Sistema fototérmico / pH de entrega de medicamento de resposta dupla de rGO modificado por HBP com terminação amino e terapia quimio-fototérmica em células tumorais

Resumo

Neste artigo, um método simples para preparar óxido de grafeno reduzido hidrofílico (rGO) foi proposto através da redução de GO por polímero hiper-ramificado terminado em amino (NHBP), o NrGO como preparado poderia apresentar excelente dispersibilidade, absorvância de luz infravermelha próxima (NIR), fototérmica capacidade de conversão e estabilidade. Em seguida, o cloridrato de doxorrubicina (DOX) foi conjugado com NrGO para preparar o sistema de carregamento de fármaco, e um comportamento de liberação de fármaco de resposta dupla fototérmica / pH foi caracterizado. Em ambiente ácido ou sob irradiação com laser NIR, a taxa de liberação do fármaco pode ser melhorada, o que é benéfico para controlar a liberação do fármaco antitumoral em tecidos tumorais. Além disso, os experimentos com células in vitro revelaram que NrGO era bem biocompatível e, na parte de inibição do tumor, em comparação com o grupo de controle sem qualquer tratamento, DOX @ NrGO ganhou uma terapia sinérgica quimio-fototérmica eficiente, cuja taxa de inibição foi muito maior do que a quimioterapia única de DOX liberado. Portanto, o DOX @ NrGO preparado obteve grande potencial de aplicação na terapia de tumor e um excelente candidato em outras aplicações biomédicas.

Introdução

A terapia fototérmica (PTT) sob irradiação no infravermelho próximo (NIR) tem chamado a atenção para a inibição do tumor, devido ao pouco efeito colateral e propriedades invasivas mínimas [1]. A luz NIR (700 ~ 1100 nm) penetra mais profundamente no tecido corporal sem muita absorção, qualquer dano ao tecido saudável ou às células [2, 3]. Assim, sob irradiação de laser NIR, o agente fototérmico pode aumentar a temperatura no local implantado por meio de sua capacidade de conversão fototérmica. Além disso, o agente fototérmico aplicado requer boa biocompatibilidade, eficácia de conversão fototérmica e estabilidade.

Para pesquisas dos últimos anos, vários materiais foram projetados e preparados para curar tecidos tumorais como agentes PTT, como metais preciosos (nanobastões de ouro [4], nanoplacas de ouro [5]), nanomateriais semicondutores (CuS [6], MoS ₂ [7], FeS [8]), materiais orgânicos (polidopamina [9], nanopartículas de polipirrol [10]), nanomateriais de carbono (nanotubo de carbono [11], nanopartículas de carbono [12] e grafeno [13]). Como um tipo de nanomaterial de carbono promissor, o grafeno foi amplamente utilizado na inibição de tumores através do método PTT devido às suas nanofolhas bidimensionais especiais, que obtêm área de superfície específica ultra-alta e grande potencial para alta eficiência de carregamento de fármaco [14, 15]. No entanto, o óxido de grafeno reduzido (rGO) preparado por meio de métodos normais incluindo ureia e hidrato de hidrazina, o processo hidrotérmico sempre mostra alta hidrofobicidade, o que não é benéfico para a aplicação no fenômeno da água do tecido corporal [16].

Neste caso, propusemos uma nova ideia de usar polímero solúvel em água com capacidade redutiva para preparar rGO hidrofílico. Em nosso trabalho anterior, sintetizamos polímero hiper-ramificado terminado em amino (NHBP) e tentamos usá-lo para tratar nanopartículas de óxido metálico e preparar nanoesferas de metal, que são altamente hidrofílicas sem aglomeração óbvia, como nanopartículas de prata modificadas com HBP e sua aplicação em anti -bactérias campo [17, 18].

A fim de melhorar a capacidade de inibição do tumor, drogas antitumorais são geralmente carregadas em agentes fototérmicos para fabricar sistema carregado de droga [19]. Por outro lado, o agente fototérmico pode apresentar efeito PTT sob irradiação com laser NIR. Por outro lado, a temperatura elevada pode acelerar a taxa de entrega da droga devido à taxa de movimento molecular melhorada. Assim, o agente fototérmico carregado com a droga pode exercer efeito de terapia sinérgica quimio-fototérmica para a inibição do tumor [20, 21]. Aqui, usamos HBP terminado em amino para preparar rGO hidrofílico (NrGO, Fig. 1), e as propriedades físico-químicas, bem como a capacidade fototérmica foram caracterizadas. Posteriormente, o fármaco antitumoral (doxorrubicina, DOX) foi incorporado ao NrGO e, em seguida, o comportamento de administração do fármaco em diferentes condições e a eficácia de inibição do tumor foram testados in vitro.

Métodos / Experimental

Materiais

Óxido de grafeno (GO, 0,8 ~ 1,2 nm de espessura e 0,5 ~ 5 μm de largura) foram fornecidos por XFNANO Co., Ltd. DOX foram adquiridos de HuaFeng United Technology Co., Ltd. Dulbecco's Modificado Eagle's medium (DMEM), fetal bovino soro (FBS), tripsina, penicilina (100 U / ml) e estreptomicina (100 μg / ml) foram todos adquiridos na Thermo Fisher Scientific Inc. Metiltiazolil tetrazólio (MTT), 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI ) e iodeto de propídio (PI) foram obtidos de Beyotime Biotechnology Co., Ltd. Todos os outros reagentes foram adquiridos de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. sem purificação adicional.

Preparação de polímero hiper-ramificado com terminação amino (NHBP)

O polímero hiper-ramificado com terminação amino foi sintetizado como nosso trabalho anterior [16]. Tetraetilenopentamina (94 ml, 0,5 mol) foi adicionada a um frasco de vidro de fundo redondo de três gargalos de 250 ml equipado com proteção de gás nitrogênio e agitação magnética. A mistura reaccional foi agitada com um agitador magnético de aquecimento e arrefecida com um banho de gelo, enquanto uma solução de acrilato de metilo (43 ml, 0,5 mol) em metanol (100 ml) foi adicionada gota a gota ao frasco. Em seguida, a mistura foi removida do banho de gelo e deixada em agitação por mais 4 h em temperatura ambiente. A mistura foi transferida para um frasco em forma de berinjela para evaporação rotativa automática a vácuo e a temperatura foi elevada para 150 ° C usando um banho de óleo, e deixada por 4 h até que uma escala de HBP viscosa amarelada fosse obtida com um peso molecular médio ponderal de cerca de 7759 .

Preparação de GO Reduzido por NHBP (NrGO)

GO foi primeiro disperso em água desionizada e ultra-sônico misturado com HBP apropriado (razão em peso de GO e NHBP é 1:10, 1:20 e 1:30) por 10 min, mantido em agitação e reagiu sob 90 ° C por 1 h. Em seguida, o resultante (marcado como NrGO-10, NrGO-20 e NrGO-30) foi centrifugado e lavado com água desionizada por três vezes.

Preparação de DOX-Loaded NrGO (DOX @ NrGO)

A suspensão de NrGO preparada foi dispersa em solução DOX com proporção de peso de 1:1, e mantida em agitação por 24 h em temperatura ambiente. Em seguida, a solução composta foi centrifugada e lavada para coletar DOX @ NrGO.

Medições

A morfologia da superfície foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, JEM-2100, JEOL, Japão). A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR, Nicolet iS10, Thermo Scientific, America) foi realizada para ilustrar a mudança do componente químico entre GO e NrGO. Todos os espectros foram medidos em uma faixa de comprimento de onda de 400 ~ 4000 cm ⁻¹ com uma resolução de 4 cm ⁻¹ . O potencial de superfície e o tamanho de partícula foram investigados através do analisador potencial Zeta-tamanho de partícula (NanoBrook 90plus Zeta, Brookhaven, EUA). A absorção de NrGO na região NIR foi estudada por UV-vis (Evolution 300, Thermo Fisher, EUA) com faixa de comprimento de onda de 400 ~ 900 nm e resolução de 1 cm ⁻¹ .

As propriedades fototérmicas foram medidas usando um dispositivo a laser NIR (SFOLT Co., Ltd., Shanghai, China) e um termômetro termopar (DT-8891E, Shenzhen Everbest Machinery Industry Co., Ltd., China). A propriedade fototérmica do NrGO foi medida sob irradiação de laser de 808 nm. A área pontual do laser é de cerca de 0,25 cm ² , e a mudança de temperatura da suspensão da amostra testada foi monitorada em tempo real. Aqui, água pura e suspensão de GO foram aplicadas como grupos de controle:(1) 0,2 ml de água pura, GO e suspensão de NrGO (NrGO-10, NrGO-20 e NrGO-30) foram colocadas em tubo Eppendorf de 0,25 ml e, em seguida, NIR o laser foi irradiado com densidade de potência de 1 W / cm ² por 5 min; (2) 0,2 ml de suspensão de NrGO-30 com concentração diferente (100, 200 e 300 μg / ml) foi irradiado (1 W / cm ² ) por 5 min; (3) 0,2 ml de suspensão de NrGO-30 (200 μg / ml) foi irradiado com densidade de potência diferente (1, 1,5 e 2 W / cm ² ) por 5 min; (4) 0,2 ml de suspensão de NrGO-30 (200 μg / ml) foi irradiada (1 W / cm ² ) por três ciclos liga / desliga.

O DOX @ NrGO coletado foi dividido em três grupos para diferentes tratamentos para investigar o comportamento de liberação do fármaco:(1) dispersão em solução de PBS com pH =7,4, marcado como grupo controle; (2) dispersão em solução de PBS com pH =4,0, marcado como grupo ácido; (3) dispersar em solução de PBS com pH =7,4 e irradiado com laser NIR, marcado como grupo NIR. Os três grupos anteriores (cada grupo foi definido como três paralelos) foram colocados em um saco de diálise (5 ml) com peso molecular de corte de 8000 e, em seguida, colocados em tubo de centrifugação com 20 ml de solução de PBS correspondente. Depois disso, todos os tubos foram colocados em um agitador a 37 ° C com 100 rpm, 10 ml de solução de PBS de cada tubo foram retirados em pontos de tempo predeterminados para a análise de liberação do fármaco e igual volume de PBS fresco correspondente foi adicionado de volta. Além disso, o grupo NIR foi tratado como se a luz NIR fosse irradiada por 5 min após cada ponto de tempo predeterminado. Todas as soluções retiradas foram analisadas por espectrofotometria UV-vis, e o perfil de liberação do fármaco foi obtido.

A citotoxicidade do NrGO contra células tumorais (HeLa) foi investigada pelo ensaio MTT. Resumidamente, as células HeLa foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 × 10 ³ células por poço e incubadas até 80% do poço estar coberto. Em seguida, o meio antigo foi trocado por meio fresco com NrGO (3,125, 6,25, 12,5, 25 e 50 μg / ml), o meio sem NrGO foi definido como grupo de controle. Após incubar por 24 e 48 h, o ensaio MTT foi usado para medir a viabilidade celular relativa através da Eq. (1):
$$ \ mathrm {Cell} \ kern0.17em \ mathrm {viability} \ left (\% \ right) =\ frac {{\ mathrm {OD}} _ {\ mathrm {amostra}}} {{\ mathrm {OD }} _ {\ mathrm {control}}} \ times 100 \% $$ (1)
onde OD _amostra e OD _controle representou a absorbância medida de células tratadas com NrGO em diferentes concentrações e grupo controle, respectivamente.

Em seguida, a terapia sinérgica quimio-fototérmica foi investigada através do tratamento de células HeLa com DOX @ NrGO (3,125, 6,25, 12,5, 25 e 50 μg / ml) sob irradiação NIR. Após incubação com DOX @ NrGO por 4 h, as células HeLa foram irradiadas com laser NIR por 5 min e incubadas por mais 20 h. Posteriormente, a viabilidade celular foi testada através do ensaio MTT novamente. Para a observação das células, as células HeLa foram então coradas com DAPI e PI, respectivamente, e observadas sob CLSM e microscópio de fluorescência.

Resultados e discussão

Caracterização Física e Química

Após reagir com NHBP, a solução GO mudou para preto de marrom, indicando que GO foi reduzido com sucesso para rGO e dispersível em água. Como mostrado na Fig. 2a, b, imagens TEM de GO e NrGO-30 foram exibidas respectivamente, enquanto nenhuma crispação ou aglomeração óbvia foi descoberta em NrGO, revelando que o tratamento com HBP não causaria qualquer alteração na morfologia na redução da reação. Com base nos espectros de FT-IR na Fig. 3, a curva de transmitância do NrGO-30 era muito semelhante à do NHBP. Significativamente, o pico em 1725 cm ⁻¹ de GO desapareceu após a reação de redução, que foi sugerida como sendo a absorção de vibração de C =O do grupo carboxi [22]. De acordo com a estrutura molecular do NHBP terminado em amino, o grupo amino redutor reagiu com GO e um novo pico de FT-IR foi gerado a 1633 cm ⁻¹ , que supostamente é C-N da ligação amido. O resultado do potencial zeta foi apresentado na Fig. 4, obviamente, todas as amostras de NrGO eram potenciais positivas enquanto que o GO era negativo, indicando que o grupo carboxi do GO reagiu com o grupo amino de HBP. Os espectros de UV-vis-NIR (Fig. 5) foram usados para ilustrar a absorção de NIR de NrGO; as curvas das amostras NrGO com diferentes proporções de matérias-primas apresentaram tendência semelhante com alta absorção na região NIR, o que é benéfico para a aplicação em PTT. Considerando que a solução GO e HBP quase não mostrou absorção na região NIR, sugerindo a fabricação bem-sucedida do agente fototérmico de GO e NHBP. Além disso, o tamanho nanométrico de NrGO também foi medido (Fig. 6), o que não mostrou mudança óbvia com o aumento da proporção de NHBP.

Medição das propriedades fototérmicas

Com base no NrGO obtido, as propriedades fototérmicas foram investigadas sob irradiação de laser de 808 nm. Conforme mostrado na Fig. 7, as curvas de aquecimento da água, GO e NrGO apresentaram tendências diferentes. A temperatura da água pura quase não apresentou crescimento, e o GO subiu apenas abaixo de 5 ° C, enquanto o NrGO melhorou até 40 ° C e o NrGO-20 e o NrGO-30 atingiram até mesmo acima de 45 ° C. O NrGO pode absorver o laser NIR para desencadear o comportamento fototérmico, e a eficácia da conversão fototérmica foi melhorada com o aumento da proporção de HBP; portanto, NrGO-30 foi escolhido para completar a seguinte investigação. Conforme ilustrado na Fig. 7b, c, a temperatura atingida foi aumentada com a concentração de NrGO ou aumento da potência do laser, e o último fator afetou mais fortemente. 41–43 ° C provou ser apropriado na inibição de células tumorais com pouco efeito negativo nas células normais; assim, o NrGO preparado poderia atender aos requisitos de PTT em uma dosagem baixa e pó de laser. Em seguida, a estabilidade fototérmica foi testada e mostrada na Fig. 7d, não há diferença óbvia após três ciclos liga / desliga. Assim, o NrGO obteve ótimas propriedades fototérmicas na região do NIR. Para confirmar a estabilidade de absorção do NrGO antes e depois da irradiação do laser NIR, os espectros de UV-vis foram mostrados na Fig. 8. Obviamente, a curva não mudou após a irradiação NIR, revelando que a irradiação NIR não afetaria a absorção de NrGO.

Teste de comportamento de administração de drogas

Depois que o DOX foi carregado no NrGO, o experimento de entrega da droga foi realizado. Devido ao ambiente ligeiramente ácido do tecido tumoral, a influência da irradiação NIR e do pH foram estudados. Aqui, PBS com pH de 7,4 ou 4,0 foi aplicado para imitar o tecido normal ou tumoral, respectivamente. Como mostrado na Fig. 9, a taxa de entrega da droga foi obviamente acelerada sob baixo pH e irradiação NIR. Por outro lado, o grupo amino de NrGO seria ionizado sob baixo valor de pH, então a força repulsiva entre DOX e os grupos amino ionizados seria melhorada sob condição de baixo pH, o que acelerou a liberação do fármaco e apresentou sensibilidade ao pH. Além disso, a boa solubilidade da DOX em condições de baixo pH também pode aumentar a taxa de liberação da droga [23]. Por outro lado, com a irradiação do laser NIR, a temperatura local foi elevada e a taxa de movimento molecular acelerada. Assim, o DOX @ NrGO foi sensível ao pH / fototérmico no comportamento de administração do fármaco, o que é benéfico para controlar a taxa de administração do fármaco no tecido tumoral e exerceu terapia sinérgica quimio-fototérmica.

Citotoxicidade de NrGO

A biocompatibilidade é a propriedade básica exigida em biomateriais; assim, a citotoxicidade de NrGO com diferentes concentrações foi inicialmente testada durante o experimento in vitro via ensaio de MTT. Como mostrado na Fig. 10a, os resultados do ensaio de MTT de 24 h indicaram que a viabilidade celular permaneceu mais de 80% quando a concentração de NrGO atingiu 50 μg / ml, o que pode provar que NrGO era bem biocompatível e considerado como agente de PTT biocompatível promissor em tumor inibição.

Inibição sinérgica de DOX @ NrGO em células tumorais

Com base na biocompatibilidade de NrGO, a eficácia de inibição tumoral de DOX @ NrGO foi estudada in vitro. A fim de examinar a influência do comportamento fototérmico, o laser NIR foi irradiado nas células tumorais correspondentes por 5 min com densidade de potência de 0,5 W / cm ² . Conforme demonstrado na Fig. 10b, quando as células tumorais foram tratadas com DOX @ NrGO por 24 h, a viabilidade diminuiu obviamente com o aumento da concentração, revelando que a DOX liberada poderia inibir a proliferação das células tumorais. Além disso, a viabilidade diminuiu muito mais rapidamente quando a irradiação NIR foi aplicada também, indicando que a temperatura elevada e a taxa de liberação de DOX poderiam desempenhar uma terapia sinérgica quimio-fototérmica.

Após a coloração com DAPI, as células foram observadas em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM), o núcleo foi corado em azul e as imagens dos diferentes tratamentos foram exibidas na Fig. 11a-c, respectivamente. As células cultivadas com NrGO foram espalhadas (Fig. 11a) na placa de cultura com uma grande quantidade, enquanto o número diminuiu quando tratadas com DOX @ NrGO (Fig. 11b), revelando que a DOX liberada poderia inibir a proliferação do tumor. Significativamente, as células tumorais na região de exposição do laser NIR foram eficientemente destruídas e caíram, o que resultou em uma área escura na imagem (Fig. 11c).

Além disso, o PI foi aplicado para observar a inibição das células tumorais após o tratamento sinérgico quimio-fototérmico, que é uma espécie de pequeno corante molecular para corar células mortas para fluorescência vermelha. Como mostrado na Fig. 12, células raramente mortas (ponto vermelho na imagem) foram observadas na Fig. 12a quando nenhum tratamento foi realizado, enquanto após o tratamento quimio-fototérmico, as células tumorais fora da região de exposição sofreram os danos de DOX e alta temperatura para reduzir ainda mais a viabilidade celular (Fig. 12b). De acordo com os resultados acima, DOX @ NrGO provou ser um candidato desejado para terapia tumoral.

Conclusões

Em resumo, o novo NrGO hidrofílico foi projetado e preparado com sucesso via reação simples de GO e HBP terminado em amino. A caracterização variada mostrou que NrGO obteve propriedade fototérmica estável e excelente. Após o carregamento de DOX, a liberação do fármaco apresentou pH e comportamento fototérmico dual-responsivo, que pode ser acelerado em baixo valor de pH e irradiação NIR. Além disso, o resultado do experimento citotóxico in vitro mostrou que o NrGO conforme preparado era bem biocompatível. Devido à vantagem, as células tumorais podem ser efetivamente inibidas com base na terapia sinérgica quimio-fototérmica, e o NrGO carregado com a droga antitumoral obteve uma aplicação promissora na terapia tumoral.

Abreviações

CLSM:: Microscopia confocal de varredura a laser
DAPI:: 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol
DOX:: Doxorrubicina
DOX @ NrGO:: NrGO carregado com DOX
FTIR:: Transformada de Fourier Infra-vermelho
GO:: Óxido de grafeno
HBP:: Polímero hiper-ramificado
MTT:: Metiltiazolil tetrazólio
NHBP:: HBP com terminação amino
NIR:: Próximo ao infravermelho
NrGO:: Polímero hiper-ramificado com terminação amino reduzida óxido de grafeno
PI:: Iodeto de propídio
PTT:: Terapia fototérmica
rGO:: Óxido de grafeno reduzido
SEM:: Microscopia eletrônica de varredura
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão

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