Efeito antibacteriano duplo de nanofibras compostas de curcumina por eletrofiação in situ para esterilizar bactérias resistentes a medicamentos

Resumo

A infecção bacteriana, especialmente causada por bactérias multirresistentes, ainda põe em perigo a vida humana. A terapia fotodinâmica (PDT) pode matar bactérias com eficácia, e a PDT à base de nanofibras pode efetivamente reduzir os danos aos tecidos normais. No entanto, os atuais fotossensibilizadores revestidos nas superfícies das fibras seriam liberados para a ferida, causando alguns efeitos colaterais. E as nanofibras preparadas pelo método tradicional apresentam má adesão na ferida, o que reduz severamente o efeito PDT devido ao seu efeito de curto alcance. Aqui, nanofibras de compósito de curcumina núcleo-casca são preparadas pelo método de eletrofiação in situ por meio de um dispositivo de eletrofiação portátil feito pelo próprio. As nanofibras compostas obtidas apresentam adesividade superior em diferentes superfícies biológicas do que o método de preparação tradicional. Após irradiação de 808 nm, essas nanofibras compostas efetivamente produziram oxigênio singlete (¹ O ₂ ) sem que a curcumina caia. Após a exposição dessas nanofibras compostas a bactérias resistentes a drogas, elas exibem comportamentos antibacterianos duplos e matam de forma eficiente as bactérias resistentes a drogas. Essas membranas de nanofibras antibacterianas duplas com excelente adesividade podem beneficiar a aplicação de infecção de ferida como curativo antibacteriano.

Histórico

A infecção bacteriana sem tratamento oportuno causará septicemia e, portanto, a sepse põe seriamente em risco a vida e a saúde [1,2,3]. Embora o antibiótico possa matar bactérias, o uso de antibiótico em longo prazo levará ao desenvolvimento de bactérias resistentes a medicamentos, como o staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) [4,5,6]. MRSA, como um tipo de bactéria multirresistente, é uma das bactérias comuns que causam infecção de feridas [7]. Nessa situação, é necessário encontrar estratégias para matar bactérias com segurança, sem desenvolver resistência. Já foi comprovado que a terapia fotodinâmica (TFD) é um método eficaz de esterilização [8,9,10,11]. No entanto, a maioria dos fotossensibilizadores para PDT requerem luz ultravioleta ou excitação de comprimento de onda curto [12, 13]. Uma vez que a profundidade de penetração da luz no organismo depende do comprimento de onda, a profundidade de penetração da luz ultravioleta e da luz visível é rasa, enquanto a profundidade de penetração da luz infravermelha próxima (NIR) é relativamente profunda. O que é pior, a luz ultravioleta e a luz de comprimento de onda curto queimam seriamente os tecidos humanos. A fim de obter tratamentos seguros e antibacterianos em tecidos profundos, o desenvolvimento de fotossensibilizadores estimulados pela luz NIR é uma demanda e uma tendência. Nanopartículas de conversão ascendente (UCNPs) podem converter luz NIR em luz de comprimento de onda curto [14, 15]. Devido a essa propriedade, os fotossensibilizadores podem ser projetados para combinar com a conversão ascendente para atingir a excitação NIR. UCNPs são usados como estação de conversão de comprimento de onda que converte luz NIR em comprimento de onda curto para excitar os fotossensibilizadores e produzir oxigênio singlete (¹ O ₂ ) [16,17,18,19]. No entanto, a maioria dos estudos anteriores sobre a preparação de fotossensibilizadores revestidos de estrutura de nanopartículas. Os fotossensibilizadores nus na camada mais externa das nanopartículas são fáceis de cair [20, 21] e também tem alguns efeitos colaterais nos tecidos biológicos por causa do contato direto, como inibir o crescimento do colágeno do tecido [22, 23]. Na verdade, os fotossensibilizadores podem atingir a esterilização devido à sua produção de oxigênio singlete, o que significa que não há necessidade dos fotossensibilizadores para contato direto com bactérias ou tecidos biológicos. Portanto, podemos projetar um espaçador para separar os fotossensibilizadores dos tecidos biológicos de forma a evitar os possíveis efeitos colaterais.

A eletrofiação é um método rápido e eficiente para preparar nanofibras, incluindo nanofibras orgânicas e inorgânicas [24,25,26,27,28]. Durante o processo de preparação da nanofibra, as nanopartículas são fáceis de combinar com as fibras para formar nanofibras compostas. Existem basicamente dois métodos para formar nanofibras compostas. Um é dopar partículas dentro das nanofibras [29], e o outro é carregar partículas nas superfícies das nanofibras [30, 31]. Considerando o propósito de separar os fotossensibilizadores dos tecidos biológicos, incorporar fotossensibilizadores às nanofibras é mais preferível do que os fotossensibilizadores carregados nas superfícies das fibras, que são fáceis de cair. No entanto, se as nanofibras são hidrofóbicas que não podem se infiltrar, o oxigênio singlete é difícil de produzir e distribuir às superfícies da fibra, alcançando propriedades antibacterianas [32]. Mas as nanofibras hidrofílicas são fáceis de dissolver quando contaminadas por fluido intersticial. Portanto, é necessário combinar fotossensibilizadores NIR com nanofibras e garantir que as nanofibras fotodinâmicas possam matar bactérias de forma eficaz, especialmente bactérias resistentes a medicamentos.

Neste estudo, a curcumina é usada como fotossensibilizante devido às suas amplas fontes de extratos de organismos. A nanoestrutura núcleo-casca de UCNPs é usada como estação de transferência de comprimento de onda e mostra alta eficiência de conversão para produzir ¹ O ₂ . As nanofibras de compósito UCNPs @ Curcumin são preparadas pelo método de eletrofiação in situ por meio de um dispositivo de eletrofiação feito pelo próprio. A adesão das nanofibras compostas obtidas por este método em diferentes superfícies biológicas é melhor do que o método tradicional de preparação por eletrofiação. Após irradiação de 808 nm, essas nanofibras compostas podem produzir efetivamente ¹ O ₂ sem que a curcumina caia. Depois que essas nanofibras compostas são contaminadas com bactérias resistentes aos medicamentos de MRSA, ocorrerão comportamentos antibacterianos duplos que matam efetivamente as bactérias resistentes aos medicamentos.

Métodos

Materiais

O cloreto de túlio, o cloreto de itérbio, o cloreto de neodímio e o cloreto de ítrio foram adquiridos à Sigma-Aldrich. Metanol, etanol, ciclohexano, curcumina, diclorometano, acetona, polivinilpirrolidona (PVP), policaprolactona (PCL) e polietilenoimina (PEI) foram adquiridos na Sinopharm Chemical Reagents. Todos os materiais foram usados sem purificação adicional.

Síntese de Núcleo-Shell NaYF ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Nd @ Curcumin

Nanopartículas de conversão ascendente (UCNPs) de NaYF ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Nd foram sintetizados usando métodos de co-precipitado [33, 34]. Posteriormente, 200 mg de UCNPs preparados, 90 mg de PEI e 180 mg de curcumina foram adicionados e dissolvidos em dicloreto de metileno. Os reagentes foram agitados uniformemente durante 20 h à temperatura ambiente e os produtos obtidos foram purificados por centrifugação e lavados duas vezes com etanol.

Preparação de nanofibras compostas de curcumina por eletrofiação in situ

Um grama de PCL, 0,16 g de PVP e 0,1 g de NaYF ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Nd @ Curcumina foram adicionados a 5 mL de acetona. Após 12 h de agitação, uma solução homogênea de precursor foi obtida para eletrofiação. Tomando 3 mL da solução precursora em uma seringa de 5 mL, um equipamento de eletrofiação manual feito por ele mesmo foi usado para eletrofiação, que consiste em uma agulha de metal de 0,4 mm de diâmetro, duas baterias alcalinas e um conversor de alta tensão que pode converter 3 V de bateria a 10 kV para eletrofiação. A distância de eletrofiação entre o coletor e a agulha de eletrofiação era de cerca de 10 cm.

Detecção de ¹ O ₂ Formação

O sensor de oxigênio singlet verde (SOSG) foi utilizado para detectar o ¹ O ₂ formação. Um quadrado de 9 × 9 mm de membrana de fibra nanocompósita preparada com diferentes concentrações de UCNPs @ Curcumin foi adicionado em uma cubeta de quartzo e, em seguida, 3 mL de metanol contendo 25 μM de SOSG foram adicionados. Em seguida, a cubeta foi irradiada sob o laser de 808 nm com diferentes tempos de irradiação. O espectrofotômetro de fluorescência com comprimento de onda de excitação de 504 nm foi utilizado para medir a intensidade de fluorescência dessa solução, que reflete o nível de oxigênio singlete.

Ensaio antibacteriano

Bactérias resistentes a medicamentos de MRSA e Escherichia coli foram utilizadas para avaliar a capacidade antibacteriana. Resumidamente, as cepas bacterianas foram cultivadas em meio de caldo de soja tríptico. Os meios de cultura contendo cepas bacterianas foram incubados a 37 ° C por 15 h. Após a cultura, a concentração da cepa bacteriana era de 1 × 10 ⁶ CFU / mL. No total, 100 μL de solução bacteriana foram colocados em cada poço da placa de 96 poços em uma mesa ultra-limpa estéril. Em seguida, um pedaço de membrana de fibra circular com 6 mm de diâmetro foi adicionado a cada poço da placa de 96 poços. Após 20 min de irradiação com laser de 808 nm, a solução bacteriana na placa foi diluída 10 vezes com água estéril. Um 10 μL de diluente foi colocado em uma placa de ágar nutricional para obter uma placa de ágar uniformemente revestida. A placa de ágar tratada foi cultivada em uma incubadora bacteriana de temperatura constante a 37 ° C por 18 he então tirou fotos. No grupo controle, as etapas foram as mesmas, exceto que a irradiação com laser de 808 nm não foi usada. Cada grupo foi repetido com 5 placas.

Caracterização

As imagens TEM e SEM foram tiradas dos microscópios eletrônicos JEM-2010 e SU-1510. O espectro de fluorescência foi medido no espectrofotômetro de fluorescência Edinburgh FLS1000. O espectro de absorção foi registrado no espectrômetro Shimadzu UV2550. A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier foi feita em espectrômetro Nicolet iS50. O potencial zeta foi medido com o analisador WJL-608. A hidrofilicidade com o método da gota séssil foi testada pelo equipamento PT-602Atest.

Resultados e discussão

Caracterização de nanopartículas e nanofibras compostas

A Figura 1a mostra a imagem TEM de NaYF ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Nanopartículas de Nd (UCNPs). Ele demonstra uma distribuição de tamanho uniforme de UCNPs com um diâmetro médio de cerca de 45 nm. O potencial zeta dessas nanopartículas foi ainda testado para ser + 19 mV (arquivo de adição 1:Fig. S1). Depois que os UCNPs foram revestidos com curcumina, a Fig. 1b mostra uma estrutura núcleo-concha e a espessura da camada de curcumina é de cerca de 5 nm. Posteriormente, essas nanopartículas de curcumina núcleo-casca foram incorporadas às fibras PCL / PVP. A Figura 1c mostra a imagem SEM dessas nanofibras compostas preparadas por um dispositivo de eletrofiação manual auto-projetado. O diâmetro das nanofibras contínuas e sem fratura preparadas por este dispositivo é de cerca de 400 nm, e a uniformidade da fibra é semelhante à dos dispositivos de eletrofiação tradicionais (arquivo de adição 1:Fig. S2). Ressalta-se que este dispositivo de eletrofiação portátil pode ser operado por duas baterias secas de 1,5 V (Arquivo de adição 1:Fig. S3), o que elimina a limitação de uso de energia da cidade. Combinado com suas outras vantagens de peso leve (160 g de peso) e tamanho pequeno, ele beneficiará o uso em exteriores. A Figura 1d mostra a imagem TEM dessas nanofibras compostas, indicando que as nanopartículas têm boa dispersibilidade nas nanofibras.

Imagens TEM de a NaYF ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Nanopartículas de Nd (UCNPs) e b UCNPs estruturados com núcleo-concha @ nanopartículas de curcumina. c Imagem SEM de nanofibras compostas de curcumina, d Imagem TEM de nanofibras compostas de curcumina

A razão para revestir NaYF ₄ :Nd shell no NaYF ₄ :Núcleo Yb / Tm foi que pode aumentar a fotoluminescência (Fig. 2a). Como os espectros de fluorescência dos UCNPs se sobrepõem bem aos espectros de absorção UV-Vis da curcumina (Fig. 2b), isso significa que a fotoluminescência mais forte dos UCNPs pode transferir mais energia para a curcumina, o que conduz à excitação dos fotossensibilizadores. Além disso, considerando que a luz NIR com comprimento de onda de 808 nm penetra mais profundamente no tecido vivo do que a luz NIR com comprimento de onda de 980 nm, a introdução deste NaYF ₄ :Nd shell pode modular o comprimento de onda de excitação de 980 a 808 nm (arquivo adicional 1:Fig. S4), reduzindo assim queimaduras indesejáveis no tecido normal. A medição de FTIR foi posteriormente medida. Como pode ser visto na Fig. 2c, vibrações de alongamento de C =O em 1628 cm ⁻¹ , C – O a 1282 cm ⁻¹ , e C – O – C em 1028 cm ⁻¹ ocorrem nas partículas de nanocompósitos (linha laranja), que se originam da curcumina (linha verde). Enquanto isso, há uma vibração de alongamento de C – N em 1125 cm ⁻¹ , que vem do PEI (linha azul). Seus diagramas de estrutura molecular são ilustrados no apêndice (arquivo de adição 1:Fig. S5). Além disso, há um C =C fraco em aproximadamente 1660 cm ⁻¹ , que corresponde ao ácido oleico no mesmo momento da síntese dos UCNPs. Ele pode demonstrar os componentes de nanofibras compostas de UCNPs @ Curcumin.

a Espectro de fluorescência de NaYF núcleo-casca ₄ :Yb / Tm @ NaYF ₄ :Nd animado por 808 nm, b espectro de fluorescência de UCNPs e espectro de absorção UV-vis de curcumina, c Espectros FTIR de UCNPs @ Curcumin, curcumin e PEI, d espectros de fluorescência resolvidos no tempo de UCNPs e UCNPs @ Curcumin

A Figura 2d exibe curvas de atenuação de fluorescência de UCNPs antes e após o revestimento de curcumina. Isso mostra que o tempo de vida de fluorescência de UCNPs diminuiu de 700 para 390 μs após o revestimento com conchas de curcumina. Com base em γ =1 - τ ₂ / τ ₁ , onde τ ₂ e τ ₁ são o tempo de vida dos UCNPs antes e depois do envelope da curcumina, γ é a eficiência de transferência de energia [35]. Assim, γ foi calculado em 44,3%. Obteve-se essa alta eficiência de transferência de energia, que no primeiro aspecto se deveu às boas sobreposições entre os espectros de absorção da curcumina e os espectros de fotoluminescência dos UCNPs (Fig. 2b), de modo que a transferência de energia não radiativa pode ocorrer entre eles. O segundo aspecto era que os UCNPs tinham um NaYF ₄ :Nd shell que aumenta a intensidade de fluorescência, aumentando assim sua área integral de sobreposição espectral. O terceiro aspecto foi que a distância entre a curcumina e os UCNPs era a espessura do revestimento (<5 nm), e essa pequena distância era propícia à geração de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) altamente eficiente. O método FRET pode obter até 44,3% de eficiência de transferência de energia, o que também pode beneficiar a seguinte produção eficiente de ¹ O ₂ .

Produzindo ¹ O ₂ de nanofibras compostas

A fim de avaliar a capacidade das fibras nanocompósitos de produzir ¹ O ₂ , o método SOSG foi usado. Primeiro, pegamos fibras nanocompósitos com uma concentração de dopagem fixa e observamos a geração de ¹ O ₂ sob diferentes tempos de irradiação. Conforme mostrado na Fig. 3a, para uma concentração fixa como 0,20% em peso, o tempo de irradiação é um dos fatores que afetam a geração de ¹ O ₂ . Quanto maior o tempo de irradiação, mais ¹ O ₂ foi produzido. No entanto, também mostra que, embora a concentração de ¹ O ₂ aumenta gradualmente com o aumento do tempo de irradiação, a taxa de subida desacelera gradualmente e quase permanece constante após 20 min, o que se manifesta por um intervalo de curva densa. Este fenômeno pode ser devido ao rápido consumo local de oxigênio, produzindo ¹ O ₂ com radiações de luz NIR sustentadas, resultando em um nível de oxigênio relativamente baixo na área local e, assim, diminuindo a taxa crescente de produção de ¹ O ₂ .

Produção de oxigênio singlete de membrana de nanofibra composta dopada com UCNPs @ Curcumin exposta a luz de 808 nm em diferentes a concentração e b tempo de irradiação

Para observar a influência da concentração de doping na produção de ¹ O ₂ , A Fig. 3b é ainda ilustrada. Conforme mostrado na Fig. 3b, para um tempo de irradiação fixo, como 20 min, com o aumento da concentração de dopagem, mais ¹ O ₂ foi produzido. No entanto, a taxa crescente de ¹ O ₂ desacelerou quando a concentração era maior do que 0,20% em peso. Esses resultados experimentais sugerem que não há necessidade de aumentar infinitamente o tempo de irradiação e a concentração de dopagem para produzir mais ¹ O ₂ . A escolha ideal é 0,20% em peso com 20 min e, portanto, nos experimentos a seguir usaremos essa concentração e o tempo de irradiação.

Molhabilidade e adesividade da membrana de nanofibra de eletrofiação in situ

Considerando a produção de ¹ O ₂ é um processo que requer nanopartículas de UCNPs @ Curcumin nas fibras para interagir com o oxigênio no fluido corporal, portanto, o ângulo de contato desta membrana de fibra foi testado posteriormente. A Figura 4a mostra uma gota d'água caindo na superfície desta membrana de nanofibra composta e sua molhabilidade após 20 s. Em comparação com a membrana de nanofibra PCL pura (Fig. 4b), a membrana de nanofibra composta tem melhor molhabilidade. Curiosamente, depois de embeber a membrana de nanofibra composta em solução tampão de fosfato (PBS), não houve UCNPs @ Curcumin detectado em PBS por espectrômetro de absorção, o que significa que nenhuma curcumina foi eliminada das fibras. A razão pode ser que a curcumina foi revestida nos UCNPs, então o tamanho dos UCNPs @ Curcumin (~ 50 nm) era muito grande para penetrar na fibra. Em comparação com métodos de fotossensibilizadores revestidos nas partículas ou fibras, aumentar o tamanho da curcumina primeiro e, em seguida, dopá-la nas fibras umectantes pode evitar efetivamente a liberação de fotossensibilizadores e aumentar a geração e difusão de ¹ O ₂ . Além disso, considerando que o efeito de curto alcance da PDT e a má adesão da membrana de fibra preparada pelo método de eletrofiação tradicional à superfície da ferida (Fig. 4c; Arquivo adicional 1:Fig. S6), o efeito fotodinâmico seria afetado devido ao intervalo entre a membrana da fibra e a superfície. Felizmente, essas nanofibras compostas de curcumina puderam ser preparadas pelo método de eletrofiação in situ com boa morfologia (Fig. 1c) e também exibiram boa adesividade em diferentes superfícies de objetos (Fig. 4d). Isso significa que o método de deposição por eletrofiação in situ para preparar a membrana de fibra fotodinâmica é mais preferível do que o método de fiação tradicional em que a membrana de fibra é coletada na folha e, em seguida, pressionada na superfície da ferida.

Medição do ângulo de contato com água da membrana de nanofibra composta com matriz de a PCL / PVP e b PCL, c membrana de nanofibra eletrofiada tradicional e membrana de nanofibra eletrofiada de deposição in situ, d eletrofiação de deposição in situ na superfície do objeto diferente

Efeito antibacteriano duplo de nanofibras compostas de curcumina

As fibras nanocompósitos preparadas pelo dispositivo provaram ser não tóxicas pelo ensaio de MTT (Arquivo de adição 1:Fig. S7). Além disso, a fim de comprovar que as fibras têm boas propriedades antibacterianas, o método de contagem foi utilizado para avaliar as propriedades antibacterianas de nanofibras compostas. Como mostrado na Fig. 5, quer a luz de 808 nm seja ou não irradiada em fibras puras, não há propriedade antibacteriana (Fig. 5a, b). Esses resultados mostram que a luz de 808 nm em si não tem efeito bactericida. Quando as fibras são dopadas com UCNPs, as bactérias não diminuem, o que confirma que os UCNPs não têm efeito bactericida (Fig. 5a ′, b ′). Curiosamente, quando as fibras são dopadas com curcumina, o número de bactérias diminui até certo ponto, o que prova que a própria curcumina mostra certa atividade antibacteriana (Fig. 5c, c ′). Além disso, um resultado bactericida óbvio ocorreu em fibras dopadas com UCNPs @ Curcumin sob irradiação de luz NIR (Fig. 5d ′, e ′). Combinado com os resultados da Fig. 3, esses resultados bactericidas indicam que o ¹ O ₂ produzido a partir de UCNPs @ Curcumin sob irradiação de 808 nm pode matar bactérias com eficácia. Por outro lado, a atividade antibacteriana da curcumina foi a mesma na presença e ausência de irradiação de 808 nm, devido ao fato de que a absorbância da curcumina estava na faixa de luz visível (Fig. 2b), então luz de 808 nm não foi eficaz. Esta também foi a razão pela qual a curcumina foi projetada para revestir a superfície de UCNPs. Além disso, a Fig. 5d, e mostra fibras dopadas com UCNPs @ Curcumin a 0,15% em peso e 0,20% em peso, respectivamente. Por comparação, verificou-se que o grupo de 0,20% em peso exibiu melhores propriedades bactericidas em 20 min de irradiação de luz, e o efeito antibacteriano atingiu 95%. Isso ocorre porque o ¹ O ₂ produzido pelo fotossensibilizador curcumina no efeito fotodinâmico pode matar bactérias resistentes aos medicamentos. Este resultado também é consistente com o ¹ O ₂ resultam na Fig. 3. Esses dados indicam ainda que as fibras dopadas com UCNPs @ Curcumin podem matar MRSA devido à sua dupla atividade antibacteriana, ou seja, fibras dopadas com UCNPs @ Curcumin e PDT, e PDT tem melhor efeito antibacteriano do que fibras dopadas com UCNPs @ Curcumin . Além disso, também conduzimos experimentos com Escherichia coli, que também confirmaram que nanofibras compostas de curcumina submetidas a eletrofiação in situ têm efeito antibacteriano duplo em bactérias resistentes a medicamentos (Arquivo de adição 1:Fig. S8). E o efeito antiinflamatório das nanofibras foi posteriormente verificado por coloração H&E de MRSA (Arquivo de adição 1:Fig. S9). Após tratamento diferente da infecção da ferida, um grande número de neutrófilos foi coletado no grupo sem fibra nanocompósita, que eram aglomerados de células roxas e azuis devido à lesão do tecido e infecção supurativa. No entanto, uma pequena quantidade de tecido de granulação e glóbulos vermelhos apareceu no grupo das nanofibras, o que refletiu indiretamente as propriedades antibacterianas das fibras nanocompósitos. Tem um efeito de bloqueio na inflamação da infecção da ferida.

Desempenho antibacteriano de nanofibras dopadas com diferentes amostras contra MRSA a - e sem e um ′ - e ′ com exposição à luz de 808 nm: a , a ′ grupo de controle, b , b ′ Grupo UCNPs, c , c ′ grupo curcumina, d , d ′ UCNPs @ Curcumin com grupo de baixa dose e e , e ′ grupo de alta dose

Conclusões

Em resumo, nanofibras de compósito de curcumina núcleo-casca são preparadas pelo método de eletrofiação in situ por meio de um dispositivo de eletrofiação portátil feito pelo próprio. As nanofibras compostas obtidas mostram adesividade superior em diferentes superfícies biológicas do que o método de preparação tradicional. O método, primeiro aumentando o tamanho da curcumina, seguido de dopagem na fibra molhável, pode efetivamente evitar a liberação de fotossensibilizadores, aumentando assim a produção de ¹ O ₂ e sua difusão, que pode servir de inspiração para a concepção de outros nanomateriais fotodinâmicos. Depois que essas nanofibras compostas contaminadas com bactérias resistentes a medicamentos, elas exibem comportamentos antibacterianos duplos e matam com eficiência as bactérias resistentes a medicamentos. Essas membranas de nanofibras antibacterianas duplas têm excelente adesão e podem ser usadas como curativos antibacterianos em combinação com hemostasia, permitindo assim a hemostasia externa.

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados gerados durante e / ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis nos autores correspondentes mediante solicitação razoável.