Investigação de ROS e Prisão do Ciclo Celular nos Efeitos Genotóxicos de Nanoestruturas Núcleo de Nanobastão de Ouro/Casca de Prata

Resumo

Para entender a genotoxicidade induzida no fígado por nanopartículas de prata (AgNPs) e íons de prata, uma nanoestrutura engenhada de núcleo de nanobastão de ouro/casca de prata (Au@Ag NR) e células hepáticas humanizadas HepaRG foram usadas neste estudo. O envolvimento de estresse oxidativo e prisão do ciclo celular no dano de DNA e cromossomo induzido por 0,4-20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR foi investigado por ensaio cometa, ensaio γ-H2AX e teste de micronúcleo. Além disso, a distribuição de Au@Ag NR foi analisada. Nossos resultados demonstraram que tanto Ag⁺ quanto Au@Ag NR levaram a clivagem de DNA e dano cromossômico (clastogenicidade) em células HepaRG e que o Au@Ag NR retido no núcleo pode liberar ainda mais Ag⁺, agravando os danos, que são causados principalmente por prisão do ciclo celular e formação de ROS. Os resultados revelam a correlação entre o acúmulo intracelular, liberação de íons Ag⁺ e a potencial genotoxicidade de AgNPs.

Introdução

Nanopartículas de prata (AgNPs), de 1 a 100 nm de tamanho, podem exibir um amplo espectro de propriedades antimicrobianas penetrando patógenos e inativando o grupo sulfidrila interno de suas enzimas metabólicas. Elas demonstraram potentes efeitos bacteriostáticos e bactericidas em Escherichia Coli, Neisseria gonorrhoeae e Chlamydia trachomatis, e são amplamente empregadas como revestimentos médicos, produtos domésticos e curativos de feridas. Evidências convincentes mostram que nanopartículas são capazes de entrar no núcleo e interferir nos processos de síntese e transcrição de DNA. Em nosso estudo anterior, relatamos que uma única dose intravenosa de 5 mg/kg AgNPs poderia introduzir quebra cromossômica notável em células da medula óssea de ratos Sprague-Dawley. Uma única injeção intraperitoneal de 10 mg/kg ou mais de AgNPs induziu tanto dano de DNA quanto cromossômico. Flower et al. sugeriram que AgNPs em doses de 50 e 100 μg mL⁻¹ poderiam desencadear dano de DNA dentro de cinco minutos de administração, destacando a genotoxicidade da prata (Ag) liberada rapidamente. Considerando o risco de exposição excessiva, a investigação de Nanogenotoxicologia ou o dano de DNA e potencial carcinogênico de nanomateriais engenhados recebeu muita atenção.

Os principais mecanismos para lesões genéticas induzidas por AgNPs são considerados a superprodução de espécies reativas de oxigênio, inflamação e distúrbio do ciclo celular. Como sugerido em estudos anteriores, AgNPs poderiam interagir diretamente com DNA via dano oxidativo e interferir na interfase no nível de DNA e mitose no nível cromossômico, ou interagir com nucleoproteína e aparelho fuso mitótico para perturbar pontos de controle do ciclo celular. No entanto, se a genotoxicidade induzida por AgNPs é parcialmente atribuível às nanopartículas ou completamente aos íons Ag⁺ liberados ainda não está claro.

Investigar a genotoxicidade de AgNPs é difícil devido à liberação instável e ininterrupta da prata nos tecidos, levando à dificuldade em localizar as AgNPs e diferenciar o nanonúcleo do Ag. Nosso grupo desenvolveu recentemente uma nanoestrutura de núcleo de nanobastão de ouro/casca de prata (Au@Ag NR) para estudar a toxicidade induzida por nanopartículas. O núcleo de ouro de Au@Ag NR é fisiologicamente inato no tecido e poderia ser usado como padrão interno para monitorar a liberação de íons Ag⁺ da haste monitorando a mudança na razão Ag/Au, medida usando espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente (ICP-MS). Por este método, as diferentes origens das toxicidades podem ser identificadas. Estudos anteriores mostraram que os íons Ag⁺ liberados da casca de Au@Ag NR resultaram em dano oxidativo renal e eventualmente levaram a mudanças morfológicas e prejuízo da função de filtração do glomérulo. Jiang et al. sugeriram que tanto a atividade específica de partícula quanto a liberação intracelular de íons de prata por Au@Ag NR contribuem para a resposta tóxica de células da granulosa. Também adotamos Au@Ag NR como modelo para estudar o potencial genotóxico in vivo de AgNPs e demonstramos que clastogenicidade, e não mutagenicidade, é a forma primária de genotoxicidade induzida tanto pela casca de Ag quanto pelos íons Ag⁺ liberados, enquanto não houve diferença em seus padrões de toxicidade.

O fígado é um dos principais órgãos propensos ao acúmulo de AgNPs e é reconhecido como órgão/tecido alvo para genotoxicidade induzida por AgNPs. Nosso estudo anterior mostrou que alguma quantidade de prata (8,26 ± 3,90 μg/g) e ouro (80,07 ± 64,72 μg/g) permaneceu nos fígados de ratos SD oito semanas após a administração intravenosa de uma dose de Au@Ag NR. Neste estudo, tentamos identificar os papéis de prisão do ciclo celular e estresse oxidativo reativo no dano cromossômico e de DNA induzido por AgNPs usando Au@Ag NR em células HepaRG derivadas de hepatoma humano. Ensaios de genotoxicidade, incluindo ensaio cometa, ensaio γ-H2AX e teste de micronúcleo, foram realizados em paralelo com catador de radicais oxidativos para investigar a contribuição de espécies reativas de oxigênio (ROS) no dano de DNA/cromossomo, enquanto a apoptose celular, ciclo celular e proteínas relacionadas foram determinadas para explorar os mecanismos pelos quais AgNPs interrompem a síntese e replicação de DNA. Além disso, o acúmulo e distribuição intracelular de Au@Ag NR foi investigado combinando espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente (ICP-MS) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para diferenciar o papel de nanopartículas e íons Ag liberados.

Materiais e métodos

Cultura celular e tratamento

Linha celular de hepatoma humano HepaRG (Thermo Fisher Scientific) foi usada neste estudo. As células foram cultivadas em RPMI 1640 contendo 10% soro fetal bovino (FBS, Origem Austrália, Gibco) e 1% solução de penicilina-estreptomicina-glutamina (Gibco) em atmosfera umidificada de 5% CO₂ a 37 °C. As células foram tratadas com concentrações crescentes de Au@Ag NR por 24 h ou 72 h, respectivamente, e as concentrações foram determinadas de acordo com IC₅₀ estimado por ensaio de viabilidade celular. Para investigar o papel de ROS na genotoxicidade, 1 mM N-Acetil-l-cisteína (NAC, Sigma-Aldrich) foi aplicada por 1 h antes do tratamento com Au@Ag NR.

Ensaio de viabilidade/crescimento celular ATP

As células foram semeadas em placa de 96 poços a uma densidade de 5 × 10³/poço. Após 24 h de incubação, o meio foi aspirado e as células foram expostas a diferentes concentrações de Au@Ag NR por 24 h ou 48 h, respectivamente. Um amplo espectro de concentrações foi preparado, e quatro poços por tratamento foram realizados em um período de tratamento. A citotoxicidade de Au@Ag NR foi examinada por ensaio de trifosfato de adenosina (ATP) (CellTiter-Glo® 2.0 Assay, Promega), que mede a atividade metabólica celular quantificando a quantidade de ATP, um parâmetro metabólico importante em células viáveis. Os sinais luminescentes, que refletem as quantidades de células viáveis, foram detectados usando leitor de placa multilabel VICTOR (2030-0050, PerkinElmer), e valores IC₅₀ foram estimados como a concentração de Au@Ag NR para viabilidade metade-máxima pelo Prism 7 (GraphPad Prism 7, CA, EUA). A razão de viabilidade é calculada usando a seguinte equação:

Razão de Viabilidade (%) = RLU_amostra / RLU_veículo × 100%

onde RLU é a unidade de luz relativa representada como valor médio de quatro poços, RLU_veículo representou células não tratadas com nanobastões, e RLU_amostra representou células tratadas com diferentes concentrações de Au@Ag NR.

Determinação da concentração de prata e ouro nas células

As amostras celulares foram digeridas em ácido nítrico usando sistema de digestão por micro-ondas. Após a digestão, as amostras foram preparadas com uma mistura contendo 1% ácido nítrico e ácido clorídrico. As quantidades de Ag e Au nas soluções foram determinadas por ICP-MS (NexION300X, PerkinElmer). Análise TEM foi usada para determinar a presença de Au NR e Au@Ag NR na célula. As amostras celulares foram fixadas em uma mistura de 2,5% glutaraldeído e 2% paraformaldeído por 2 h a 4 °C. Os pelotas celulares foram fixadas e enxaguadas três vezes em tampão fosfato (pH 7,4) e pós-fixadas em 1% tetróxido de ósmio por 2 h a 4 °C. As amostras foram subsequentemente enxaguadas em água destilada três vezes e desidratadas por 15 min em diferentes concentrações de etanol (50%, 70%, 90% e 100% etanol, respectivamente) uma após a outra. Subsequentemente, óxido de propileno em diluições 1:1 e 1:3 foi aplicado à resina a 20-26 °C por 2 h. Polimerização foi realizada por aquecimento graduado a 35 °C por 16 h, 45 °C por 8 h, 55 °C por 14 h e 65 °C por 48 h. Seções ultrafinas foram coradas por 25 min com acetato de uranila e citrato de chumbo e analisadas por microscópio eletrônico de transmissão (H-7650, HITACHI, Japão).

Ensaio cometa convencional e modificado

As células foram semeadas em placas de 12 poços a densidades de 2 × 10⁵/poço ou 3 × 10⁵/poço para tratamento de 24 ou 72 h, respectivamente. Peróxido de hidrogênio (H₂O₂) a uma concentração de 200 μmol foi exposto às células como controle positivo por uma hora. Para cada amostra, dois poços foram preparados para ambos o tratamento convencional e o tratamento com glicosilase de formamidopirimidina (Fpg). Ensaio cometa convencional foi realizado em condições alcalinas (pH > 13) como descrito anteriormente. Para os poços tratados com Fpg, um tratamento adicional de Fpg foi aplicado antes do procedimento de desenrolamento de DNA, e as lâminas foram imersas em um tampão enzimático (0,1 M KCl, 0,5 mM EDTA, 40 mM HEPES, 0,2 mg.mL⁻¹ BSA) três vezes por 5 min cada. O Fpg (New England Biolabs, Inc., UK) foi diluído a 1:50.000 com tampão enzimático. Aliquotas de cem mililitros da enzima diluída foram adicionadas a cada gel nas lâminas do microscópio e incubadas em câmara de umidade a 37 °C por 30 min. As etapas restantes foram as mesmas do tratamento convencional. Os ensaios cometa foram realizados em triplicata. Pelo menos 50 células por amostra foram pontuadas independentemente usando microscópio fluorescente Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tóquio, Japão), enquanto Komet 6.0 (Andor Technology, Belfast, UK) foi usado para analisar o valor médio de porcentagem de DNA na cauda e momento da cauda de oliveira (OTM) de cada amostra.

Qualificação de focos γ-H2AX por citometria de fluxo e triagem de alto conteúdo

Para a quantificação usando citometria de fluxo, as células foram semeadas em placas de 12 poços a densidades de 2 × 10⁵/poço ou 3 × 10⁵/poço para tratamento de 24 ou 72 h, respectivamente, enquanto para o ensaio de triagem de alto conteúdo, as células foram semeadas em placas de 96 poços a densidades de 6 × 10³/poço ou 1 × 10⁴/poço para tratamento de 24 ou 72 h, respectivamente. Como controle positivo, 2 μM metil metanosulfonato (MMS, Sigma-Aldrich) foi aplicado em paralelo com as células por uma hora. As células foram enxaguadas em salina tamponada com tris (TBS) e fixadas com 4% paraformaldeído por 15 min à temperatura ambiente. Após lavagem com TBS, as células foram incubadas com 50 μL metanol gelado a −20 °C por 30 min. As células foram further enxaguadas em TBS três vezes, e o reagente de bloqueio (TBS contendo 0,3% Triton X-100 e 10% soro de cabra) foi aplicado por 1 h. O anticorpo primário (anti-fosfo-H2AX Ser139 de camundongo, Millipore) foi diluído a 1:200 com reagente de bloqueio e incubado com as células durante a noite a 4 °C. A placa foi então novamente enxaguada com TBS três vezes, e o anticorpo secundário (Alexa Fluor 488 anti-camundongo de cabra, Life Technologies), diluído com o reagente de bloqueio na proporção 1:20, foi adicionado subsequentemente. As amostras foram mantidas no escuro à temperatura ambiente por 1 h, e 2 μg mL⁻¹ (20 μL/poço) DAPI (Invitrogen) foi adicionado a cada poço. A fluorescência foi medida usando citometria de fluxo (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, EUA) ou Sistema de Análise de Alto Conteúdo (Operetta CLS, PerkinElmer). Para o ensaio de citometria de fluxo, dados de pelo menos 10.000 células por grupo foram analisados, e os experimentos foram realizados em triplicata; para análise de alto conteúdo, 20 campos visuais em cada poço e pelo menos cinco poços em cada grupo foram analisados.

Ensaio citome de micronúcleo com bloqueio de citocinese (CBMN-cyt)

CBMN-cyt foi realizado de acordo com o procedimento descrito por Fenech et al. As células foram semeadas em placas de 12 poços a densidades de 2 × 10⁵/poço ou 3 × 10⁵/poço para tratamento de 24 ou 72 h, respectivamente. 0,2 μg mL⁻¹ Mitomicina C (MMC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Japão) foi exposto às células como controle positivo por 24 h. 3 μg mL⁻¹citoalasina B foi aplicada após tratamento de 24 ou 72 h para bloquear o processo de citocinese, e as células foram colhidas após 40 h. As amostras foram coradas com 5% Giemsa após hipotonicidade com 0,075 mol L⁻¹ KCl pré-aquecido e fixação com mistura 3:1 de metanol e ácido acético. Poços triplicados por grupo foram preparados, e pelo menos 1000 células binucleadas por poço foram examinadas.

Medição de MDA, GSH total e SOD

As células foram cultivadas em placas de 12 poços a densidades de 5 × 10⁵/poço ou 3 × 10⁵/poço para tratamento de 24 ou 72 h, respectivamente. Subsequentemente, as células foram colhidas e enxaguadas três vezes com tampão fosfato salino (PBS). As quantidades de malondialdeído (MDA) nos homogeneizados celulares foram determinadas usando método baseado em ácido tiobarbitúrico (Nanjing Jiancheng Bio-engineering Institute, Nanjing, China). As quantidades de glutationa total (GSH) e superóxido dismutase (SOD) foram determinadas usando kits de quantificação de glutationa total e ensaio SOD (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kumamoto, Japão), respectivamente. Densidades ópticas (O.D) de cada poço foram medidas usando leitor de placa multilabel VICTOR (2030-0050, PerkinElmer).

Análise citométrica de fluxo para ciclo celular

As células foram cultivadas em placas de 6 poços a densidades de 1 × 10⁶/poço ou 5 × 10⁵/poço para tratamento de 24 ou 72 h, respectivamente, e foram subsequentemente fixadas com 70% etanol a 4 °C durante a noite. As amostras foram enxaguadas com PBS três vezes e coradas com tampão de coloração PI/Rnase (BD Biosciences) por 15 min à temperatura ambiente. Populações celulares sob fases G0/G1, S e G2/M entre 20.000 células foram determinadas empregando regiões com área FL2 versus largura FL2. Análise foi feita por citometria de fluxo (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, EUA) e FlowJo (BD Bioscience), e os experimentos foram realizados em triplicata.

Análise citométrica de fluxo de apoptose celular

As células foram cultivadas em placas de 6 poços a densidades de 1 × 10⁶/poço ou 5 × 10⁵/poço para tratamento de 24 ou 72 h, respectivamente. Elas foram subsequentemente enxaguadas duas vezes com PBS e diluídas com 500 μL 1 × tampão de ligação (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Bioscience) para ajustar a suspensão para cerca de 1 × 10⁶ células/mL, e subsequentemente 100 μL diluição foi misturada com 5 µL FITC Annexin V e 5 µL PI. As amostras foram coradas à temperatura ambiente por 15 min, e pelo menos 10.000 células foram analisadas para determinar a população celular sob apoptose precoce e tardia empregando regiões com FL1H versus FL2H usando citometria de fluxo (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, EUA) e FlowJo (BD Bioscience). Os experimentos foram realizados em triplicata.

Análise de Western blot

As células foram cultivadas em frasco de 75 cm² a densidades de 1 × 10⁷/poço e 6 × 10⁶/poço para tratamento de 24 e 72 h, respectivamente. As células foram lisadas com tampão de lise RIPA contendo inibidor de protease (PMSF), e a concentração de proteínas foi determinada usando kit de quantificação de proteína BCA (Beyotime Biotechnology, China). As concentrações das amostras foram ajustadas usando tampão de lise RIPA antes da desnaturalização por aquecimento a 95 °C por 3 min. As amostras de proteína foram separadas por eletroforese em géis de poliacrilamida SDS 12% e transferidas para membranas de nitrocetulose (Millipore). As membranas foram bloqueadas com 5% leite desnatado por 30 min e incubadas com anticorpos primários p53 (SC-137174, Santa Cruz), p21 (SC-6246, Santa Cruz) e β-actina (sc-47778, Santa Cruz) e anticorpos secundários cabra anti-camundongo IgG(H+L)-HRP (SE131, solabio), respectivamente. Os níveis de expressão das proteínas alvo nas amostras foram visualizados usando método de quimioluminescência aprimorada (ECL) e analisados pelo sistema ImageJ (National Institutes of Health).

Análises estatísticas

Os dados foram apresentados como média ± SEM. Análise de variância unidirecional (ANOVA) foi usada para testar significância estatística de diferenças entre controle negativo e grupos tratados, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett usando SPSS (versão 22, IBM, Armonk, NY, EUA), e dados foram considerados estatisticamente significativos a P < 0,05. As figuras foram preparadas usando GraphPad Prism 7 para Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA).

Resultados

Caracterização de Au NR e Au@Ag NR

Nanobastões de ouro (Au NRs), núcleos de nanobastão de ouro e nanoestruturas de casca de prata (Au@Ag NR) foram engenhados, preparados e caracterizados como descrito anteriormente. Brevemente, os diâmetros médios e comprimentos são 15,0 ± 2,5 nm, 66,7 ± 2,5 nm para Au NRs e 26,2 ± 3,0 nm, 72,7 ± 8,9 nm para Au@Ag NRs. A espessura da casca de Ag é cerca de 5 nm. Os potenciais zeta de Au NRs e Au@Ag NRs revestidos com PDDAC dispersos em água foram 37,7 ± 1,6 mV e 52,5 ± 1,4 mV, respectivamente. A razão de peso Ag/Au de Au@Ag NR preparado foi estimada como 2,3. Os resultados de caracterização são mostrados.

Viabilidade celular

A citotoxicidade de Au@Ag NR para células HepaRG foi investigada por ensaio de viabilidade ATP, e as células foram expostas a Au@Ag NR por 24 ou 48 h em concentrações variando de 0,125 a 160 μg mL⁻¹. Au@Ag NR induziu efeitos citotóxicos significativos de maneira dependente de tempo e dose após exposição de 24 e 48 h, com % viabilidade IC₅₀ a 20 µg mL⁻¹ e 6 µg mL⁻¹, ajustados pelo software GraphPad Prism 7.0, respectivamente. Considerando a citotoxicidade geral, os períodos de tratamento foram ajustados para 24 h e 72 h, enquanto as concentrações aplicadas foram determinadas como 0,8 µg mL⁻¹, 4 µg mL⁻¹ e 20 µg mL⁻¹. Além disso, Au NR foi incluído como controle inerte, e o conteúdo de Au no grupo AuNR foi o mesmo que 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR, que é 16 µg mL⁻¹. Em contraste, 1 mM NAC pré-tratamento foi adotado no grupo Au@Ag NR + NAC como controle para resposta de estresse oxidativo (a concentração de Au@Ag NR é 20 µg mL⁻¹).

Distribuição celular de Au NR e Au@Ag NR

A distribuição de conteúdo de Au e Ag nas células HepaRG foi analisada por ICP-MS. O conteúdo de Ag aumentou de maneira dependente de dose. No entanto, o antioxidante N-Acetil-l-cisteína (NAC) como catador de radicais livres pode restringir a captação celular de nanopartículas, pois menor conteúdo de Ag foi observado mesmo que a mesma concentração de Au@Ag NR (20 µg mL⁻¹) foi aplicada neste grupo. O declínio na razão Ag/Au de 24 para 72 h indicou uma liberação contínua de Ag⁺ da casca de Au@Ag NR. Além disso, a captação celular de Ag é muito maior que Au. Além disso, dados TEM mostraram que a maioria dos Au NR e Au@Ag NR foram retidos nas células como aglomerados. As estruturas de nanobastões foram claramente vistas dentro das células submetidas à exposição de Au NR ou Au@Ag NR sem entrar no núcleo.

Dano de DNA

O dano de DNA desencadeado por Au@Ag NR foi avaliado por ambos ensaio cometa e ensaio γH2AX. Observou-se do ensaio cometa que 0,8 a 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR poderia introduzir dano de DNA significativo. Após exposição de 24 ou 72 h a Au@Ag NR, tanto % DNA na cauda quanto OTM de células aumentaram de maneira dependente de tempo e concentração. Além disso, dano de DNA associado à indução de estresse oxidativo foi observado nas células tratadas com 20 µg mL⁻¹ Au@Ag NR pelo ensaio cometa modificado com enzima Fgp. Para avaliar a extensão de quebra de fita dupla que representa uma correlação mais alta com a gênese do câncer, tanto células positivas para γ-H2AX quanto intensidades médias de fluorescência em células positivas para γ-H2AX foram analisadas. Após exposição de 24 h a Au@Ag NR, nenhuma diferença foi encontrada entre grupos em células positivas para γ-H2AX. No entanto, grupo 4 μg mL⁻¹ Au@Ag NR causou aumento significativo após tratamento de 72 h. Aumentos significativos em intensidades de fluorescência foram observados em todos os grupos Au@Ag NR após 72 h comparados com o controle veículo.

Dano cromossômico

A formação de micronúcleos é um biomarcador significativo para identificar dano cromossômico, que é um dano mais crítico ao material genético que quebra de DNA. A razão de células binucleadas contendo micronúcleo foi pontuada. Au@Ag NR aumentou a formação de micronúcleos em um padrão dependente de concentração. Após exposição de 24 h, as razões de micronúcleo observadas em células tratadas com 4 μg mL⁻¹ Au@Ag NR e 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR foram 1,133 ± 0,145% e 1,567 ± 0,318%, respectivamente, ambas significativamente maiores que as do grupo controle veículo. Após exposição de 72 h, a razão de micronúcleo em células tratadas com 4 μg mL⁻¹ Au@Ag NR foi 1,767 ± 0,233%, significativamente maior que o grupo controle veículo; a razão de micronúcleo em células tratadas com 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR foi 2,167 ± 0,252%, significativamente maior que as observadas em ambos grupo controle veículo e grupo 16 μg mL⁻¹ Au NR (0,700 ± 0,153%). Em contraste, nenhuma diferença foi encontrada entre células tratadas com 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR + NAC e controle veículo, sugerindo a participação de ROS na quebra cromossômica induzida por Au@Ag NR.

Efeitos de Au@Ag NR na Formação de ROS

Para explorar ainda mais o papel da formação de ROS no dano de DNA e cromossomo induzido por Au@Ag NR, níveis de MDA, GSH e SOD foram estimados. Um aumento significativo na formação de MDA (P < 0,05) foi observado após exposição a 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR por ambos 24 e 72 h. Além disso, os níveis de GSH e SOD em células expostas a Au@Ag NR mostraram redução significativa (P < 0,05) de maneira dependente de tempo e concentração. Esses resultados sugeriram um desequilíbrio entre oxidação e anti-oxidação, gerado pela exposição a Au@Ag NR.

Efeitos de Au@Ag NR no ciclo celular e apoptose

Após exposição de 72 h a Au@Ag NR, o aumento no número de células na fase G2/M foi observado em 4 μg mL⁻¹ Au@Ag NR, 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR e grupo Au@Ag NR + NAC, com proporções de 32,63% ± 1,77%, 32,267% ± 2,17% e 32,967% ± 4,25%, respectivamente, que foram significativamente maiores que as do grupo controle veículo (22,37% ± 0,92%). Enquanto isso, apoptose celular induzida por Au@Ag NR pôde ser observada após exposição de 72 h, e a taxa de apoptose tardia de células tratadas com 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR e 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR + NAC foi 78,90 ± 1,19% e 70,20 ± 4,50%, respectivamente. Au@Ag NR induziu mais apoptose tardia que precoce, e o tratamento de NAC pôde aliviar a taxa de apoptose tardia desencadeada por Au@Ag NR.

Os níveis de expressão de p21 e p53 foram detectados por Western blots, e um padrão similar foi observado. Os níveis de expressão de p53 e p21 em células tratadas com 4 μg mL⁻¹ e 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR foram marcadamente aumentados (P < 0,05) e foram significativamente diminuídos em células tratadas com ambos 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR e NAC (P < 0,05, comparado com grupo 20 μg mL⁻¹ Au@Ag NR). Sabe-se que a proteína p53 é uma molécula central mediando ativação do ponto de controle G2/M em resposta a dano de DNA, e p21 é reconhecida como inibidor de ciclo celular dependente de p53. Assim, o Au@Ag NR poderia interferir com a replicação de DNA e dificultar o reparo de DNA pela prisão do ciclo celular.

Discussão

Atualmente, os papéis dos Ag⁺ liberados e AgNPs na geração de genotoxicidade estão longe de ser claros. Estudos anteriores do nosso grupo e outros demonstraram que enquanto Ag⁺ é a principal fonte para introduzir toxicidades, nanopartículas também poderiam ser altamente tóxicas. Por exemplo, AgNPs poderiam contribuir para a genotoxicidade induzindo a formação de radicais hidroxila. Além disso, dano cromossômico mais severo, estresse oxidativo e apoptose foram introduzidos por AgNP comparado a Ag⁺ sozinho, sugerindo que diferentes vias podem estar envolvidas. Empregamos Au@Ag NR como material modelo para entender as formas e distribuições de AgNPs nas células, e as quantidades de Ag e Au intracelulares foram determinadas por ICP-MS. A razão de peso Ag/Au de Au@Ag NR preparado foi estimada como 2,3. No entanto, após exposição de 24 h, ela aumentou acentuadamente para 16,5 nas células tratadas com Au@Ag NR, sugerindo que grande quantidade de Ag foi liberada da casca de Au@Ag NR dentro desse período. Quando o período de exposição de Au@Ag NR foi estendido para 72 h, a razão de peso Au/Ag diminuiu para 1,7, indicando que o Ag⁺ foi liberado da célula e o nanobastão foi a forma principal de Au@Ag NR na célula naquele estágio. Portanto, pode-se deduzir que uma vez que Au@Ag NR entrou na célula, Ag⁺ se dissolveu rapidamente de sua casca dentro de 24 h e gradualmente liberado para o ambiente extracelular, enquanto o próprio Au@Ag NR retido na célula por um período mais longo.

Estresse oxidativo é considerado um dos mecanismos toxicologicos mais importantes de nanopartículas. N-acetilcisteína (NAC) é um tiol, um agente mucolítico e precursor de l-cisteína que reduz glutationa. NAC também é uma fonte de grupos sulfidrila nas células e exerce atividade de catador de ROS interagindo com OH^· e H₂O₂. Neste estudo, os níveis de GSH e SOD foram significativamente diminuídos após exposição a Au@Ag NR, enquanto o nível de MDA aumentou de maneira dependente de concentração e tempo, indicando que Au@Ag NR introduziu estresse oxidativo nas células.

Os potenciais de Ag e Au@Ag NR em interferir com o material genético foram investigados por uma série de ensaios de genotoxicidade. É notável que co-cultivar NAC com Au@Ag NR pôde amenizar a formação de ROS, que por sua vez apoia a participação de estresse oxidativo na genotoxicidade desencadeada por Au@Ag NR. Neste estudo, ensaios cometa e γ-H2AX foram realizados para confirmar que Au@Ag NR poderia interagir com DNA e induzir certo dano de DNA, e a endonuclease de reparo Fpg foi incluída no ensaio cometa para identificar o dano oxidativo de DNA. O Fgp pôde reconhecer pirimidinas oxidadas e remover purinas oxidadas, por exemplo, 8-hidroguanina, de modo a criar sítios apurínicos ou apirimidínicos que poderiam introduzir lacunas nas fitas de DNA. O dano de fita de DNA induzido por estresse oxidativo pôde ser determinado subsequentemente por outro ensaio cometa. Mei et al. observaram que AgNPs de 5 nm induziram dano de DNA específico de lesão oxidativa empregando endonucleases hOGG1, EndoIII e Fpg no ensaio cometa. Li et al. também sugeriram que tanto AgNPs revestidos com PVP quanto sílica (15-100 nm e 10-80 nm, respectivamente) poderiam levar a aumento significativo em quebra de DNA em hepatócitos de camundongos na presença de hOGG1 e EndoIII. A formação de focos γ-H2AX, que representa uma resposta celular precoce ao estresse genotóxico, é o biomarcador mais sensível e específico para detectar DSBs. Como demonstrado neste estudo, focos γ-H2AX em células expostas a Au@Ag NR foram marcadamente aumentados após 24 h, e um aumento adicional pôde ser observado após 72 h. A redução no grupo 20 µg mL⁻¹ pode ser devida à citotoxicidade às células HepaRG em concentração mais alta. Resultados similares foram observados para AgNPs com diferentes revestimentos. Além disso, nossos resultados sugerem que Au@Ag NR poderia induzir dano cromossômico em células HepaRG, pois as taxas de micronúcleo foram significativamente aumentadas. Isso é consistente com estudos anteriores, onde aumento de taxa de micronúcleo induzido por AgNPs foi relatado em células HaCaT e TK6. Em contraste, a adição de catador de radicais oxidativos NAC pôde inibir a formação de micronúcleo induzida por Au@Ag NR. Juntos, estes dados sugerem a participação de estresse oxidativo no risco de clastogenicidade introduzido por AgNP in vitro.

Estudos anteriores investigaram a prisão do ciclo celular e citotoxicidade induzidas por AgNPs. Com o prolongamento do tempo de exposição, o impacto de AgNPs no ciclo celular e apoptose pode ser aprimorado e por sua vez agravar a citotoxicidade e genotoxicidade. Geralmente, os pontos de controle do ciclo celular (ex: G2/M) foram iniciados pelas células quando experimentando dano de DNA, e este mecanismo serve para impedir a célula de entrar na mitose (fase M). A prisão do ciclo celular G2/M indica que uma porcentagem crescente de células é impedida na fase G2 para reparo de DNA. Células experimentando reparo de DNA bem-sucedido prosseguiriam para mitose; no entanto, para aquelas com danos fatais, prisão irreversível do ciclo celular G2/M e apoptose celular ocorreriam. Observamos que Au@Ag NR pôde prender a maioria das células HepaRG na fase G2/M, induzir apoptose tardia e aumentar os níveis de expressão de p53 e p21, que são proteínas importantes associadas à regulação de ciclos celulares. Como p53 também pode induzir apoptose, quando o DNA não pode ser reparado propriamente, p21 pode participar indiretamente na apoptose celular por prisão do ciclo celular em uma via dependente de p53 via down-regulação da proteína nuclear ICBP90 para replicação de DNA e regulação do ciclo celular. Além disso, apoptose e prisão G2/M induzidas por ativação do sistema p53/p21 foram relatadas em células HepG2 após administração de extratos de alho. Assim, pode-se inferir que o dano de DNA/cromossomo desencadeado por estresse oxidativo pode facilitar a expressão de p53 e p21, que subsequentemente induz prisão do ciclo celular. Estender o período de exposição de Au@Ag NRs ao DNA/cromossomo durante a replicação pode agravar ainda mais a genotoxicidade ou apoptose.

Conclusão

Genotoxicidade induzida por AgNPs pode ser atribuída ao estresse oxidativo induzido pelas nanopartículas bem como aos íons liberados. Este estudo empregou Au@Ag NR como modelo para determinar a distribuição e comportamento de liberação de Ag após as nanopartículas entrarem nas células. Considerando as formas díspares de Au@Ag NR na célula, após sua exposição o Ag⁺ foi rapidamente dissolvido da casca de prata. Ag⁺ e Au@Ag NR poderiam introduzir citotoxicidade e genotoxicidade (clastogenicidade) nas células, e o Au@Ag NR retido no núcleo pode liberar ainda mais Ag⁺ para agravar o dano, que são causados principalmente por prisão do ciclo celular e formação de ROS (resumido na figura). Coletivamente, estes dados revelam a correlação entre o acúmulo intracelular, liberação de Ag⁺ bem como a potencial genotoxicidade de AgNPs.

Disponibilidade de dados e materiais

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