPAAm > Fe3 O 4 -PNIPAAm-1 for S. aureus clustering. This effect was also observed previously when the same bacteria were exposed to different functional magnetic nanoparticles [17]. Elongation of E. coli cells in the presence of nanocomposites is indicative of transient growth arrest and is evidence of an adaptive response to oxidative stress or DNA damage [30]. In the case of S. aureus , which is a biofilm formation species, the cells became embedded over a larger area than the nanocomposite-free control when exposed to PNIPAAm, Fe3 O 4 -PNIPAAm-2 and Fe3 O 4 -PNIPAAm-3 (Fig. 8). No S. aureus biofilm was produced when in contact with Fe3 O 4 -PNIPAAm-1, possibly due to its stronger antibacterial properties. S. aureus usually produces a biofilm in harsh environments to protect the cells [31]; however, this could also have an adverse effect on the bacteria as nanocomposites can integrate through the biofilm and harm the cells, as has already been described for Pseudomonas sp. [32].

S. aureus cell culture without nanocomposites (a ) and the cells embedded in biofilm after incubation with nanocomposites for 24 h (b ) The scale bar is 10 μm

Iron could lead to DNA damage in bacterial cells as described in previous reviews [33, 34]; hence, we attempted to test whether our MNPs caused DNA damage to bacteria. The presence of Fe3 O 4 -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations (0.01 or 1 g/l) caused significant damage to E. coli and S. aureus DNA, even after short exposures (30 min). To the best of our knowledge, this is the first acute genotoxicity study of magnetic composites on bacteria; as a result, we cannot compare our results with those of other authors directly. Previous studies have shown no genotoxicity attributable to PNIPAAm nanoparticles, however, and no decrease in cell viability when tested against two kinds of mammalian cell at nanoparticle concentrations of up to 800 mg/l [30]. On the other hand, previous genotoxicity studies on MNPs (γ-Fe3 O 4 ) have shown a negative effect on human fibroblast cells at 100 mg/l [35]. Studies performed with mammalian cell lines, however, cannot be directly compared to studies done with bacterial cells, due to significant differences in eukaryotic and prokaryotic cells.

Conclusions


Magnetic poly(N-isopropyl-acrylamide) nanocomposites were prepared through emulsion polymerisation (Fe3 O 4 -PNIPAAm-1), in situ precipitation (Fe3 O 4 -PNIPAAm-2) and physical addition (Fe3 O 4 -PNIPAAm-3). Both Fe3 O 4 -PNIPAAm-1 and Fe3 O 4 -PNIPAAm-2 showed higher values for surface charge and thermal stability, indicating a stable colloidal system. At room temperature, Fe3 O 4 -PNIPAAm-3 displayed highest magnetisation saturation. Presence of Fe3 O 4 -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations caused significant damage to both E. coli and S. aureus DNA, even after short exposure, and led to a decrease in cell viability. Overall, we suggest that Fe3 O 4 -PNIPAAm-1, prepared through emulsion polymerisation, is the most appropriate method for producing a magnetic nanocomposite with high antimicrobial activity towards Gram-negative E. coli and Gram-positive S. aureus .

Abreviações

Fe3 O 4 -PNIPAAm:

Magnetic poly(N-isopropylacrylamide)
MNPs:

Magnetite nanoparticles

Nanomateriais

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