Nanoencapsulação Eficiente de Agregados Celulares Semelhantes a Ilhotas Porcinas Neonatais Usando Polissomas de PEG-bloco-PLA

Resumo

Pesquisas demonstram métodos para nanoencapsulação de aglomerados celulares semelhantes a ilhotas porcinas neonatais (NPCCs) usando polissomas (PSomas) formados por polímeros de polietileno glicol-bloco-poli lactida. Neste trabalho, apresentamos um procedimento de nanoencapsulação eficiente com danos e perdas mínimas de NPCCs. Utilizamos N-hidroxisuccinimida (NHS) no terminal N dos PSomas para induzir a ligação de grupos amina na matriz extracelular ao redor dos NPCCs. O meio de cultura F-10 com albumina sérica bovina foi usado no procedimento de nanoencapsulação para minimizar danos e perdas de NPCCs. Finalmente, induzimos a reticulação entre PSomas bifuncionais (PSomas NHS-/NH₂). O meio de cultura F-10 contendo 0,25% de BSA com pH 7,3 minimizou danos e perdas de NPCCs após nanoencapsulação em comparação com o uso de tampão HBSS básico (pH 8,0). Também induzimos nanoencapsulação eficiente através da conjugação de PSomas usando PSomas bifuncionais (NHS-/NH₂-PSomas).

Introdução

O uso de transplante de ilhotas alogênicas no tratamento do diabetes tipo 1 é limitado devido à falta de doadores adequados. Em vez disso, há um aumento gradual no uso de ilhotas animais em xeno-transplante de ilhotas, com porcos emergindo como espécies doadoras ideais [1]. Quando porcos são usados como doadores durante o transplante, ilhotas separadas podem ser usadas com base na idade dos porcos. Frequentemente, aglomerados celulares semelhantes a ilhotas porcinas neonatais (NPCCs) são preferidos em relação a ilhotas porcinas adultas (APIs) devido à sua acessibilidade e facilidade de isolamento. Além disso, NPCCs podem proliferar gradualmente após o transplante, prolongando sua função in vivo [1, 2]. No entanto, quando NPCCs são transplantados em veias porta de humanos ou primatas não humanos (NHP), variações interespecíficas podem causar reações imunes como reação inflamatória mediada por sangue instantânea (IBMIR) ou rejeição hiperaguda, levando à perda precoce do enxerto [3]. Para resolver este problema, é necessária a encapsulação de NPCCs que possa inibir várias respostas imunes. Existem três tipos de encapsulação: macro, micro e nanoencapsulação. A macroencapsulação usa um dispositivo contendo ilhotas, que é então implantado ao redor de vasos sanguíneos para liberar insulina através de uma membrana semipermeável em resposta aos níveis de glicose no sangue. A microencapsulação embala um pequeno número de ilhotas em uma cápsula porosa. Embora essas encapsulações possam proteger ilhotas da rejeição imune, efeitos colaterais como colapso da membrana ou geração de trombos foram relatados em ensaios in vivo. As ilhotas também perturbam o fluxo de hormônios, nutrientes ou oxigênio devido ao aumento da distância de difusão. A nanoencapsulação é a estratégia de modificação da superfície celular induzindo ligação entre células e proteínas exógenas, principalmente polietileno glicol (PEG), em transfusão sanguínea [4].

A nanoencapsulação usando PEG tem sido amplamente utilizada como método de modificação para melhorar a eficácia e propriedades físico-químicas de proteínas ou peptídeos alvo [5]. Em particular, a nanoencapsulação de ilhotas pode ter efeitos inibitórios em resposta a ataque de células imunes e reconhecimento de anticorpos. O PEG é amplamente utilizado para revestimento celular devido às suas propriedades biocompatíveis como não imunogenicidade, mascaramento de antígenos e efeito anti-incrustação [6]. Entre as nanopartículas usadas para nanoencapsulação de NPCCs, "polissomas" (PSomas) baseados em PEG-bloco-poli lactida (PEG-b-PLA) são os mais adequados porque são estáveis e simples de modificar; também podem incorporar reagentes hidrofílicos e hidrofóbicos em sua montagem [7, 8]. A modificação da superfície de ilhotas usando polímeros (contendo PEG) é realizada através de ligação covalente ou não covalente entre a matriz extracelular (MEC) da ilhota e o grupo funcional do polímero conjugado [9].

Em estudos anteriores, uma solução salina balanceada de Hank básica (HBSS, pH 8,0) foi usada como tampão de reação de nanoencapsulação de ilhotas devido à sua capacidade de facilitar a ligação N-hidroxisuccinimida (NHS)-NH₂ [10,11,12]. No entanto, para minimizar danos celulares aos NPCCs durante a nanoencapsulação, usamos meio F-10 (meio de cultura de NPCCs) com pH fisiológico (pH 7,3). Além disso, como preservar a quantidade de NPCCs após nanoencapsulação é importante para o transplante da quantidade correta de células, adicionamos albumina sérica bovina (BSA), que reveste o fundo do prato de cultura celular com um polímero de cadeia longa, para aumentar a taxa de recuperação [13]. Em nosso estudo anterior, a nanoencapsulação de NPCCs com PSomas foi realizada via grupos funcionais únicos, como NHS ou NH₂, usados para induzir ligação covalente ou interação eletrostática com MEC de NPCCs, respectivamente. No entanto, como a afinidade de ligação diminui com o tempo, estratégias são necessárias para aumentar a eficiência de ligação [14]. PSomas com grupos bifuncionais podem ser candidatos para aumentar a eficiência de revestimento devido à sua capacidade de agregação. Portanto, induzimos reticulação entre PSomas contendo grupos bifuncionais (NHS-/NH₂-PSoma) que podem ligar não apenas à MEC de NPCCs, mas também entre si através de interação covalente ou eletrostática, aumentando assim a eficiência de nanoencapsulação.

Neste estudo, investigamos a possível aplicação da nanoencapsulação em NPCCs através de método otimizado no campo de xeno-transplante de ilhotas porcinas.

Materiais e Métodos

Animais

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do Instituto MGENPLUS co. ltd. (#2019–1), e todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo comitê. A cirurgia foi realizada sob anestesia geral, e esforços foram feitos para garantir que os animais experimentassem dor mínima. Os porcos foram sacrificados antes da pancreatectomia.

Isolamento de Aglomerados Celulares Semelhantes a Ilhotas Porcinas Neonatais (NPCCs)

NPCCs foram isolados de leitões de 3 a 5 dias de idade. Brevemente, leitões foram anestesiados usando cetamina (10 mg/kg, Yuhan, Seul, Coreia) e cloridrato de xilazina (1 mg/kg, Rompun; Bayer Korea, Seul, Coreia) injetados no músculo femoral e depois sacrificados injetando cloreto de potássio (Sigma-Aldrich, MO, EUA) no coração. O pâncreas foi exposto através de uma incisão abdominal, colhido e imerso em solução salina balanceada de Hank (HBSS, Biosesang, Gyeonggi-do, Coreia) com 8,3 mM de bicarbonato de sódio, 10 mM de N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanossulfônico) (HEPES) (Sigma-Aldrich, MO, EUA) e 0,5% de antibiótico-antimicótico (Biowest, MO, EUA). O pâncreas foi picado em fragmentos de 1–2 mm³ e digerido em colagenase tipo V (1 mg/ml, Sigma-Aldrich, MO, EUA) em HBSS por 10 min. HBSS frio contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) (Biowest, MO, EUA) foi adicionado ao tecido pancreático digerido para interromper a atividade enzimática. Tecidos pancreáticos digeridos foram lavados em HBSS, e após ressuspensão, os tecidos foram filtrados através de um pluriStrainer 500 μm (pluriSelect, Leipzig, Alemanha) e lavados em HBSS. Finalmente, NPCCs foram semeados e cultivados em 5% CO₂ a 37 °C em meio F-10 (Gibco, CA, EUA) suplementado com 0,25% de albumina sérica bovina (BSA) (genDepot, TX, EUA), 10 mM de nicotinamida, 10 mM de D-glicose, 2 mM de L-glutamina, 2 mM de cloreto de cálcio di-hidratado, 50 μM de isobutilmetilxantina (IBMX), 20 μg/ml de ciprofloxacino (Sigma-Aldrich, MO, EUA) e 1% de antibiótico-antimicótico. NPCCs foram cultivados por 5 dias [15], com 10 nM de exendina-4 (Prospec, Ness-Ziona, Israel) sendo adicionados ao meio de cultura diariamente.

Avaliação In Vitro de NPCCs e NPCCs Nanoencapsulados

Após cultura, o número de NPCCs foi contado como equivalente de ilhota (IEQ) usando retículo ocular. A viabilidade foi avaliada usando coloração com laranja de acridina (AO, 0,67 μM, Sigma-Aldrich, MO, EUA) e iodeto de propídio (PI, 75 μM, Sigma-Aldrich, MO, EUA). Para realizar o ensaio de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), 20–30 NPCCs foram selecionados e pré-incubados com baixa concentração de D-glicose (2,8 mM) em tampão bicarbonato Krebs-Ringer (KRBB) por 1 h. NPCCs foram então incubados com baixa D-glicose (2,8 mM) em tampão KRBB por 1 h seguido por solução de alta D-glicose (28,0 mM) em KRBB por 1 h. Supernatantes foram coletados para medir a secreção de insulina sob baixas e altas concentrações de glicose [11]. A quantidade de insulina secretada de cada amostra foi medida usando Kit ELISA de Quantificação de Insulina Humana/Canina/Porcina (R&D systems, MN, EUA). Índice de estimulação (SI) foi calculado dividindo as quantidades de insulina em alta glicose (28,0 mM) pela de baixa glicose (2,8 mM).

Preparação de Polissoma (PSoma)

Para preparar PSomas, copolímeros de N-hidroxisuccinimida-poli(etileno glicol)-bloco-poli(lactida) (10 mg/ml, NHS-PEG-b-PLA) ou copolímeros de amina-poli(etileno glicol)-bloco-poli(lactida) (10 mg/ml, NH₂-PEG-b-PLA; Nanosoft polymers, NC, EUA) foram dissolvidos em 1 ml de dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich, MO, EUA). Além disso, para preparar PSoma bifuncional, cada copolímero (NHS ou NH₂-PEG-b-PLA) dissolvido em DMSO foi misturado em proporções. Água destilada (DH2O) foi adicionada à solução polimérica para fazer uma concentração final de 1 mg/ml. A solução polimérica foi sonicada em um ultrassom (Sea han ultrasonic, Seul, Coreia) por 5 min. 1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina, sal de 4-clorobenzenossulfonato (DiD; Biotium, CA, EUA) foi adicionado à solução polimérica durante a sonicação para permitir visualização. Finalmente, a mistura foi dialisada em DH2O por 3 dias.

Nanoencapsulação

O PSoma foi diluído em tampão de reação de nanoencapsulação (HBSS (pH 7,3 ou pH 8,0) ou meio F-10 simples sem suplementos (pH 7,3 ou pH 8,0), com ou sem 0,25% BSA). A nanoencapsulação foi realizada adicionando o PSoma aos NPCCs em meio de cultura. Para isso, 10.000 IEQs de NPCCs foram semeados em um prato de cultura celular de 6 poços (SPL, Gyeonggi-do, Coreia), e PSoma diluído adicionado aos NPCCs e incubado em 5% CO₂ a 37 °C por 1 h. Um grupo controle negativo (NC) (NPCCs não revestidos sem PSomas) foi incubado sob as mesmas condições do grupo experimental. Após incubação, os NPCCs nanoencapsulados foram colhidos e cultivados em meio de cultura F-10.

Eficiência de NPCCs Nanoencapsulados

NPCCs nanoencapsulados com PSoma conjugado a DiD foram visualizados usando microscopia de fluorescência (Leica, Wetzlar, Alemanha) ou microscopia confocal a laser (CLSM; Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). A intensidade de NPCCs ligados a PSoma conjugado a DiD foi quantificada calculando a intensidade média de fluorescência (MFI) usando software ImageJ (NIH, Bethesda, EUA). Núcleos nas células foram contra-coloridos com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Ensaio de Permeabilidade de Polissoma

NPCCs nanoencapsulados com NHS-PSoma em F-10 ou F-10 (0,25% BSA) foram incubados com dextrana conjugada a fluoresceína isotiocianato (FITC) de pesos moleculares variados (10, 20, 70 e 250 kDa) por 2 h. A penetração de dextrana conjugada a FITC em NPCCs nanoencapsulados com NHS-PSoma foi confirmada para cada peso molecular via microscópio confocal a laser.

Ensaio de Viabilidade Celular de Polissoma

THP-1 (linhagem celular monócítica humana) nanoencapsulado com NHS-PSoma em RPMI 1640 (Biowest, MO, EUA) foi incubado por 1 h. A viabilidade de THP-1 nanoencapsulado com NHS-PSoma foi medida de acordo com o protocolo apresentado no kit de ensaio de proliferação celular MTT (iNtRon Biotechnology, Seongnam-si, Coreia).

Análise Estatística

Teste t não pareado foi realizado no GraphPad Prism 6.0. A significância estatística foi expressa como *, **, ***, e **** indicando o valor P de ≤ 0,05, ≤ 0,01, ≤ 0,001 e ≤ 0,0001.

Resultados

Cultura e Avaliação Funcional de NPCCs

NPCCs foram cultivados por 5 dias, e controles de qualidade, incluindo viabilidade e GSIS, foram realizados. O número total de NPCCs foi 21.014,0 IEQ/g/pâncreas. A viabilidade, usando coloração AO/PI, foi 89,9%. GSIS, realizado para confirmar a responsividade dos NPCCs à concentração de glicose, deu um índice de estimulação (SI) médio de 2,3 (Tabela 1, Arquivo adicional 1: Fig. S1).

Concentração de PSoma Necessária para Nanoencapsulação Eficiente de NPCCs

Para determinar a concentração de PSoma necessária para nanoencapsulação eficiente, adicionamos concentrações variadas de NHS-PSoma aos NPCCs. NHS-PSoma foi estocado a uma concentração de 1 mg/ml em DH₂O e diluído em 1:5, 1:10, 1:20 e 1:40 para dar concentrações finais variando de 0,2 a 0,025 mg/ml. A eficiência de nanoencapsulação foi medida pela MFI de NPCCs nanoencapsulados com PSoma carregado com DiD. A concentração final de 0,1 mg/ml (diluição 1:10) mostrou a maior intensidade de fluorescência 2 dias após nanoencapsulação (Fig. 1a e b) e a subsequente nanoencapsulação de NPCCs foi conduzida nesta concentração.

Eficiência Melhorada de Nanoencapsulação em Meio F-10 com pH Fisiológico

A nanoencapsulação de ilhotas pancreáticas (contendo NPCCs) é frequentemente realizada em tampão HBSS básico (pH 8,0 ou superior) para aumentar a afinidade de ligação entre NH2 na MEC de ilhotas e NHS conjugado no polímero. No entanto, a nanoencapsulação em tampão HBSS básico pode potencialmente danificar NPCCs. Assim, para minimizar danos aos NPCCs e determinar o efeito do pH na ligação NHS-NH₂, NPCCs foram nanoencapsulados através de NHS-PSoma em tampões HBSS ou meio de cultura F-10 simples (usado neste estudo para cultivar NPCCs) com pH 7,3 (fisiológico) ou pH 8,0 (básico), respectivamente. Quando NPCCs foram nanoencapsulados em F-10, a morfologia normal dos NPCCs foi mantida (Fig. 2a), e a eficiência de nanoencapsulação baseada em MFI foi significativamente aumentada em comparação com o grupo HBSS independentemente do pH nos dias 0 e 6 (Fig. 2b). Embora grupos HBSS tenham mostrado diferença significativa entre pH 7,3 e 8,0 no dia 6, a intensidade de nanoencapsulação foi significativamente diminuída em comparação com o grupo F-10. Assim, usamos meio de cultura F-10 fisiológico (pH 7,3) como tampão de reação de nanoencapsulação em experimentos subsequentes para minimizar danos potenciais aos NPCCs.

Aumento da Taxa de Recuperação de NPCCs Após Nanoencapsulação

Embora o dano celular dos NPCCs tenha sido minimizado em F-10, a quantidade de NPCCs coletados após nanoencapsulação foi marcadamente reduzida. Para resolver este problema, adicionamos 0,25% BSA ao meio F-10 durante cultura e nanoencapsulação de NPCCs usando NHS-PSoma. Inicialmente confirmamos se a adição de 0,25% BSA ao meio F-10 afeta a eficiência de revestimento e a permeabilidade seletiva, permitindo a passagem de moléculas pequenas (dextrana conjugada a FITC de 10 e 20 kDa) enquanto bloqueia moléculas maiores (dextrana conjugada a FITC de 70 e 250 kDa), como função essencial do PSoma. Como resultado, o revestimento conformal foi mostrado em imagens de CLSM (Fig. 3a, Mid) e a permeabilidade seletiva foi mantida normalmente (Fig. 3b, dextrana conjugada a FITC) em NPCCs nanoencapsulados com NHS-PSoma com F-10 contendo 0,25% BSA comparado a F-10, embora MFI tenha sido ligeiramente reduzido (Fig. 3b). As quantidades de NPCCs coletados após nanoencapsulação mostraram taxa de recuperação significativamente maior (71,9%) em F-10 com 0,25% BSA do que em F-10 sem BSA (42,3%) (Fig. 3c). Viabilidade (NC: 89,5%, NHS-PSoma: 90,3%) e secreção de insulina estimulada por glicose (NC: 2,1, NHS-PSoma: 1,6) de NPCCs em F-10 com 0,25% BSA também foram mantidas após nanoencapsulação (Fig. 4a, b, Arquivo adicional 1: Fig. S2). Nossos resultados indicam que a adição de 0,25% BSA pode aumentar significativamente a taxa de recuperação de NPCCs após nanoencapsulação e não afetou a eficiência de revestimento ou função do PSoma.

Estabilidade Aumentada da Nanoencapsulação Através de Reticulação de PSomas

Para induzir uma nanoencapsulação mais estável de NPCCs, tentamos conjugar PSomas com dois grupos funcionais diferentes. Primeiro, conduzimos nanoencapsulação de NPCCs adicionando simultaneamente diferentes proporções de PSomas contendo grupos bifuncionais NHS e NH₂ (NHS-/NH₂-PSoma) em um PSoma (Esquema 1). A eficiência de nanoencapsulação foi confirmada pela MFI de DiD conjugado em NPCCs nanoencapsulados com PSoma. Imagens resultantes de microscopia de fluorescência mostraram nenhuma diferença significativa entre grupos 9:1, 5:5 e 1:9 de NPCCs nanoencapsulados com NHS-/NH2-PSoma (9:1, 5:5, 1:9) no dia 0 e dia (Fig. 5a). No entanto, nos resultados de CLSM, o grupo 5:5 pareceu super-revestido e 1:9 mostrou revestimento insuficiente enquanto o grupo 9:1 formou revestimento conformal, no dia 1 (Fig. 5b). Portanto, determinamos a proporção ótima de NHS-/NH2 em PSoma como 9:1. Quando ensaios funcionais foram realizados para o grupo 9:1, nossos resultados mostraram que a viabilidade do grupo 9:1 foi significativamente diminuída quando comparada com a do controle NC (92,1%), mas a viabilidade foi mantida em níveis normais (87,8%). A função SI do grupo 9:1 foi normal (3,0) quando comparada com a do controle NC (3,7) (Fig. 5c,d).

Discussão

Diabetes mellitus, comumente conhecido como diabetes, é uma doença metabólica caracterizada por altos níveis de glicose no sangue. Diabetes tipo 1 resulta da falha das células beta no pâncreas em produzir insulina suficiente [16]. Transplante de ilhotas pancreáticas contendo células β produtoras de insulina tem sido usado recentemente para curar diabetes tipo 1. No entanto, o transplante alogênico de ilhotas é limitado devido à escassez de doadores; em vez disso, xenotransplante usando ilhotas de animais não humanos emergiu como fonte alternativa de tecido doador. Devido às suas similaridades fisiológicas com humanos, facilidade de criação em massa e disponibilidade de criação em instalações livres de patógenos, porcos são considerados um modelo animal ideal para xeno-transplante de ilhotas [1]. Especialmente, NPCCs têm sido usados valiosamente tão bem quanto APIs. Embora a maturidade de NPCCs seja menor que a de APIs, NPCCs têm algumas vantagens sobre APIs incluindo procedimento de isolamento de ilhotas relativamente simples e barato, capacidade de desenvolver resistência a ambientes hipóxicos e proliferação in vivo após transplante [1,2,3]. Por estas razões, usamos porcos neonatais de 3-5 dias como fonte de ilhotas neste estudo.

Infelizmente, uma vez que ilhotas de porco são implantadas em vasos sanguíneos de humanos ou primatas não humanos, reações imunes graves como IBMIR ou rejeição hiperaguda frequentemente ocorrem. IBMIR geralmente ocorre devido a vários fatores teciduais (TF) expressos em ilhotas de porco que medeiam coagulação em vasos sanguíneos humanos via ativação de uma via extrínseca. Antígenos alfa-galactose ou não-gal expressos na superfície de células de porco também podem ser alvos de anticorpos naturais humanos, seguidos por ativação de cascata de complemento chamada rejeição hiperaguda. Como resultado, enxertos são perdidos devido à hipóxia por formação de coágulos da via de coagulação e morte celular por ativação de complemento no hospedeiro [3]. Para resolver esses problemas, encapsulação, um método de revestimento de ilhotas pancreáticas com materiais biocompatíveis para protegê-las contra ataque de anticorpos ou reações de complemento, tem sido tentada. Primeiro, a macroencapsulação usa um dispositivo com membrana semipermeável contendo a ilhota e é implantado próximo a vasos sanguíneos onde libera insulina na corrente sanguínea em resposta aos níveis de glicose no sangue [4]. Segundo, a microencapsulação, principalmente usando alginato, tem permeabilidade seletiva e pode permitir passagem de oxigênio e nutrientes através de sua superfície porosa, enquanto bloqueia múltiplas citocinas e infiltração de células imunes. No entanto, como usam cápsulas do mesmo tamanho independentemente do tamanho das ilhotas, é difícil revestir conformalmente as ilhotas. Além disso, fibrose pode ocorrer, envolvendo o enxerto após transplante [17]. Por último, modificação da superfície de ilhotas (nanoencapsulação) usa principalmente polietileno glicol (PEG) que tem propriedade de "efeito furtivo" que bloqueia a interação de materiais revestidos com polímero "furtivo" (PEG) e componentes no sangue (células imunes) in vivo [11, 18]. Nossa estratégia de nanoencapsulação de NPCCs usa copolímeros de PEG modificados (PEG-b-PLA, Polissoma, PSoma). Também, PSoma tem propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas e pode incorporar imunossupressores ou fatores envolvidos em diferenciação ou crescimento celular [8].

Nanoencapsulação de ilhotas usando PEG tem sido realizada em tampão HBSS básico (pH 8,0 ou superior) para aumentar a afinidade de ligação entre NHS no PEG e NH₂ na MEC de ilhota [10,11,12]. No entanto, como estas condições não podem fornecer ambiente de cultura celular adequado, tentamos nanoencapsulação em ambiente imitando condição de cultura de NPCCs. Para abordar as questões acima, testamos meio F-10 simples, meio base de cultura de NPCCs, com pH fisiológico (sem suplementos) usado como tampão de reação de nanoencapsulação. Nanoencapsulação em F-10 com pH fisiológico mostrou eficiência de revestimento semelhante e manteve morfologia normal de NPCCs quando comparada com condição de cultura usando tampão HBSS básico (Fig. 3). Portanto, podemos propor uma plataforma que minimize danos a NPCCs durante nanoencapsulação em ambiente imitando cultura de NPCCs.

Embora o método de nanoencapsulação para minimizar danos a NPCCs tenha sido estabelecido, a quantidade residual de NPCCs coletados após nanoencapsulação diminuiu quando a nanoencapsulação foi realizada em placas de Petri. Isso significa que você precisa de mais NPCCs para nanoencapsulação para transplante. De acordo com relatórios anteriores, rendimentos de ilhotas foram melhorados em algumas cepas de camundongos usando BSA durante isolamento [19]. Também, BSA foi usado como cultura de suspensão por pré-revestimento da superfície de pratos de cultura celular em culturas de hepatoma de rato [13]. Portanto, para aumentar a quantidade de NPCCs após nanoencapsulação, 0,25% BSA foi adicionado no tampão de reação de nanoencapsulação F-10, mesma concentração de BSA usada para cultivar NPCCs. Como resultado, a taxa de recuperação de NPCCs aumentou significativamente após nanoencapsulação (Fig. 4). Isso significa que o número correto de ilhotas (contendo NPCCs) após nanoencapsulação pode ser previsto e transplantado minimizando perda de ilhotas (contendo NPCCs). Em resumo, este estudo usando F-10 com 0,25% BSA para nanoencapsulação mostrou que (i) a morfologia normal de NPCCs foi mantida, (ii) a ligação entre PSoma conjugado com NHS e NH2 na MEC de NPCCs não foi interferida e (iii) a taxa de recuperação de NPCCs após nanoencapsulação aumentou.

Finalmente, tentamos aumentar a estabilidade da nanoencapsulação através de (i) conjugação entre PSomas e (ii) ligação entre PSomas e MEC de NPCCs. Primeiro, polímeros NHS- e NH2-PEG-b-PLA foram misturados proporcionalmente para formar PSoma bifuncional (NHS-/NH2-PSoma) que pode ligar tanto a PSoma quanto à MEC de NPCCs. Postulamos que a conjugação poderia ser eficientemente alcançada por grupos bifuncionais dentro de um PSoma em vez de conjugar dois PSomas com grupos mono-funcionais devido à potencial interrupção causada por ligação entre PSomas com o mesmo grupo funcional (NHS-NHS e NH2-NH2). Como visto nos resultados, o revestimento conformal de NPCCs foi alcançado na proporção 9:1 de NPCCs nanoencapsulados com NHS-/NH2-PSoma, e viabilidade e funcionalidade foram mantidas (Fig. 5). No entanto, estudos adicionais são necessários para quantificar a força da ligação do PSoma, para provar que nanoencapsulação com PSomas bifuncionais resultou em encapsulação mais estável do que com PSoma mono-funcional. Portanto, sugerimos que nossas condições efetivas de nanoencapsulação imitando o ambiente de cultura de NPCCs podem ser usadas na estratégia de nanoencapsulação usando ilhotas contendo NPCCs (Arquivo adicional 1).

Conclusão

Este estudo foi conduzido para determinar um método ótimo de nanoencapsulação de ilhotas pancreáticas (NPCCs) usando polissomas (PSomas) baseados em PEG. Primeiro, usar meio de cultura F-10 com pH 7,3 pode manter a morfologia normal de NPCCs após nanoencapsulação em comparação com uso de tampão HBSS básico (pH 8,0), minimizando assim danos a NPCCs durante encapsulação. Segundo, adicionar 0,25% BSA ao meio F-10 melhorou o rendimento de NPCCs em aproximadamente 1,7 vezes após nanoencapsulação. Finalmente, induzimos nanoencapsulação mais estável através da conjugação de PSomas bifuncionais (NHS-/NH2-PSomas). Os métodos de nanoencapsulação apresentados neste artigo podem ser aplicáveis na nanoencapsulação de ilhotas pancreáticas usando nanopartículas baseadas em PEG.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Não aplicável.

Abreviações

DiD:

1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina, sal de 4-clorobenzenossulfonato

AO:

Laranja de acridina

APIs:

Ilhotas porcinas adultas

BSA:

Albumina sérica bovina

BF:

Campo claro

CLSM:

Microscopia confocal a laser

DAPI:

4',6-Diamidino-2-fenilindol

DMSO:

Dimetil sulfóxido

DH2O:

Água destilada

ELISA:

Ensaio imunoenzimático

FBS:

Soro fetal bovino

FITC:

Fluoresceína isotiocianato

GSIS:

Secreção de insulina estimulada por glicose

HBSS:

Solução salina balanceada de Hank

IBMIR:

Reação inflamatória mediada por sangue instantânea

IEQ:

Equivalente de ilhota

IBMX:

Isobutilmetilxantina

KRBB:

Tampão bicarbonato Krebs-Ringer

MFI:

Intensidade média de fluorescência

HEPES:

N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanossulfônico)

NC:

Controle negativo

NPCCs:

Aglomerados celulares semelhantes a ilhotas porcinas neonatais

NHS:

N-hidroxisuccinimida

NHP:

Primata não humano

PLA:

Poli lactida

PEG:

Polietileno glicol

PSomas:

Polissomas

PI:

Iodeto de propídio

SI:

Índice de estimulação

TF:

Fator tecidual