A administração oral de nanopartículas lipídicas sólidas carregadas com resveratrol melhora a resistência à insulina por meio da expressão de proteínas SNARE no tecido adiposo e muscular em ratos com diabetes tipo 2

Resumo

No estudo atual, desenvolvemos nanopartículas de lipídios sólidos carregadas com resveratrol (RES) (SLN-RES) para melhorar a resistência à insulina por meio da regulação positiva do complexo de proteínas SNARE em ratos com diabetes tipo 2. As características do SLN-RES incluem o seguinte:o tamanho médio de 248 nm, o potencial zeta de -16,5 mV e 79,9% de eficiência de aprisionamento de RES. O perfil de liberação de SLN-RES mostrou uma explosão inicial seguida por uma liberação sustentada em condição natural. Os resultados da espectroscopia de infravermelho revelaram boa incorporação de RES no núcleo SLN. Nanopartículas esféricas com menor agregação foram observadas ao exame microscópico eletrônico. A administração oral de SLN-RES evitou a perda de peso e mostrou melhor efeito hipoglicemiante do que o RES. O estado de estresse oxidativo sérico foi restaurado ao nível normal por SLN-RES. Além disso, a expressão da proteína sinaptosomal associada 23 (Snap23), sintaxina-4 (Stx4) e proteína de membrana associada à vesícula 2 (Vamp2) como os principais elementos do complexo de proteína SNARE foram reduzidos por SLN-RES de forma mais significativa do que o tratamento RES em tecido muscular. No entanto, o SLN-RES tem um efeito semelhante ao tratamento com RES no tecido adiposo. Tomados em conjunto, nossos resultados revelaram que o SLN-RES pode ser uma abordagem terapêutica moderna e interessante para a melhoria da resistência à insulina por meio do direcionamento da expressão de Snap23, Stx4 e Vamp2 em tecidos adiposos e musculares.

Apresentação da hipótese

O encapsulamento de resveratrol (RES) em nanopartículas de núcleo lipídico aumentou seus benefícios ao melhorar a estabilidade e a absorção intestinal oral quando consumido por via oral. SLN-RES melhora a resistência à insulina mais do que RES. O efeito antioxidante do RES aumenta quando incorporado em SLNs.

Teste da hipótese

A análise espectroscópica de SLN-RES foi realizada a fim de determinar a eficácia do encapsulamento. A segunda hipótese foi avaliar o efeito do tratamento com SLN-RES sobre os parâmetros de estresse oxidativo e seu efeito hipoglicemiante contra o diabetes tipo 2 em modelos animais.

Implicações da hipótese

O aumento da estabilidade e da absorção intestinal leva à biodisponibilidade do RES quando administrado por via oral. O aumento da biodisponibilidade de RES quando incorporado em SLNs leva ao aumento da concentração de RES nos tecidos-alvo. O aumento da concentração de RES nos tecidos-alvo leva a mais efeito hipoglicêmico do RES quando incorporado aos SLNs do que o RES.

Histórico

O diabetes mellitus tipo 2 é um distúrbio metabólico caracterizado pela resistência à insulina. A resistência à insulina é desenvolvida principalmente através da interrupção do sistema de transporte de glicose (GLUT 2 e 4) no músculo e tecido adiposo [1]. As proteínas SNARE imobilizaram o sistema GLUT 4 na membrana celular e desempenham papéis importantes no tráfego da membrana, encaixe e fusão das vesículas. A proteína sinaptossomal associada 23 (SNAP-23), a sintaxina-4 (STX4) e a proteína de membrana associada à vesícula 2 (VAMP-2) são conhecidas como o principal componente do complexo de proteínas SNARE [2]. Relatórios anteriores identificaram que a regulação negativa das proteínas SNARE acelera a resistência à insulina [3]. Nos últimos anos, um grande corpo de dados mostrou que os componentes à base de ervas têm muitos efeitos benéficos que podem melhorar muitos distúrbios metabólicos [4,5,6]. Tentativa de pesquisa de Côté et al. mostraram que a infusão intraduodenal aguda de RES compensou a resistência à insulina por meio da diminuição da proteína SIRT1 duodenal e da redução da produção de glicose hepática no modelo de rato [4]. É também, Gencoglu et al. relataram que a administração intraperitoneal de RES aliviou a resistência à insulina em ratos diabéticos por meio da normalização da expressão de visfatina e da regulação positiva da expressão de SIRT1 no músculo esquelético. A alimentação com RES leva ao aumento da expressão de GLUT4 e GLUT2 no diabetes induzido por estreptozotocina em ratos. No geral, essas descobertas forneceram novos insights sobre os efeitos benéficos da suplementação de RES contra a resistência à insulina. Apesar de sua promissora aplicação terapêutica, baixa absorção intestinal e degradação gastrointestinal levam principalmente à baixa biodisponibilidade de RES quando administrado por via oral [7].

Nos últimos anos, a nanomedicina oferece uma abordagem inteligente para a distribuição de muitos medicamentos, a fim de superar sua baixa biodisponibilidade, baixa estabilidade e aprimoramento das estratégias de direcionamento [8]. Como tal, micelas, lipossomas, nanopartículas poliméricas e nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs) são os mais famosos sistemas de entrega de drogas [9, 10]. Estudos recentes mostraram que a incorporação de RES em sistemas de entrega em nanoescala é um método conveniente para contornar sua limitação e pode ser mais eficaz do que a suspensão de droga pura em tentativas clínicas [11]. Evidências recentes mostraram que a incorporação de drogas em nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs) pode aumentar a biodisponibilidade do RES quando administrado por via oral [11, 12]. Frozza et al. mostraram que a nanoencapsulação de RES melhorou seu efeito neuroprotetor contra a doença de Alzheimer por meio do aumento da concentração da droga no tecido cerebral [13]. De acordo com os relatórios anteriores mencionados acima, foi proposto que o encapsulamento de RES em nanopartículas de núcleo lipídico pode melhorar a resistência à insulina melhor do que o RES por meio da elevação de sua biodisponibilidade oral.

O presente trabalho teve como foco o desenvolvimento, otimização e caracterização de SLN carregado com RES (SLN-RES) com o objetivo de melhorar sua biodisponibilidade oral. Portanto, no presente estudo, preparamos SLN-RES e tentamos determinar suas propriedades. Em seguida, o efeito do tratamento oral de SLN-RES sobre os parâmetros de açúcar no sangue em jejum (FBS), insulina e estresse oxidativo foi avaliado em ratos com diabetes tipo 2. Além disso, investigamos o efeito da administração oral de SLN-RES na expressão gênica de Snap23, Stx4 e Vamp2 em tecido adiposo e muscular.

Materiais e métodos

Materiais

O transresveratrol (> 99%) foi fornecido pelo Mega Resveratrol (EUA), a estreptozotocina (STZ) e a nicotinamida (NA) foram adquiridas da Sigma-Aldrich (Alemanha), e a lecitina de soja hidrogenada (S100) foi fornecida como um presente por Lipoid KG (Ludwigshafen, Alemanha). O óleo de palma hidrogenado (S154) foi oferecido como presente por Condea (Witten, Alemanha), e o reagente TRIzol e o kit de síntese de cDNA foram fornecidos pela Invitrogen (EUA). O kit Insulin Rat ELISA foi adquirido na Bio-Equip (China). Outros produtos e solventes foram usados ​​em grau analítico.

Preparação de SLN-RES

SLN-RES foi produzido de acordo com o estudo anterior com pequenas modificações [14]. Resumidamente, 40 mg de S100 e 1 g de sorbitol foram adicionados a 15 ml de água destilada e foram aquecidos a 70 ° C como a fase aquosa. A fase orgânica incluindo 100 mg S154, 70 mg S100 e RES foi fundida a 70 ° C e, em seguida, 5 ml de clorofórmio foi adicionado como um solvente orgânico. Subsequentemente, a fase orgânica foi rapidamente misturada com a fase aquosa pré-aquecida sob agitação a 1000 rpm / min até o solvente orgânico ser removido. A suspensão resultante foi sonicada por 2 min e então injetada em água fria (2 ° C) sob agitação contínua a 1000 rpm / min por 2 h a fim de solidificar rapidamente a matriz lipídica. Em seguida, a amostra foi mantida no escuro até a secagem. A amostra resultante foi lavada duas vezes com água destilada por centrifugação para remover o sobrenadante que continha o fármaco livre. Os sobrenadantes foram submetidos à medição da eficiência de aprisionamento ( EE). Uma série de SLN foi preparada pela adição de uma quantidade diferente de RES puro (30, 50 e 70 mg) na fase de lipídio fundido para atingir alto EE. O efeito do carregamento de RES no tamanho médio de partícula, índice de polidispersidade (PDI), carga de superfície (potencial zeta) e EE de SLNs foi avaliado (Tabela 1).

Caracterização de SLN-RES

O diâmetro médio da nanopartícula, potencial zeta e PDI de SLN-RES foram medidos por difração a laser (Zetasizer Nano-ZS; Malvern Instrument, UK). A caracterização foi realizada após diluição do SLN-RES em água destilada (1/30).

Eficiência de aprisionamento

O valor de EE é definido como a porcentagem de RES aprisionado em SLN em relação ao RES total usando a seguinte equação. A quantidade de RES aprisionado foi determinada separando o RES livre do RES encapsulado. RES livre foi quantificado usando espectrofotômetro UV a 310 nm.
$$ \ mathrm {EE} \% \ kern0.5em =\ kern0.5em \ left [\ left (\ mathrm {weight} \ kern0.5em \ mathrm {of} \ kern0.5em \ mathrm {total} \ kern0. 5em \ mathrm {drug} - \ mathrm {weight} \ kern0.5em \ mathrm {of} \ kern0.5em \ mathrm {untrapped} \ kern0.5em \ mathrm {drug} \ right) / \ left (\ mathrm {weight } \ kern0.5em \ mathrm {of} \ kern0.5em \ mathrm {total} \ kern0.5em \ mathrm {drug} \ right) \ right] \ times 100 $$

Estudo de liberação de drogas in vitro

O padrão de liberação de droga in vitro de RES foi analisado como segue. O SLN-RES preparado foi dissolvido em meio de plasma enquanto se agitava a pH 7,4 e 1,2. Nos momentos definidos (0,5, 1, 2, 4, 6 e 8 h), a quantidade definida de meio foi retirada e posteriormente filtrada por um filtro de seringa de 0,24 μm para a quantificação da forma livre de RES. O RES filtrado representou a quantidade de RES que foi liberado no meio.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

A caracterização morfológica foi avaliada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Resumidamente, SLN-RES foi espalhado em uma grade de cobre revestido com carbono e visto sob o TEM ZEISS. A morfologia da superfície, agregação e irregularidade de SLN-RES foram caracterizadas.

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

O S100, RES e a amostra seca de SLN e SLN-RES foram analisados ​​para confirmação de suas interações intermoleculares e caracterização química de superfície de nanopartículas por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), usando um espectrômetro infravermelho (FTIR PerkinElmer, EUA). Os espectros foram obtidos na faixa de 400 e 4000 cm ⁻¹ . As amostras secas foram preparadas usando KBr para formar peletes.

Design de estudo animal

Vinte ratos Wistar machos (200–250 g) foram fornecidos pelo Animal House of Razi Institute (Irã). Os animais foram manipulados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Hamadan University of Medical Sciences. Os ratos foram alimentados com água doce e ração padrão e mantidos em condições controladas (25 ± 2 ° C e iluminação em ciclos de luz / escuridão de 12 horas). O diabetes tipo 2 foi induzido por injeção intraperitoneal de STZ 65 mg / kg (0,1 M em citrato de sódio; pH 4,5) e nicotinamida 110 mg / kg em dose única [15]. O nível de FBS foi medido após 3 dias. Ratos com níveis de glicose acima de 150 foram considerados modelos diabéticos. Após uma semana, o RES e o SLN-RES em pó foram dissolvidos em água destilada e administrados por via oral por gavagem diariamente durante 1 mês. Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de 5 ratos em cada grupo:HC, controle saudável; DC, controle do diabético; RES, rato diabético tratado com 10 mg / kg de resveratrol por via oral; e SLN-RES, rato diabético tratado com nanopartículas lipídicas sólidas carregadas com resveratrol por via oral (amostra de SLN-RES em pó contendo 10 mg / kg de RES). Ao final do estudo, os animais foram pesados ​​e anestesiados com cetamina e xilazina por via intraperitoneal (100 mg / kg e 10 mg / kg, respectivamente). Em seguida, o sangue foi coletado por punção cardíaca e o soro separado e armazenado a -20 ° C. Posteriormente, o músculo esquelético e o tecido adiposo visceral foram colhidos e imediatamente congelados e mantidos a -80 ° C para análise posterior.

Medição de açúcar no sangue em jejum

O FBS foi medido por um kit de ensaio colorimétrico (Pars Azmun, Irã).

A medição da insulina sérica

O nível sérico de insulina foi medido por um kit ELISA comercial (Bio-Equip, China) de acordo com as instruções do fabricante. A resistência à insulina foi calculada usando a fórmula de avaliação do modelo de homeostase (HOMA).

Capacidade antioxidante total

A capacidade da amostra para reduzir o férrico (Fe ⁺³ ) para ferroso (Fe ⁺² ) foi determinada como a capacidade antioxidante total (TAC). A reação entre Fe ²⁺ e 2,4,6-Tri (2-piridil) -s-triazina (TPTZ) leva a um complexo de cor azul [16].

Grupo Total de Thiol

Os grupos tiol totais (-SH) foram medidos usando o reagente 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB). Este reagente reage com grupos tiol para produzir um complexo de cor amarela [17].

Ensaio de peroxidação lipídica

O malondialdeído (MDA) como produto final do processo de peroxidação lipídica foi medido pelo método colorimétrico. Os lipídios peroxidados reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBA) e produzem um complexo rosa. 1,1,3,3-Tetraetoxipropano foi usado como o padrão [18].

Status total de oxidante

O potencial de oxidação da amostra foi medido pelo método do estado oxidante total (TOS). Resumidamente, Fe ⁺³ e o xilenol laranja produzem um complexo colorido, em estado ácido. O ensaio foi calibrado com H ₂ O ₂ , e os resultados foram expressos em μM H ₂ O ₂ equivalente / L [19].

Reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa

A reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) foi realizada para determinar a expressão gênica de Snap23, Stx4 e Vamp2. O mRNA total foi extraído de tecido adiposo e muscular congelado usando o reagente TRIzol. A quantidade e a qualidade do mRNA foram determinadas usando um espectrofotômetro NanoDrop UV (BioTek Laboratories, Inc., EUA). O mRNA foi transcrito de forma reversa para cDNA usando o kit de síntese de cDNA da RevertAid First Strand. A amplificação quantitativa foi realizada com sequências de primer específicas usando o sistema de detecção de PCR em tempo real CFX96. Os iniciadores directos e reversos, respectivamente, foram utilizados para a amplificação do gene:5'-dTTCCGTTTCTGTGTCCAATAG e 5'-dTTGTGCTTTCCAGAGACTCAT para Snap23, 5'-dTCAGCAGACTATGTGGAAC e 5'-dCCAAGATGAGAACAGTGACAGA para Stx4, e 5'-dCTACTTGGTCCTAAGAATCC e 5'-dCAGAAGAGTGAAGAGTAATGG para VAMP? 2. A mudança relativa da expressão gênica foi calculada de acordo com 2 ^-ΔΔCt Fórmula. 18s rRNA como gene de manutenção foi usado. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada com os softwares SPSS 16 e GraphPad Prism 6.00, LaJolla, CA (EUA). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). A análise de variância (ANOVA) unilateral foi usada para comparar as diferenças entre os grupos. p <0,05 foi considerado nível significativo.

Resultados e discussão

Caracterização físico-química de SLN-RES

Como pode ser visto na Tabela 1, conforme a proporção de fármaco para lipídios aumentou, o tamanho de partícula e o valor de PDI foram quase constantes, o que pode ser devido à formação de múltiplas camadas de fosfolipídios no SLN [11]. O intervalo de tamanho das nanopartículas presentes foi de cerca de 250 nm, o que poderia ser adequado para a absorção intestinal e desviar o fígado e o sistema de filtração do baço [20]. Além disso, este intervalo de tamanho pode levar à biodisponibilidade aumentada de RES através do aumento do tempo de circulação de SLN-RES e liberação prolongada do medicamento. O desenvolvimento de nanopartículas com menor tamanho e valor de PDI pode facilitar sua absorção intestinal. Como sugestão, a modificação do SLN com polietilenoglicol (PEG) poderia melhorar nossa formulação para aumentar sua permeabilidade e tempo de circulação sistêmica [21].

Conforme mostrado na Tabela 1, o valor de PDI de 0,4 é considerado como tendo distribuição heterogênea, que expressa a presença de aglomerados. Em SLN-RES-30, a elevação do conteúdo de RES ajuda a aumentar a probabilidade de ser acomodado no SLN, embora a porcentagem de EE tenha se esgotado, obviamente seguida pelo aumento do conteúdo de drogas na formulação de SLN-RES-70. Concluiu-se que o aumento do conteúdo lipídico no SLN-RES-70 não é suficiente para acomodar toda a quantidade de RES na matriz SLN [22]. Portanto, SLN-50 foi selecionado como a formulação otimizada para futuras investigações.

Os resultados do potencial Zeta mostraram uma carga superficial negativa (- 16,5 ± 17,7 mV) para as formulações atuais. Em relação à observação morfológica, a carga superficial de SLN-RES foi considerada suficiente para prevenir fenômenos de agregação de partículas e estabilidade de SLN fina [21]. O potencial zeta de todas as formulações com ou sem fármaco era quase semelhante entre si, o que significa que o encapsulamento do fármaco em SLN não teve um impacto significativo na carga superficial do transportador. Como resultado, a droga foi colocada no interior do LNS devido à natureza lipofílica do RES [23].

O ensaio de liberação in vitro

Como os resultados são apresentados na Fig. 1, diferentes comportamentos de liberação foram detectados em pH =7,4 e pH =1,2. Após 6 he 1 h, cerca de 70% do RES foi liberado das nanopartículas em condições de pH neutro e ácido, respectivamente. O burst release inicial foi devido à liberação de fármacos adsorvidos na superfície das nanopartículas na fase inicial [24]. Posteriormente, uma forma de liberação sustentada pode ser atribuída à interação fármaco-lipídio, gradiente de concentração e incorporação do fármaco no núcleo oleoso do carreador. O perfil de liberação sustentada leva ao aumento da concentração sérica do fármaco e, consequentemente, ajuda a aumentar a biodisponibilidade e a liberação direcionada de RES. Como sugestão, a administração de RES por via intravenosa pode contornar a condição ácida do estômago [22].

Perfis de liberação in vitro de RES de SLN-RES em condições ácidas e naturais

Avaliação da morfologia

Como pode ser visto na Fig. 2, a análise TEM deu origem a bons resultados, onde a maioria das partículas atingiu forma esférica regular e tamanho na faixa de 20-30 nm. Além disso, as nanopartículas em forma de bastonete e amorfas foram observadas acompanhadas com menos agregação. O tamanho de partícula do SLN foi estimado entre 20 e 30 nm, o que discorda dos achados do DLS (Tabela 1). Essa discrepância pode ser decorrente da hidratação das nanopartículas por meio da diluição da amostra na análise DLS. Além disso, havia uma nanopartícula em forma de bastonete que pode ser devido à constante injeção de uma emulsão na água fria por uma agulha de seringa. Não observamos agregações SLN na observação TEM, que representa carga superficial e estabilidade suficiente para nossa formulação [23].

Micrografia eletrônica de transmissão de SLN-RES. Bar =100 nm

Validando a Eficiência de Carregamento de RES por Espectroscopia de Infravermelho

Como mostrado na Fig. 3, os resultados de FTIR do espectro de lecitina revelaram um pico amplo em 3370-3390 cm ⁻¹ que se refere ao alongamento simétrico N-H do grupo funcional colina. Um pico em 1735 cm ⁻¹ representado C =O estendendo-se do composto éster em lecitina. Além disso, os picos característicos em 2922, 2853 e 3010 cm ⁻¹ são devido ao alongamento dos grupos C – H. O espectro de SLN exibiu vários picos característicos semelhantes ao espectro de lecitina sem deslocamento, mas a intensidade dos picos pertencentes à lecitina diminuiu muito quando colocada em SLN. Isso pode ser devido ao ambiente hidrofílico e ao efeito de proteção do surfactante. No presente estudo, o espectro de RES exibiu um grupo funcional, incluindo bandas de absorção em 3290 cm ⁻¹ devido ao alongamento O-H pertencente ao grupo alcoólico, 965 cm ⁻¹ para ligação trans C =C, 1154 cm ⁻¹ para alongamento C-O, 1445 cm ⁻¹ e 1587 cm ⁻¹ para C =C alongamento em anel aromático (AR) e 1606 cm ⁻¹ para alongamento C-C do grupo alceno. Além disso, o RES exibiu picos característicos com forte intensidade de curva C-H monossubstituída em 770 cm ⁻¹ e Ar-C-H alongamento em 3020 cm ⁻¹ . Houve picos com intensidade em 1175–1263 que representaram o grupo ArO-H de RES. Nossos resultados validaram a incorporação do RES no SLN, enquanto a impressão digital do RES foi repetida no SLN-RES, mas o espectro do SLN não foi associado a essa impressão digital. Além disso, um pico em torno de 1735–1740 cm ⁻¹ foi atribuído ao alongamento C =O (R-C (O) -O-R) que se refere ao éster no fosfolipídeo de lecitina em todo o espectro esperado para RES.

Espectro FTIR de SLN (nanopartícula de lipídio sólido), SLN-RES (nanopartícula de lipídio sólido carregada com resveratrol), S100 (lecitina) e RES (pó de resveratrol puro)

Os dados do FTIR validaram a presença do fármaco no portador. Houve um pico amplo em 3040–3670 cm ⁻¹ na lecitina, SLN e SLN-RES que foi devido ao alongamento O-H que contribui para a forte natureza hidrofóbica das amostras. O amplo pico de deslocamento entre SLN e SLN-RES pode ser referido à formação de ligações de hidrogênio quando RES é colocado em SLN. Concluímos que a superfície da partícula estava coberta por lecitina devido ao aumento do alongamento C-H no SLN-RES. Por outro lado, a diminuição da intensidade da impressão digital do RES no espectro SLN-RES refere-se à cobertura lipídica do RES na estrutura do SLN. A diferença entre os picos característicos do RES e do SLN-RES validou que existe uma potencial interação química entre o RES e outros componentes da formulação. Um novo pico que se tornou aparente em 1000 cm ⁻¹ em SLN-RES foi atribuído a Ar-O-R que se referia à interação entre RES e lecitina. Por outro lado, no espectro RES, a banda de absorção em 1106 cm ⁻¹ estava relacionado ao grupo Ar-O-H que desapareceu em SLN-RES. Esta mudança fornece outra evidência para a interação entre RES e SLN. Além disso, um aumento de intensidade tornou-se aparente em 2850–2900 cm ⁻¹ em SLN-RES do que em SLN indicando o aumento do alongamento C-H, que pode ser devido ao aumento da localização da superfície do surfactante e à colocação de RES na nanopartícula do núcleo. No geral, nossos resultados validaram a incorporação de RES no núcleo lipídico SLN que é esculpido pela lecitina [11, 22].

O efeito do tratamento com RES e SLN-RES no ganho de peso corporal, açúcar no sangue em jejum, insulina e índice de HOMA

Os resultados da Tabela 2 mostraram que no grupo DC, a injeção de STZ diminuiu significativamente o peso corporal do que no grupo HC. A administração de RES evitou a perda de peso em comparação com o grupo DC. SLN-RES atende ao peso corporal normal de forma mais significativa do que o tratamento com RES, ao passo que recorreu ao grupo HC. Com base nos relatórios anteriores, a administração oral de SLN-RES teve um efeito semelhante ao RES livre quando administrado por via intraperitoneal. Gencoglu et al. relataram que o tratamento intraperitoneal de RES serviu ao peso corporal após a indução do diabetes, enquanto o peso corporal final de modelos diabéticos que receberam RES foi 10% menor do que o de ratos saudáveis ​​[25].

Conforme mostrado na Tabela 2, FBS foi significativamente elevado no grupo DC em comparação com o grupo HC. No final do estudo, o FBS sérico foi diminuído pelo tratamento com RES e RES-SLN em comparação com o grupo DC. A indução do diabetes diminuiu o nível sérico de insulina em comparação ao grupo HC. Curiosamente, o nível sérico de insulina em ratos diabéticos foi compensado pelo tratamento com RES-SLN. A administração de RES e SLN-RES melhorou notavelmente o HOMA do que o grupo DC. No grupo SLN-RES, o HOMA foi melhor do que o tratamento com RES, que se aproxima do grupo HC.

O efeito hipoglicêmico obtido com o SLN-RES foi significativamente melhor do que o RES, o que pode ser devido à melhor absorção intestinal e ao aumento do tempo de circulação do RES nanoencapsulado no sangue. Consistente com nossa proposta, Sadi et al. mostraram que o tratamento intraperitoneal de RES coincidiu com um profundo efeito hipoglicêmico e uma resistência à insulina melhorada no diabetes induzido por STZ [26].

O efeito do tratamento com RES e SLN-RES no nível sérico dos parâmetros de estresse oxidativo

Conforme mencionado na Tabela 3, no estudo atual, a indução de diabetes leva a indicadores de antioxidantes reduzidos e indicadores de oxidantes aumentados significativamente em comparação com o grupo HC. O tratamento com RES preveniu a depleção do nível sérico de TAC e inibiu a elevação de MDA. Surpreendentemente, o tratamento com SLN-RES pode restaurar o nível sérico de TAC e MDA completamente. Provavelmente, o aumento do tempo de circulação do RES levou a um melhor efeito modulatório do RES-SLN [27]. De acordo com o presente resultado, Gokce et al. relataram que SLN e transportadores de lipídios nanoestruturados (NLC) contendo RES reduziram ROS intracelulares em fibroblastos de cultura de células [28]. Além disso, Coradini e co-autores relataram que a co-encapsulação de RES e curcumina em carreador lipídico diminuiu notavelmente o radical hidroxila in vitro [29]. Além disso, a administração de RES-SLN levou à diminuição do valor de TOS e ao aumento do nível de -SH em comparação com o grupo DC significativamente. No entanto, o tratamento com RES não melhorou o nível de TOS e -SH que mostrou o efeito antioxidante fraco do RES, que pode ser atribuído à baixa biodisponibilidade do RES quando administrado por via oral.

O efeito do tratamento com RES e SLN-RES na expressão gênica de Snap23, Stx4 e Vamp2 no tecido adiposo

Tentativas anteriores mostraram que a elevação da expressão gênica de Snap23, Stx4 e Vamp2 levou à melhora da resistência à insulina. Oh et al. relataram que a superexpressão de Stx4 nas células pancreáticas do modelo transgênico melhorou a resistência à insulina [30]. Aqui, o tratamento com RES induziu a expressão gênica de Snap23, Stx4 e Vamp2 no tecido adiposo, obviamente (Fig. 4a-c). Farimani et al. mostraram que o tratamento com RES regulou negativamente a expressão gênica de Stx4 e Vamp2 significativamente no tecido adiposo de modelo de rato diabético [31]. Não foram observadas alterações significativas entre o tratamento com RES e SLN-RES no tecido adiposo, no qual provavelmente a meia-vida de eliminação do RES no soro não é suficiente para a exposição ao fármaco no tecido adiposo. A expressão gênica de Snap23 não afetou RES e SLN-RES, o que pode ser resultado da superprodução da proteína SNAP23 nos adipócitos que pode levar à repressão transcricional por meio de um mecanismo de feedback. Para resolver esta questão, a medição do nível de proteína de SNAP23 poderia explicar os dados presentes em mais detalhes. Além disso, a medição da expressão de Snap23 hepático usando o método de curso do tempo explicaria nossa observação claramente.

O efeito do tratamento com RES e SLN-RES no nível de mRNA de Snap23, Stx4 e Vamp2 em tecido adiposo ( a - c ) e tecido muscular ( d - f ) α , em comparação com o grupo DC; δ , houve uma diferença significativa entre RES e o grupo SLN-RES ( p <0,05); π , restaurado ao grupo HC (não houve diferença significativa em comparação com o grupo HC ( p > 0,05)). Os dados foram expressos como média ± DP. * p <0,05, ⁺ p <0,01, ^# p <0,001

O efeito do tratamento com RES e SLN-RES na expressão gênica de Snap23, Stx4 e Vamp2 no tecido muscular

Conforme ilustrado na Fig. 4d-f, a injeção de STZ no grupo DC foi associada à regulação negativa de Snap23, Stx4 e Vamp2 no tecido muscular em comparação com o grupo HC. SLN-RES induziu a expressão de Snap23 e Stx4 no tecido muscular melhor do que a forma livre de RES. Observamos o melhor resultado sobre a expressão gênica de Vamp2. A administração oral de SLN-RES compensou a regulação negativa de Vamp2 próximo ao nível normal. Semelhante aos nossos resultados, Mullainadhan et al. mostraram que a administração de bisfenol-A em ratos albinos machos adultos aumentou a expressão das proteínas Snap23, Stx4 e Vamp2 no músculo gastrocnêmio [32]. Provavelmente o aumento da absorção de RES por meio da administração de RES-SLN pode aumentar a chance de RES-SLN de atingir o tecido muscular que levou a um melhor efeito regulatório na expressão gênica de Snap23, Stx4 e Vamp2. Com base nas evidências anteriores, a capacidade potencial de penetração e capacidade de absorção celular do SLN-RES afetam o acúmulo de RES no tecido que pode ser responsável pelos diferentes efeitos do SLN-RES na expressão gênica das proteínas SNARE no tecido adiposo e muscular. Em outras palavras, nossos resultados apoiaram diferentes padrões de biodistribuição in vivo de RES na forma intacta dentro do SLN.

Conclusão

Preparamos nanocarreadores adequados em termos de propriedades físico-químicas e morfológicas para a entrega oral de RES. À luz do nosso resultado, concluímos que os SLNs podem servir como um sistema de entrega promissor para aumentar o efeito terapêutico do tratamento oral de RES contra a resistência à insulina, melhorando o efeito hipoglicêmico e elevando a expressão de Snap23, Stx4 e Vamp2 no tecido adiposo e muscular tecido. No entanto, estudos subsequentes serão necessários para identificar a biodistribuição in vivo e as propriedades farmacocinéticas do SLN-RES.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados gerados ou analisados ​​durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.

Abreviações

RES:

Resveratrol

SLN:

Nanopartícula de lipídio sólido

SLN-RES:

Nanopartícula de lipídio sólido carregada com resveratrol

SNAP-23:

Proteína associada ao sinaptossoma 23

STX4:

Sintaxina-4

VAMP-2:

Proteína 2 de membrana associada à vesícula

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

FTIR:

Espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier

-SH:

Grupo tiol total

TAC:

Capacidade antioxidante total

MDA:

Malondialdeído

TOS:

Status oxidante total

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