Síntese de DNA

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Antecedentes

A síntese de ácido desoxirribonucléico (DNA) é um processo pelo qual cópias de fitas de ácido nucléico são feitas. Na natureza, a síntese de DNA ocorre nas células por um mecanismo conhecido como replicação de DNA. Usando engenharia genética e química enzimática, os cientistas desenvolveram métodos feitos pelo homem para sintetizar DNA. O mais importante deles é a reação em cadeia da polimerase (PCR). Desenvolvido pela primeira vez no início dos anos 1980, o PCR tornou-se uma indústria multibilionária com a patente original sendo vendida por US $ 300 milhões.

História

O DNA foi descoberto em 1951 por Francis Crick, James Watson e Maurice Wilkins. Usando dados de cristalografia de raios-X gerados por Rosalind Franklin, Watson e Crick determinaram que a estrutura do DNA era de uma dupla hélice. Por esse trabalho, Watson, Crick e Wilkins receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1962. Ao longo dos anos, os cientistas trabalharam com DNA tentando descobrir o "código da vida". Eles descobriram que o DNA servia como código de instrução para as sequências de proteínas. Eles também descobriram que cada organismo tem uma sequência única de DNA e ela poderia ser usada para fins de triagem, diagnóstico e identificação. Uma coisa que se mostrou limitante nesses estudos foi a quantidade de DNA disponível de uma única fonte.

Depois que a natureza do DNA foi determinada, os cientistas foram capazes de examinar a composição dos genes celulares. Um gene é uma sequência específica de pares de bases de DNA que fornecem o código para a construção de uma proteína. Essas proteínas determinam as características de um organismo, como a cor dos olhos ou o tipo de sangue. Quando um determinado gene foi isolado, tornou-se desejável sintetizar cópias dessa molécula. Uma das primeiras maneiras de sintetizar uma grande quantidade de um DNA específico foi por meio da engenharia genética.

A engenharia genética começa combinando um gene de interesse com um plasmídeo bacteriano. Um plasmídeo é um pequeno trecho de DNA encontrado em muitas bactérias. O DNA híbrido resultante é denominado DNA recombinante. Este novo plasmídeo de DNA recombinante é então injetado nas células bacterianas. As células são então clonadas, permitindo que cresçam e se multipliquem em uma cultura. À medida que as células se multiplicam, o mesmo ocorre com as cópias do gene inserido. Quando a bactéria se multiplica o suficiente, as múltiplas cópias do gene inserido podem ser isoladas. Este método de síntese de DNA pode produzir bilhões de cópias de um gene em algumas semanas.

Em 1983, o tempo necessário para produzir cópias de DNA foi significativamente reduzido quando Kary Mullis desenvolveu um processo para sintetizar DNA chamado reação em cadeia da polimerase (PCR). Este método é muito mais rápido do que os métodos conhecidos anteriores, produzindo bilhões de cópias de uma fita de DNA em apenas algumas horas. Ele começa colocando uma pequena seção de DNA de fita dupla em uma solução contendo DNA polimerase, nucleotídeos e primers. A solução é aquecida para separar as fitas de DNA. Quando é resfriada, a polimerase cria uma cópia de cada fita. O processo é repetido a cada cinco minutos até que a quantidade desejada de DNA seja produzida. Em 1993, o desenvolvimento do PCR por Mullis rendeu-lhe o Prêmio Nobel de Química. Hoje, a PCR revolucionou os campos do diagnóstico médico, forense e microbiologia. É considerado um dos desenvolvimentos mais importantes na pesquisa genética.

Antecedentes

A chave para entender a síntese do DNA é entender sua estrutura. O DNA é um polímero de cadeia longa feito de unidades químicas chamadas nucleotídeos. Também conhecido como material genético, o DNA é a molécula que carrega informações que ditam a síntese de proteínas na maioria dos organismos vivos. Normalmente, o DNA existe como duas cadeias de nucleotídeos quimicamente ligados. Esses links seguem padrões específicos ditados pelas regras de emparelhamento de base. Cada nucleotídeo é composto de uma molécula de açúcar desoxirribose, um grupo fosfato e uma das quatro bases contendo nitrogênio. As bases incluem as pirimidinas timina (T) e citosina (C) e as purinas adenina (A) e guanina (G). No DNA, a adenina geralmente se liga à timina e a guanina à citosina. A molécula é organizada em uma estrutura chamada de dupla hélice, que pode ser imaginada retratando uma escada torcida ou uma escada em espiral. As bases constituem os degraus da escada, enquanto as porções de açúcar e fosfato constituem os lados da escada. A ordem em que os nucleotídeos estão ligados, chamada de sequência, é determinada por um processo conhecido como sequenciamento de DNA.

Em uma célula eucariótica, a síntese de DNA ocorre imediatamente antes da divisão celular, por meio de um processo denominado replicação. Quando a replicação começa, as duas fitas de DNA são separadas por uma variedade de enzimas. Assim aberto, cada fio serve como um molde para a produção de novos fios. Todo esse processo é catalisado por uma enzima chamada DNA polimerase. Esta molécula traz nucleotídeos correspondentes, ou complementares, alinhados com cada uma das fitas de DNA. Os nucleotídeos são então quimicamente ligados para formar novas fitas de DNA que são cópias exatas da fita original. Essas cópias, chamadas de fitas filhas, contêm metade da molécula original de DNA e metade de uma molécula totalmente nova. A replicação por este método é conhecida como replicação semiconservativa. O processo de replicação é importante porque fornece um método para as células transferirem uma duplicata exata de seu material genético de uma geração de células para a seguinte.

Matérias-primas

As principais matérias-primas usadas para a síntese de DNA incluem materiais de partida de DNA, taq DNA polimerase, primers, nucleotídeos e a solução tampão. Cada um deles desempenha um papel importante na produção de milhões de moléculas de DNA.

A síntese controlada de DNA começa com a identificação de um pequeno segmento de DNA a ser copiado. Normalmente, trata-se de uma sequência específica de DNA que contém o código de uma proteína desejada. Chamado DNA modelo, este material é necessário em concentrações de cerca de 0,1-1 microgramas. Ele deve ser altamente purificado porque mesmo traços dos compostos usados ​​na purificação do DNA podem inibir o processo de PCR. Um método para purificar uma fita de DNA é tratá-la com etanol a 70%.

Embora o processo de replicação do DNA fosse conhecido antes de 1980, a PCR não foi possível porque não havia polimerases de DNA estáveis ​​ao calor conhecidas. A DNA polimerase é a enzima que catalisa as reações envolvidas na síntese de DNA. No início da década de 1980, os cientistas descobriram bactérias que viviam ao redor de saídas de vapor naturais. Descobriu-se que esses organismos, chamados thermus aquaticus, tinha uma DNA polimerase que era estável e funcional em níveis extremos de calor. Este taq A DNA polimerase tornou-se a pedra angular das técnicas modernas de síntese de DNA. Durante um processo de PCR típico, 2-3 microgramas de taq A DNA polimerase é necessária. No entanto, se muito for usado, podem resultar sequências de DNA não específicas e indesejadas.

A polimerase constrói as fitas de DNA combinando os nucleotídeos correspondentes em cada fita de DNA. Quimicamente falando, os nucleotídeos são compostos de três tipos de grupos moleculares, incluindo uma estrutura de açúcar, um grupo fosfato e uma base cíclica. A porção de açúcar fornece a estrutura primária para todos os nucleotídeos. Em geral, os açúcares são compostos por cinco átomos de carbono com vários grupos hidroxi (-OH) ligados. Para o DNA, o açúcar é 2-desoxi-D-ribose. A parte definidora de um nucleotídeo é a base heterocíclica que está covalentemente ligada ao açúcar. Essas bases são grupos pirimidina ou purina e formam a base para o código de ácido nucleico. Dois tipos de bases purinas são encontrados, incluindo adenina e guanina. No DNA, dois tipos de bases pirimidínicas estão presentes, timina e citosina. Um grupo fosfato constitui a porção final de um nucleotídeo. Este grupo é derivado do ácido fosfórico e está covalentemente ligado à estrutura do açúcar no quinto carbono.

A primeira fase da reação em cadeia da polimerase (PCR) envolve a desnaturação do DNA. Essa "abertura" da molécula de DNA fornece o modelo para a próxima molécula de DNA a partir da qual será produzida. Com o DNA dividido em fitas separadas, a temperatura é reduzida - a etapa de recozimento do primer. Durante a próxima fase, a DNA polimerase interage com as fitas e adiciona nucleotídeos complementares ao longo de todo o comprimento. O tempo necessário nesta fase é de cerca de um minuto para cada 1.000 pares de bases.

Para iniciar a síntese de DNA, devem ser usadas seções de primer curtas de DNA. Essas seções de primer, chamadas de fragmentos de oligo, têm cerca de 18-25 nucleotídeos de comprimento e correspondem a uma seção do DNA molde. Eles normalmente têm uma concentração de nucleotídeos C e G de cerca de 60% com distribuição uniforme. Isso fornece a máxima eficiência no processo de síntese.

A solução tampão fornece o meio no qual a síntese de DNA pode ocorrer. Esta é uma solução aquosa que contém MgCl2, HCI, EDTA e KCI. A concentração de MgCl2 é importante porque os íons Mg2 + interagem com o DNA e os primers criando complexos cruciais para a síntese de DNA. A concentração recomendada é de um a quatro micromoles. O pH deste sistema é crítico, então ele também pode ser tamponado com sulfato de amônio. Para energizar a reação, várias moléculas de energia são adicionadas, como ATP, GTP e NTP. Esses compostos são os mesmos que os organismos vivos usam para impulsionar as reações metabólicas.

Outros materiais que podem ser usados ​​no processo incluem óleo mineral ou cera de parafina. Após a síntese do DNA estar completa, o DNA é tipicamente isolado e purificado. Alguns reagentes comuns usados ​​neste processo incluem fenol, EDTA e Proteinase K.

O processo de fabricação

A síntese de DNA é normalmente feita em pequena escala em laboratórios. Envolve três processos distintos, incluindo preparação de amostras, ciclo de reação de síntese de DNA e isolamento de DNA. Essas etapas de fabricação são normalmente realizadas em áreas separadas para evitar contaminação. Seguindo esses procedimentos, os cientistas são capazes de converter algumas fitas de DNA em milhões e milhões de cópias exatas.

Preparação das amostras

• 1 Para iniciar a síntese de DNA, as várias soluções são preparadas. Isso normalmente é feito em um gabinete de fluxo laminar equipado com uma lâmpada UV para minimizar a contaminação. Os cientistas usam luvas novas durante cada etapa de produção por motivos semelhantes. Normalmente, todas as soluções iniciais, exceto os primers, polimerases e dNTPs, são colocadas em uma autoclave para matar qualquer organismo contaminante. Duas soluções separadas são feitas. Um contém o tampão, os primers e a polimerase. O outro contém o MgCl2 e o DNA molde. Essas soluções são colocadas em pequenos tubos para iniciar a reação.

Kary Banks Muilis.

Kary Banks Muilis nasceu em Lenoir, Carolina do Norte, em 1944. Após se formar na Georgia Tech em 1966 com um B.S. em química, Muilis ingressou no programa de doutorado em bioquímica da University of California, Berkeley. Obtendo seu Ph.D. em 1973, ele aceitou um cargo de professor na University of Kansas Medical School, em Kansas City. Em 1977, ele assumiu uma bolsa de pós-doutorado na University of California, San Francisco.

Muilis aceitou o cargo de cientista pesquisador em 1979 com uma empresa de biotecnologia em crescimento - Cetus Corporation, em Emeryville, Califórnia - que sintetizou produtos químicos usados ​​por outros cientistas na clonagem genética. Enquanto estava lá, ele projetou a reação em cadeia da polimerase (PCR), uma técnica rápida e eficaz para reproduzir genes específicos ou fragmentos de DNA (ácido desoxirribonucléico) que podem criar bilhões de cópias em poucas horas. A maneira mais eficaz de reproduzir o DNA era por clonagem, mas era problemática. Demorou para convencer os colegas de Mullis da importância dessa descoberta, mas logo o PCR se tornou o foco de pesquisas intensivas. Cientistas da Cetus desenvolveram uma versão comercial do processo e uma máquina chamada Termociclador (com a adição dos blocos de construção químicos do DNA [nucleotídeos] e um catalisador bioquímico [polimerase], a máquina realizaria o processo automaticamente em uma peça-alvo de DNA).

Cetus concedeu a Muilis $ 10.000 para desenvolver a patente PCR, depois a vendeu por $ 300 milhões. Deixando a Cetus em 1986, Muilis se tornou um consultor privado de pesquisa bioquímica e recebeu o Prêmio Nobel em 1993.

ciclo de síntese de DNA

• 2 Após as soluções reagentes serem preparadas, o ciclo de PCR é iniciado. A primeira fase envolve a desnaturação do DNA. Uma das etapas iniciais mais importantes é a desnaturação completa do molde de DNA. A desnaturação do DNA significa essencialmente a separação da fita de ligação dupla. Essa "abertura" da molécula de DNA fornece o modelo para a próxima molécula de DNA a partir da qual será produzida. Uma desnaturação incompleta resultará em uma cópia ineficiente no primeiro ciclo, que afeta negativamente cada ciclo subsequente. A desnaturação inicial é feita aquecendo a solução do molde de DNA a 203 ° F (95 ° C) ao longo de um a três minutos. O tempo total depende da composição do modelo. Em ciclos repetidos, a etapa de desnaturação dura cerca de dois minutos e envolve o aquecimento da solução a 201PF (94 ° C). Materiais adicionais podem ser adicionados à solução para facilitar a desnaturação do DNA, como glicerol, DMSO ou formamida.
• 3 Com o DNA dividido em fitas separadas, a temperatura é reduzida para 122-149 ° F (50-65 ° C). Isso é conhecido como a etapa de recozimento do primer e dura cerca de dois minutos. Neste ponto, os primers esquerdo e direito se combinam e se ligam quimicamente com suas bases complementares no DNA molde.
• 4 A próxima fase envolve a etapa de extensão. Esta parte da reação ocorre quando a maior parte da fita de DNA é copiada. A temperatura do sistema é aquecida a cerca de 162 ° F (72 ° C) e mantida lá dependendo do comprimento do DNA a ser copiado. Nesse estágio, a DNA polimerase interage com as fitas e adiciona nucleotídeos complementares ao longo de todo o comprimento. O tempo necessário nesta fase é de cerca de um minuto para cada 1.000 pares de bases.
• 5 Após este primeiro ciclo, o ciclo de síntese de DNA é repetido. O número de ciclos depende da quantidade de DNA inicial e da quantidade de DNA desejada. Se menos de 10 cópias do DNA modelo estiverem disponíveis, serão necessários 40 ciclos. Com mais DNA inicial, 25-30 ciclos são suficientes.
• 6 Durante o último ciclo, a amostra é mantida a 162 ° F (72 ° C) por cerca de 15 minutos. Isso permite o preenchimento (com nucleotídeos) de qualquer extremidade saliente de uma nova fita de DNA. Nesse estágio, a polimerase adiciona nucleotídeos A extras em uma das extremidades das fitas de DNA.

isolamento de DNA

• 7 Quando as reações estão completas, o DNA é isolado dos materiais de reação da PCR, como a DNA polimerase, MgCl2 e os primers. Isso é feito pela adição de compostos como fenol, EDTA e Proteinase K. A centrifugação também é útil nesse sentido.

O Futuro

Embora os cientistas usem o PCR para a síntese de DNA regularmente, ainda há muito que não se sabe sobre a replicação do DNA. No futuro, a pesquisa deve elucidar os detalhes de várias etapas importantes do processo, como os componentes e intermediários envolvidos. Além disso, polimerases melhoradas podem ser desenvolvidas, tornando possível criar mais DNA a partir de amostras iniciais menores. Espera-se que um dia a síntese de DNA ajude a desbloquear alguns dos principais aspectos dos organismos vivos e leve ao desenvolvimento de medicamentos que irão curar vários tipos de câncer, infecções virais e bacterianas.