Toxicidade e Potencial Terapêutico de Nanotubos de Carbono Oxidados Funcionalizados com Doxorrubicina e Fluoresceína: Resultados In Vitro e In Vivo

Resumo

Este estudo investiga a citotoxicidade de nanotubos de carbono de paredes múltiplas oxidados (CNTox), nanotubos funcionalizados com doxorrubicina (CNT-Dox) e com fluoresceína (CNT-FITC) em células de adenocarcinoma de cólon HT29 e em camundongos Balb/c. Demonstramos que a doxorrubicina pode ser ancorada covalentemente aos CNTs via ligações peptídicas, o que reduz marcadamente sua citotoxicidade imediata. A clivagem enzimática pela tripsina libera a doxorrubicina, restaurando sua potência e gerando efeito sinérgico quando CNT-Dox e tripsina são combinados. In vivo, CNT-Dox mostra menor toxicidade sistêmica que a doxorrubicina livre, com apenas elevações modestas de enzimas hepáticas e parâmetros sanguíneos, enquanto CNTox sozinho é essencialmente não tóxico. Estes resultados apoiam o uso de CNTs como carreadores de liberação controlada para agentes anticâncer potentes.

Introdução

Os nanotubos de carbono (CNTs) possuem alta área superficial, excelente captação celular e capacidade de atravessar membranas biológicas, tornando-os vetores atraentes para entrega de fármacos, terapia gênica e aplicações de imagem. A funcionalização com grupos hidrofílicos melhora a solubilidade e biocompatibilidade, enquanto a fixação covalente de moléculas terapêuticas pode proporcionar liberação direcionada e controlada. A doxorrubicina (Dox) é um quimioterápico amplamente utilizado com toxicidade sistêmica significativa; ligá-la a CNTs pode reduzir efeitos off-target e aumentar a especificidade tumoral. Trabalhos prévios mostraram que CNTs podem ser administrados com segurança em baixas doses, mas concentrações mais altas ou química de superfície inadequada podem provocar estresse oxidativo, inflamação e acúmulo em órgãos. Este estudo baseia-se nestes achados para avaliar o perfil de segurança de CNT-Dox e CNT-FITC in vitro e in vivo.

Métodos

Células de adenocarcinoma de cólon HT29 foram cultivadas em monocamadas 2D e esferoides 3D. CNTs foram sintetizados por deposição química de vapor, oxidados com HNO₃ 70% e funcionalizados com doxorrubicina ou fluoresceína via química de carbodiimida. Suspensões foram sonificadas, esterilizadas e caracterizadas por MEV, potencial zeta e FTIR. Citotoxicidade foi avaliada usando ensaios MTT e de área de colônia. Para liberação controlada, tripsina (0,05–70%) foi adicionada para avaliar a liberação de doxorrubicina. In vivo, camundongos Balb/c receberam injeções intraperitoneais de CNTox (1,5 mg kg⁻¹), CNT-Dox (1,5 mg kg⁻¹) ou Dox livre (20 mg kg⁻¹) a cada três dias por quatro semanas. Marcadores bioquímicos séricos (ALT, AST, ALP, proteína total, albumina) e parâmetros hematológicos (eritrócitos, leucócitos, plaquetas, hemoglobina) foram medidos após o período de tratamento.

Resultados e Discussão

Caracterização das Nanopartículas

Imagens de MEV confirmaram CNTs de paredes múltiplas com diâmetros de 10–60 nm e comprimentos de 20–500 µm. A funcionalização não alterou a morfologia. Medidas de potencial zeta mostraram CNT-Dox (−28 mV), CNT-FITC (−32 mV) e CNTox (−36 mV), indicando boa estabilidade coloidal. Espectros FTIR exibiram bandas características de amida I e II, confirmando ligação covalente de doxorrubicina e fluoresceína aos CNTs.

Citotoxicidade In Vitro

Ensaios MTT revelaram citotoxicidade dependente da dose para CNTox (IC₅₀ ≈ 100 µg mL⁻¹) e CNT-FITC (IC₅₀ ≈ 50 µg mL⁻¹). CNT-Dox exibiu citotoxicidade marcadamente menor na ausência de protease (IC₅₀ > 200 µg mL⁻¹), refletindo o sequestro da doxorrubicina. Quando 0,05% de tripsina foi adicionada, CNT-Dox liberou doxorrubicina livre, produzindo IC₅₀ de ≈ 5 µg mL⁻¹ e diminuição sinérgica na viabilidade celular (≤ 10% do controle). Ensaios de área de colônia confirmaram que CNT-FITC inibiu marcadamente a formação de colônias, enquanto CNT-Dox teve efeito mínimo a menos que tripsina estivesse presente. Em culturas de esferoides 3D, CNTox aumentou o volume do esferoide dependente da dose, enquanto CNT-FITC reduziu o tamanho do esferoide; CNT-Dox não mostrou efeito significativo a menos que a liberação mediada por protease ocorresse.

Toxicidade In Vivo

Análises séricas mostraram que CNTox sozinho não alterou níveis de ALT, AST ou ALP. CNT-Dox e Dox livre aumentaram ambos AST (até 126%) e ALP (até 148%) em relação ao controle, mas as elevações foram menos pronunciadas para CNT-Dox. A proteína total aumentou ligeiramente em todos os grupos de tratamento. A hematologia revelou que Dox livre causou anemia, trombocitopenia e neutropenia, enquanto CNT-Dox produziu mudanças comparáveis, porém mais brandas. CNTox teve impacto negligenciável nas contagens de células sanguíneas. Estes achados sugerem que CNT-Dox mitiga a toxicidade sistêmica enquanto preserva a potência antitumoral.

Conclusão

A funcionalização de CNTs oxidados com doxorrubicina via ligações peptídicas cria um nanocarreador de liberação controlada seguro que reduz a toxicidade sistêmica comparado ao fármaco livre. In vitro, CNT-Dox permanece inerte até clivagem proteolítica, após a qual atinge citotoxicidade potente comparável à doxorrubicina livre. In vivo, CNT-Dox exibe menores elevações de enzimas hepáticas e toxicidade hematológica que Dox livre, enquanto CNTox sozinho é essencialmente não tóxico. Estes resultados apoiam o desenvolvimento adicional de sistemas de entrega baseados em CNTs para agentes anticâncer altamente potentes, particularmente em malignidades gastrointestinais onde a atividade protease pode desencadear liberação direcionada.

Abreviações

Al:

Albumina

ALP:

Fosfatase alcalina

ALT:

Alanina aminotransferase

AST:

Aspartato aminotransferase

CNT-Dox:

Nanotubos de carbono funcionalizados com doxorrubicina

CNT-FITC:

Nanotubos de carbono funcionalizados com fluoresceína

CNTox:

Nanotubos de carbono oxidados

CNTs:

Nanotubos de carbono

Dox:

Doxorrubicina

FTIR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

MTS:

Esferoide tumoral multicelular

MWCNTs:

Nanotubos de carbono de paredes múltiplas

PTX:

Paclitaxel

Tp:

Proteína total