Nanocompósitos Fe₃O₄-PNIPAAm: Método de Preparação Determina Eficácia Antibacteriana e Desempenho Físico-Químico

Resumo

Nanocompósitos magnéticos de poli(N-isopropilacrilamida) (Fe₃O₄-PNIPAAm) são promissores para aplicações biomédicas e ambientais. Comparamos três rotas de síntese — polimerização em emulsão, precipitação in situ e adição física — para produzir Fe₃O₄-PNIPAAm-1, -2 e -3, respectivamente. Microscopia eletrônica de varredura, potencial zeta, análise termogravimétrica, magnetometria de amostra vibratória e espalhamento dinâmico de luz revelaram que Fe₃O₄-PNIPAAm-1 e -2 exibem estabilidade térmica, carga superficial e magnetização superiores, indicando coloides altamente estáveis. Todos os compósitos, mesmo em baixas concentrações, induziram dano significativo ao DNA em Escherichia coli e Staphylococcus aureus e reduziram viabilidade celular. Fe₃O₄-PNIPAAm-1 exibiu o efeito antimicrobiano mais forte em ambas cepas, com S. aureus mostrando maior sensibilidade que E. coli. Estes achados destacam a polimerização em emulsão como rota preferida para produzir Fe₃O₄-PNIPAAm com propriedades antibacterianas aprimoradas.

Introdução

Nanocompósitos poliméricos magnéticos termorresponsivos, como Fe₃O₄-PNIPAAm, combinam responsividade magnética com comportamento sensível à temperatura LCST do PNIPAAm (~32 °C). O núcleo magnético facilita separação rápida sob campo externo, enquanto a casca polimérica oferece estabilidade coloidal e sítios de funcionalização para fármacos ou biomoléculas. Aplicações abrangem tratamento de água, entrega de fármacos, contraste em ressonância magnética e terapia de hipertermia baseada em câncer. Três principais estratégias de síntese são empregadas: (1) adição física de partículas pré-formadas de Fe₃O₄ e PNIPAAm; (2) precipitação in situ de Fe₃O₄ dentro de matriz PNIPAAm; e (3) polimerização em emulsão de N-isopropilacrilamida ao redor de Fe₃O₄. A escolha do método influencia tamanho de partícula, química superficial, magnetização e, por fim, desempenho biológico. Compreender estes efeitos é essencial para projetar nanocompósitos com estabilidade e eficácia antibacteriana ótimas.

Métodos

Reagentes

Todos os reagentes (FeCl₃·6H₂O, FeCl₂·4H₂O, NH₄OH, N-isopropil-acrilamida, BIS, SDS, APS) foram obtidos da Sigma-Aldrich (Alemanha) e usados sem purificação adicional.

Síntese do PNIPAAm (Polimerização em Emulsão)

NiPAM (4 g), BIS (0,2 g) e SDS (0,3 g) foram dissolvidos em 350 mL de água desionizada a 70 °C sob N₂. APS (0,0035 g) em 1 mL de água iniciou a polimerização; a reação ocorreu por 4 h, após o que as partículas foram lavadas e coletadas por centrifugação (12.000 rpm, 30 min).

Preparação de Nanopartículas de Fe₃O₄

FeCl₂·4H₂O (1,9 g) e FeCl₃·6H₂O (5,4 g) (razão molar 1:2) foram dissolvidos em 100 mL de água DI, aquecidos a 70 °C, e precipitados com NH₄OH (6 mL). A suspensão preta foi agitada por 30 min, lavada repetidamente, e seca em evaporador rotativo (25 mbar, 40 °C).

Fe₃O₄-PNIPAAm-1 (Polimerização em Emulsão)

NiPAM (0,4 g), Fe₃O₄ (0,2 g), BIS (0,2 g), SDS (0,3 g) foram misturados em 350 mL DI, aquecidos a 70 °C sob N₂, e polimerizados com APS (0,0035 g). Após 4 h, o compósito foi lavado, centrifugado e seco.

Fe₃O₄-PNIPAAm-2 (Precipitação In Situ)

FeCl₂ (0,148 g), FeCl₃ (0,4 g) e 10 mL DI foram adicionados a 1 g PNIPAAm. NH₄OH (3 mL) induziu precipitação preta imediata; a mistura foi agitada a 70 °C por 30 min, lavada, centrifugada e seca.

Fe₃O₄-PNIPAAm-3 (Adição Física)

1 g PNIPAAm, 0,5 g Fe₃O₄ e 5 mL DI foram misturados e agitados a 70 °C por 30 min. A suspensão foi lavada, centrifugada e seca.

Caracterização

Tamanho e potencial zeta foram medidos por DLS após sonicação. Análise termogravimétrica (25–900 °C, 10 °C/min, N₂) quantificou conteúdo de revestimento. Magnetização de saturação foi registrada com magnetômetro de amostra vibratória. Imagens de MEV (1,5 kV) revelaram morfologia. Todas as medições foram realizadas em triplicata.

Cepas Bacterianas e Condições de Crescimento

E. coli CCM3954 (Gram-negativa) e S. aureus CCM3953 (Gram-positiva) foram cultivadas overnight em caldo soja-nutriente antes da exposição a nanocompósitos (0,01–1 g L⁻¹).

Avaliação de Dano ao DNA (Ensaio Cometa)

Suspensões bacterianas (10⁷ células mL⁻¹) foram incubadas com 0,1 ou 1 g L⁻¹ de cada compósito por 30 min a 37 °C. Protocolo padrão de cometa (lise, eletroforese, coloração) foi seguido; 50 cometas por amostra foram quantificados usando microscopia de fluorescência (×400).

Crescimento, Viabilidade e Morfologia

Taxas de crescimento foram calculadas a partir de medições OD₆₀₀ a cada 2 h por 6 h. Valores EC₁₀ foram derivados de porcentagens de inibição. Viabilidade após 24 h foi determinada com kit live/dead (excitação 485 nm, emissão 528 nm para vivas; 645 nm para mortas). Comprimento celular (E. coli) e área de cluster (S. aureus) foram medidos a ×600.

Análise Estatística

Dados foram analisados por ANOVA unidirecional seguido pelo teste de Dunnett (GraphPad Prism). Significância foi definida em P < 0,05.

Resultados

Imagens de MEV confirmaram que Fe₃O₄-PNIPAAm-1, -2 e -3 exibiram morfologias distintas, com Fe₃O₄-PNIPAAm-1 mostrando distribuição de tamanho mais estreita e aglomeração mínima. Curvas TGA indicaram que todos os compósitos foram termicamente estáveis acima de 400 °C, com Fe₃O₄-PNIPAAm-1 retendo 87% de sua massa, refletindo alta carga de Fe₃O₄. Potenciais zeta foram -15,6 mV (-1,58 mV para PNIPAAm), -16,4 mV (-1,8 mV para Fe₃O₄-PNIPAAm-3), confirmando estabilidade coloidal. Valores de magnetização de saturação foram 50,4 emu g⁻¹ (Fe₃O₄-PNIPAAm-1), 53,7 emu g⁻¹ (Fe₃O₄-PNIPAAm-2) e 21,0 emu g⁻¹ (Fe₃O₄-PNIPAAm-3). Medidas DLS a 25 °C e 45 °C revelaram mudanças de tamanho dependentes de temperatura consistentes com comportamento LCST.

Ensaios cometa mostraram quebras significativas de fita de DNA em E. coli e S. aureus após 30 min de exposição a todos os compósitos (P < 0,001). Ensaios de taxa de crescimento demonstraram que Fe₃O₄-PNIPAAm-1 e -2 inibiram fortemente proliferação bacteriana, enquanto Fe₃O₄-PNIPAAm-3 teve efeito modesto. Valores EC₁₀ foram mais baixos para Fe₃O₄-PNIPAAm-1, indicando maior potência antibacteriana. Ensaios de viabilidade revelaram aumentos dose-dependentes em células mortas, com Fe₃O₄-PNIPAAm-1 alcançando até 32% E. coli mortas e 50% S. aureus mortas a 1 g L⁻¹. Análise morfológica mostrou alongamento de E. coli e formação de clusters de S. aureus em concentrações maiores, refletindo respostas de estresse.

Discussão

A rota de síntese influencia marcadamente os atributos físico-químicos dos nanocompósitos Fe₃O₄-PNIPAAm. Polimerização em emulsão produz partículas com homogeneidade de tamanho ótima, carga superficial e magnetização, facilitando dispersão rápida e forte ação antibacteriana. Precipitação in situ oferece estabilidade térmica comparável mas agregação ligeiramente maior, enquanto adição física resulta nas propriedades menos desejáveis e efeito antimicrobiano mais fraco. O dano ao DNA observado provavelmente surge de estresse oxidativo e disrupção de membrana induzidos por núcleos de Fe₃O₄, corroborado por relatórios prévios de genotoxicidade de nanopartículas baseadas em Fe. A atividade superior de Fe₃O₄-PNIPAAm-1 ressalta a importância de síntese controlada para aplicações biomédicas como revestimentos antimicrobianos, curativos de feridas e entrega direcionada de fármacos.

Conclusões

Nanocompósitos Fe₃O₄-PNIPAAm preparados via polimerização em emulsão (Fe₃O₄-PNIPAAm-1) exibem a combinação mais favorável de estabilidade térmica, carga superficial, magnetização e eficácia antibacteriana contra E. coli e S. aureus. Precipitação in situ (Fe₃O₄-PNIPAAm-2) e adição física (Fe₃O₄-PNIPAAm-3) produzem compósitos menos estáveis e menos potentes. Estes achados apoiam o uso de polimerização em emulsão para gerar materiais Fe₃O₄-PNIPAAm adequados para aplicações antimicrobianas clínicas e ambientais.

Abreviações

Fe₃O₄-PNIPAAm

Poli(N-isopropilacrilamida) magnética

MNPs

Nanopartículas de magnetita