Nanofibras de Curcumina Eletrofidadas In Situ: Ação Antibacteriana Dupla para Esterilização de Bactérias Resistentes a Fármacos

Resumo

Infecção bacteriana, especialmente causada por bactérias multirresistentes, ainda põe em risco a vida humana. Terapia fotodinâmica (TFD) pode efetivamente matar bactérias, e TFD baseada em nanofibras pode efetivamente reduzir danos a tecidos normais. No entanto, fotossensibilizadores revestidos nas superfícies das fibras liberariam para a ferida, causando alguns efeitos colaterais. E nanofibras preparadas pelo método tradicional exibem adesão pobre na ferida, o que reduz severamente o efeito da TFD devido ao seu efeito de curto alcance. Aqui, nanofibras compostas core-shell de curcumina são preparadas pelo método de eletrofiação in situ via dispositivo de eletrofiação portátil autoconstruído. As nanofibras compostas obtidas mostram adesividade superior em diferentes superfícies biológicas do que a do método de preparação tradicional. Sob irradiação de 808 nm, estas nanofibras compostas efetivamente produziram oxigênio singlete (¹O₂) sem curcumina caindo. Após exposição destas nanofibras compostas a bactérias resistentes a fármacos, elas exibem comportamentos antibacterianos duplos e matam eficientemente as bactérias resistentes. Estas membranas de nanofibras antibacterianas duplas com excelente adesividade podem beneficiar a aplicação de infecção de ferida como curativo antibacteriano.

Fundamentação

Infecção bacteriana sem tratamento oportuno causará septicemia, e sepse assim seriamente põe em risco a vida e saúde [1,2,3]. Embora antibiótico possa matar bactérias, uso de antibiótico a longo prazo levará ao desenvolvimento de bactérias resistentes a fármacos, como staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) [4,5,6]. MRSA, como um tipo de bactéria multirresistente, é uma das bactérias comuns que causam infecção de ferida [7]. Nesta situação, é necessário encontrar estratégias para matar bactérias seguramente sem desenvolver resistência. Já foi provado que terapia fotodinâmica (TFD) é um método eficaz de esterilização [8,9,10,11]. No entanto, a maioria dos fotossensibilizadores para TFD requer luz ultravioleta ou excitação de comprimento de onda curto [12, 13]. Como a profundidade de penetração de luz em organismo depende do comprimento de onda, a profundidade de penetração de luz ultravioleta e luz visível é rasa, enquanto a profundidade de penetração de luz infravermelha próxima (NIR) é relativamente profunda. O que é pior, luz ultravioleta e luz de comprimento de onda curto queimarão seriamente tecidos humanos. Para alcançar tratamentos antibacterianos seguros e em tecido profundo, desenvolver fotossensibilizadores excitados por luz NIR é uma demanda e tendência. Nanopartículas de conversão ascendente (UCNPs) podem converter luz NIR em luz de comprimento de onda curto [14, 15]. Devido a esta propriedade, fotossensibilizadores podem ser projetados para combinar com conversão ascendente para alcançar excitação NIR. UCNPs são usadas como estação de conversão de comprimento de onda que converte luz NIR em comprimento de onda curto para excitar os fotossensibilizadores e produzir oxigênio singlete (¹O₂) [16,17,18,19]. No entanto, estudos anteriores mais sobre preparação de estrutura de nanopartículas com fotossensibilizadores revestidos. Fotossensibilizadores nus na camada mais externa de nanopartículas são fáceis de cair [20, 21], e também tem alguns efeitos colaterais em tecidos biológicos por causa de contato direto, como inibição de crescimento de colágeno tecidual [22, 23]. Na verdade, fotossensibilizadores podem alcançar esterilização devido à sua produção de oxigênio singlete, o que significa que não há necessidade de fotossensibilizadores contato direto com bactérias ou tecidos biológicos. Portanto, podemos projetar um espaçador para separar fotossensibilizadores de tecidos biológicos para evitar possíveis efeitos colaterais.

Eletrofiação é um método rápido e eficiente para preparar nanofibras, incluindo nanofibras orgânicas e inorgânicas [24,25,26,27,28]. Durante o processo de preparação de nanofibra, nanopartículas são fáceis de combinar com fibras para formar nanofibras compostas. Existem principalmente dois métodos para formar nanofibras compostas. Um é dopar partículas dentro das nanofibras [29], e o outro é carregar partículas nas superfícies das nanofibras [30, 31]. Considerando o propósito de separar fotossensibilizadores de tecidos biológicos, incorporar fotossensibilizadores nas nanofibras é mais preferível comparado a fotossensibilizadores carregados nas superfícies das fibras, que é fácil de cair. No entanto, se nanofibras são hidrofóbicas que não podem infiltrar, o oxigênio singlete é difícil de produzir e entregar às superfícies das fibras alcançando propriedade antibacteriana [32]. Mas nanofibras hidrofílicas são fáceis de dissolver quando contaminadas por fluido intersticial. Portanto, é necessário combinar fotossensibilizadores NIR com nanofibras e garantir que as nanofibras fotodinâmicas possam efetivamente matar bactérias, especialmente bactérias resistentes a fármacos.

Neste estudo, curcumina é usada como fotossensibilizadores por causa de suas amplas fontes de extratos de organismos. Nanoestrutura core-shell de UCNPs é usada como estação de transferência de comprimento de onda, e mostra alta eficiência de conversão para produzir ¹O₂. As nanofibras compostas UCNPs@Curcumina são preparadas pelo método de eletrofiação in situ via dispositivo de eletrofiação autoconstruído. A adesão das nanofibras compostas obtidas por este método em diferentes superfícies biológicas é melhor que o método de preparação por eletrofiação tradicional. Sob irradiação de 808 nm, estas nanofibras compostas podem efetivamente produzir ¹O₂ sem curcumina caindo. Após estas nanofibras compostas contaminadas com bactérias resistentes a fármacos de MRSA, elas ocorrerão comportamentos antibacterianos duais que efetivamente matam as bactérias resistentes.

Métodos

Materiais

Cloreto de túlio, cloreto de itérbio, cloreto de neodímio e cloreto de ítrio foram comprados da Sigma-Aldrich. Metanol, etanol, cicloexano, curcumina, diclorometano, acetona, polivinilpirrolidona (PVP), policaprolactona (PCL) e polietilenimina (PEI) foram comprados da Sinopharm Chemical Reagents. Todos os materiais foram usados sem purificação adicional.

Síntese de Core-Shell NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@Curcumina

Nanopartículas de conversão ascendente (UCNPs) de NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd foram sintetizadas usando métodos de coprecipitação [33, 34]. Posteriormente, 200 mg de UCNPs preparados, 90 mg de PEI, e 180 mg de curcumina foram adicionados e dissolvidos em diclorometano. Os reagentes foram agitados uniformemente por 20 h à temperatura ambiente, e os produtos obtidos foram purificados por centrifugação e lavados duas vezes por etanol.

Preparação de Nanofibras Compostas de Curcumina Via Eletrofiação In Situ

Um grama de PCL, 0,16 g de PVP, e 0,1 g de NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@Curcumina foram adicionados em 5 mL de acetona. Após 12 h de agitação, uma solução precursora homogênea foi obtida para eletrofiação. Tomando 3 mL da solução precursora em seringa de 5 mL, um equipamento de eletrofiação portátil autoconstruído foi usado para eletrofiação, que consiste em uma agulha metálica de 0,4 mm de diâmetro, duas pilhas alcalinas, e um conversor de alta tensão que pode converter 3 V de bateria para 10 kV para eletrofiação. A distância de eletrofiação entre coletor e agulha de eletrofiação era cerca de 10 cm.

Detecção de Formação de ¹O₂

Verde sensor de oxigênio singlete (SOSG) foi utilizado para detectar a formação de ¹O₂. Um quadrado de 9 × 9 mm de membrana de nanofibra nanocompósita preparada com diferentes concentrações de UCNPs@Curcumina foi adicionado em uma cubeta de quartzo, e então 3 mL de metanol contendo 25 μM de SOSG foi adicionado. Posteriormente, a cubeta foi irradiada sob laser de 808 nm com diferentes tempos de irradiação. O espectrofotômetro de fluorescência com comprimento de onda de excitação de 504 nm foi usado para medir a intensidade de fluorescência desta solução, que reflete o nível de oxigênio singlete.

Ensaio Antibacteriano

Bactérias resistentes a fármacos de MRSA e Escherichia coli foram usadas para avaliar a capacidade antibacteriana. Brevemente, cepas bacterianas foram cultivadas em meio caldo de soja triptico. Meios de cultura contendo cepas bacterianas foram incubados a 37 °C por 15 h. Após cultivo, a concentração da cepa bacteriana foi 1 × 10⁶ UFC/mL. No total, 100 μL de solução bacteriana foi colocado em cada poço de placa de 96 poços em mesa ultra-limpa estéril. Então, um pedaço de membrana de fibra circular com 6 mm de diâmetro foi adicionado a cada poço da placa de 96 poços. Após 20 min de irradiação de laser de 808 nm, a solução bacteriana na placa foi diluída 10 vezes com água estéril. 10 μL de diluente foi colocado em placa de ágar nutricional para obter uma placa de ágar uniformemente revestida. A placa de ágar tratada foi cultivada em incubadora bacteriana de temperatura constante a 37 °C por 18 h e então tirou fotografias. No grupo controle, os passos foram os mesmos acima, exceto que irradiação de laser de 808 nm não foi usada. Cada grupo foi repetido com 5 placas.

Caracterização

Imagens MET e MEV foram obtidas de microscópios eletrônicos JEM-2010 e SU-1510. Espectro de fluorescência foi medido em espectrofotômetro de fluorescência Edinburgh FLS1000. O espectro de absorção foi registrado em espectrômetro Shimadzu UV2550. Espectroscopia de transformada de Fourier infravermelha foi obtida em espectrômetro Nicolet iS50. O potencial zeta foi medido com analisador WJL-608. A hidrofilicidade com método de gota séssil foi testada por equipamento PT-602Atest.

Resultados e Discussão

Caracterização de Nanopartículas e Nanofibras Compostas

A Figura 1a mostra a imagem MET de nanopartículas NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd (UCNPs). Demonstra uma distribuição uniforme de tamanho de UCNPs com diâmetro médio de cerca de 45 nm. O potencial zeta destas nanopartículas foi testado adicionalmente como + 19 mV (Arquivo Adicional 1: Fig. S1). Após os UCNPs serem revestidos com curcumina, Fig. 1b mostra uma estrutura core-shell e a espessura da casca de curcumina é de cerca de 5 nm. Posteriormente, estas nanopartículas core-shell de curcumina foram incorporadas em fibras PCL/PVP. A Figura 1c mostra a imagem MEV destas nanofibras compostas preparadas por um dispositivo de eletrofiação portátil autoprojetado. O diâmetro das nanofibras contínuas e não fraturadas preparadas por este dispositivo é de cerca de 400 nm, e a uniformidade da fibra é similar à de dispositivos de eletrofiação tradicionais (Arquivo Adicional 1: Fig. S2). Deve-se notar que este dispositivo de eletrofiação portátil pode ser operado por duas pilhas secas de 1,5 V (Arquivo Adicional 1: Fig. S3), o que elimina a limitação de usar fonte de energia da rede. Combinado com suas outras vantagens de peso leve (160 g de peso) e tamanho pequeno, beneficiará uso externo. A Figura 1d mostra a imagem MET destas nanofibras compostas, indicando que as nanopartículas têm boa dispersibilidade nas nanofibras.

Imagens MET de a nanopartículas NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd (UCNPs) e b nanopartículas UCNPs@Curcumina com estrutura core-shell. c Imagem MEV de nanofibras compostas de curcumina, d Imagem MET de nanofibras compostas de curcumina

A razão para revestir casca de NaYF₄:Nd no núcleo NaYF₄:Yb/Tm foi que pode aumentar a fotoluminescência (Fig. 2a). Como os espectros de fluorescência de UCNPs se sobrepuseram bem com os espectros de absorção UV-Vis de curcumina (Fig. 2b), significa que fotoluminescência mais forte de UCNPs pode transferir mais energia para curcumina, o que foi propício à excitação dos fotossensibilizadores. Além disso, considerando que luz NIR com comprimento de onda de 808 nm penetra mais profundamente em tecido vivo que luz NIR com comprimento de onda de 980 nm, a introdução desta casca NaYF₄:Nd pode modular o comprimento de onda de excitação de 980 para 808 nm (Arquivo Adicional 1: Fig. S4), reduzindo assim queimaduras indesejadas em tecido normal. Medição FTIR foi medida adicionalmente. Como pode ser visto na Fig. 2c, vibrações de alongamento de C=O a 1628 cm⁻¹, C–O a 1282 cm⁻¹, e C–O–C a 1028 cm⁻¹ ocorrem nas partículas nanocompósitas (linha laranja), que originam da curcumina (linha verde). Enquanto isso, há uma vibração de alongamento de C–N a 1125 cm⁻¹, que vem do PEI (linha azul). Seus diagramas de estrutura molecular são ilustrados no apêndice (Arquivo Adicional 1: Fig. S5). Além disso, há um fraco C=C a aproximadamente 1660 cm⁻¹, que corresponde ao ácido oleico ao mesmo tempo da síntese de UCNPs. Pode demonstrar os componentes de nanofibras compostas UCNPs@Curcumina.

a Espectro de fluorescência de core-shell NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd excitado por 808 nm, b espectro de fluorescência de UCNPs e espectro de absorção UV-vis de curcumina, c espectros FTIR de UCNPs@Curcumina, curcumina e PEI, d espectros de fluorescência resolvidos no tempo de UCNPs e UCNPs@Curcumina

A Figura 2d exibe curvas de atenuação de fluorescência de UCNPs antes e depois de revestir curcumina. Mostra que o tempo de vida de fluorescência de UCNPs diminuiu de 700 para 390 μs após revestimento com cascas de curcumina. Com base em γ = 1 − τ₂/τ₁, onde τ₂ e τ₁ são o tempo de vida de UCNPs antes e depois do envelope de curcumina, γ é a eficiência de transferência de energia [35]. Assim, γ foi calculado como 44,3%. Tal alta eficiência de transferência de energia foi obtida, que no primeiro aspecto foi devido às boas sobreposições entre espectros de absorção de curcumina e espectros de fotoluminescência de UCNPs (Fig. 2b), para que transferência de energia não radiativa possa ocorrer entre eles. O segundo aspecto foi que UCNPs tinham uma casca NaYF₄:Nd que aumenta a intensidade de fluorescência, assim aumentando sua área integral de sobreposição espectral. O terceiro aspecto foi que a distância entre curcumina e UCNPs era a espessura do revestimento (< 5 nm), e esta pequena distância foi propícia à geração de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) altamente eficiente. O método FRET pode obter eficiência de transferência de energia tão alta quanto 44,3%, que também pode beneficiar a seguinte produção eficiente de ¹O₂.

Produzindo ¹O₂ a partir de Nanofibras Compostas

Para avaliar a capacidade de nanofibras nanocompósitas de produzir ¹O₂, o método SOSG foi usado. Primeiro, pegamos nanofibras nanocompósitas com concentração de dopagem fixa e observamos a geração de ¹O₂ sob diferentes tempos de irradiação. Como mostrado na Fig. 3a, para uma concentração fixa como 0,20% em peso, tempo de irradiação é um dos fatores afetando a geração de ¹O₂. Quanto maior o tempo de irradiação, mais ¹O₂ foi produzido. No entanto, também mostra que embora a concentração de ¹O₂ aumente gradualmente com o aumento do tempo de irradiação, a taxa de aumento diminui gradualmente e quase permanece constante após 20 min, que é manifestada por um intervalo de curva denso. Este fenômeno pode ser devido ao rápido consumo local de oxigênio pela produção de ¹O₂ com irradiações NIR sustentadas, resultando em nível de oxigênio relativamente baixo na área local, e assim diminuindo a taxa de aumento de produção de ¹O₂.

Produção de oxigênio singlete de membrana de nanofibra composta dopada com UCNPs@Curcumina exposta a luz de 808 nm em diferentes a concentração e b tempo de irradiação

Para observar a influência da concentração de dopagem na produção de ¹O₂, Fig. 3b é representada adicionalmente. Como mostrado na Fig. 3b, para um tempo de irradiação fixo como 20 min, com o aumento da concentração de dopagem, mais ¹O₂ foi produzido. No entanto, a taxa de aumento de ¹O₂ diminuiu quando a concentração foi maior que 0,20% em peso. Estes resultados experimentais sugerem que não há necessidade de aumentar infinitamente o tempo de irradiação e concentração de dopagem para produzir mais ¹O₂. A escolha ótima é 0,20% em peso com 20 min e assim nos seguintes experimentos tomarão esta concentração e tempo de irradiação.

Molhabilidade e Adesividade de Membrana de Nanofibra Eletrofiada In Situ

Considerando que produzir ¹O₂ é um processo que requer nanopartículas UCNPs@Curcumina em fibras para interagir com oxigênio em fluido corporal, assim o ângulo de contato desta membrana de fibra foi testado adicionalmente. A Figura 4a mostra uma gota de água gotejada na superfície desta membrana de nanofibra composta e sua molhabilidade após 20 s. Comparado com membrana de nanofibra pura de PCL (Fig. 4b), a membrana de nanofibra composta tem melhor molhabilidade. Curiosamente, após imersão da membrana de nanofibra composta em solução tampão fosfato (PBS), não houve UCNPs@Curcumina detectado em PBS por espectrômetro de absorção, o que significa que nenhuma curcumina foi liberada das fibras. A razão pode ser que curcumina foi revestida nos UCNPs, então o tamanho de UCNPs@Curcumina (~ 50 nm) era muito grande para penetrar na fibra. Comparado com métodos de fotossensibilizadores revestidos nas partículas ou fibras, aumentar o tamanho de curcumina primeiro e depois dopá-la nas fibras molháveis pode efetivamente evitar a liberação de fotossensibilizadores e aumentar a geração e difusão de ¹O₂. Além disso, considerando que o efeito de curto alcance da TFD e a adesão pobre da membrana de fibra preparada pelo método de eletrofiação tradicional à superfície da ferida (Fig. 4c; Arquivo Adicional 1: Fig. S6), o efeito fotodinâmico seria afetado devido ao intervalo entre a membrana de fibra e a superfície. Felizmente, estas nanofibras compostas de curcumina poderiam ser preparadas pelo método de eletrofiação in situ com boa morfologia (Fig. 1c) e também exibiram boa adesividade em diferentes superfícies de objetos (Fig. 4d). Significa que o método de deposição por eletrofiação in situ para preparar a membrana de fibra fotodinâmica é mais preferível que o método de fiação tradicional no qual a membrana de fibra é coletada no papel alumínio e então pressionada na superfície da ferida.

Medição de ângulo de contato de água de membrana de nanofibra composta com matriz de a PCL/PVP e b PCL, c membrana de nanofibra eletrofiada tradicional e membrana de nanofibra eletrofiada in situ, d deposição in situ eletrofiada em diferentes superfícies de objetos

Efeito Antibacteriano Duplo de Nanofibras Compostas de Curcumina

As nanofibras nanocompósitas preparadas pelo dispositivo foram provadas como não tóxicas por ensaio MTT (Arquivo Adicional 1: Fig. S7). Além disso, para provar que as fibras têm boas propriedades antibacterianas, o método de contagem foi usado para avaliar as propriedades antibacterianas das nanofibras compostas. Como mostrado na Fig. 5, quer irradiação de luz de 808 nm seja aplicada em fibras puras, não há propriedade antibacteriana (Fig. 5a, b). Estes resultados mostram que luz de 808 nm em si não tem efeito bactericida. Quando as fibras são dopadas com UCNPs, as bactérias não diminuem, o que confirma que UCNPs não têm efeito bactericida (Fig. 5a′, b′). Interessantemente, quando as fibras são dopadas com curcumina, o número de bactérias diminui até certo ponto, o que prova que a própria curcumina mostra certa atividade antibacteriana (Fig. 5c, c′). Além disso, um resultado bactericida óbvio ocorreu em fibras dopadas com UCNPs@Curcumina sob irradiação de luz NIR (Fig. 5d′, e′). Combinado com os resultados da Fig. 3, estes resultados bactericidas indicam que o ¹O₂ produzido a partir de UCNPs@Curcumina sob irradiação de 808 nm poderia efetivamente matar bactérias. Por outro lado, a atividade antibacteriana da curcumina foi a mesma na presença e ausência de irradiação de 808 nm, devido ao fato de que a absorbância de curcumina estava na faixa de luz visível (Fig. 2b), então luz de 808 nm não foi eficaz. Esta também foi a razão pela qual curcumina foi projetada para revestir a superfície de UCNPs. Além disso, Fig. 5d, e mostra fibras dopadas com UCNPs@Curcumina a 0,15% em peso e 0,20% em peso, respectivamente. Por comparação, descobre-se que o grupo 0,20% em peso exibiu melhores propriedades bactericidas a 20 min de irradiação de luz, e o efeito antibacteriano atingiu 95%. Isso é porque o ¹O₂ produzido pelo fotossensibilizador curcumina no efeito fotodinâmico pode matar bactérias resistentes a fármacos. Este resultado também é consistente com o resultado de ¹O₂ na Fig. 3. Estes dados indicam ainda que fibras dopadas com UCNPs@Curcumina podem matar MRSA devido à sua atividade antibacteriana dupla, nomeadamente fibras dopadas com UCNPs@Curcumina e TFD, e TFD tem melhor efeito antibacteriano que fibras dopadas com UCNPs@Curcumina. Além disso, também conduzimos experimentos com Escherichia coli, que também confirmaram que nanofibras compostas de curcumina eletrofiadas in situ têm efeitos antibacterianos duais em bactérias resistentes a fármacos (Arquivo Adicional 1: Fig. S8). E o efeito anti-inflamatório das nanofibras foi verificado adicionalmente por coloração H&E de MRSA (Arquivo Adicional 1: Fig. S9). Após diferentes tratamentos de infecção de ferida, um grande número de neutrófilos foram coletados no grupo sem nanofibra nanocompósita, que eram aglomerados de células roxas e azuis devido a lesão tecidual e infecção supurativa. No entanto, uma pequena quantidade de tecido de granulação e glóbulos vermelhos apareceram no grupo de nanofibra, que indiretamente refletiu as propriedades antibacterianas das nanofibras nanocompósitas. Tem efeito de bloqueio na inflamação de infecção de ferida.

Desempenho antibacteriano de nanofibra dopada com diferentes amostras contra MRSA a–e sem e a′–e′ com exposição à luz de 808 nm: a, a′ grupo controle, b, b′ grupo UCNPs, c, c′ grupo curcumina, d, d′ grupo UCNPs@Curcumina dose baixa, e e, e′ grupo dose alta

Conclusões

Em resumo, nanofibras compostas core-shell de curcumina são preparadas pelo método de eletrofiação in situ via dispositivo de eletrofiação portátil autoconstruído. As nanofibras compostas obtidas mostram adesividade superior em diferentes superfícies biológicas que a do método de preparação tradicional. O método, primeiro aumentando o tamanho de curcumina seguido por dopá-la na fibra molhável, pode efetivamente evitar a liberação de fotossensibilizadores, assim aumentando a produção de ¹O₂ e sua difusão, que pode fornecer inspiração para projetar outros nanomateriais fotodinâmicos. Após estas nanofibras compostas contaminadas com bactérias resistentes a fármacos, elas exibem comportamentos antibacterianos duais e eficientemente matam as bactérias resistentes. Estas membranas de nanofibras antibacterianas duais têm excelente adesão e podem ser usadas como curativos antibacterianos em combinação com hemostasia, permitindo assim hemostasia externa.