Decodificando os Genomas SARS-CoV-2 - Teste de Diagnóstico

“Testando, testando, testando!” é um slogan amplamente elogiado para controlar a pandemia COVID-19. A Organização Mundial da Saúde e outras agências federais / estaduais em todo o mundo publicaram essa frase de efeito familiar. Na verdade, testar populações humanas rapidamente é a pedra angular para controlar uma pandemia como a COVID-19.

Os testes extensivos fornecem uma base racional para a implementação de estratégias de saúde pública que podem prevenir a propagação da doença. Permite que as autoridades tomem decisões informadas sobre políticas de mitigação, como distanciamento social, permanência em casa e, em casos extremos, toque de recolher. Na esteira de uma doença transmitida pelo ar como a COVID-19, essas iniciativas cruciais de saúde pública são vitais para reduzir a pressão sobre os sistemas de saúde e salvar vidas humanas.

A análise baseada no genoma é a chave para projetar um kit de teste específico para SARS-CoV-2. Este é o caso, quer estejamos projetando kits baseados em DNA (PCR, amplificação isotérmica, CRISPR) ou gerando antígenos para detecção sorológica . Uma organização global sem fins lucrativos compilou uma lista de todos os testes SARS-CoV-2 que estão disponíveis comercialmente. Aqui, discutiremos as duas técnicas principais que estão atualmente em uso:teste baseado em DNA e teste baseado em anticorpos.

Teste baseado em DNA

Os testes atuais para COVID-19 realizados em material genético viral de esfregaços de nariz e garganta usam uma técnica comum de biologia molecular chamada Reação em Cadeia da Polimerase de Transcrição Reversa (RT-PCR). Outro teste emprega a mais recente tecnologia de amplificação de ácido nucléico isotérmico desenvolvida por Abbot Labs ¹ . Ambos os testes são altamente sensíveis. Eles atuam amplificando uma região do genoma que é específica do vírus SARS-CoV-2. Esta amplificação é iniciada por um par de oligonucleotídeos (também chamados de primers) que são complementares às sequências virais.

O método atual de RT-PCR inclui a extração de RNA viral de cotonetes de nariz e garganta e a transcrição reversa do RNA em DNA, seguida por uma reação de PCR. O método de PCR usa uma estratégia de ciclagem de temperatura que envolve a desnaturação do molde e o anelamento de primers curtos com sequências complementares no molde. A extensão do complexo iniciador-molde, facilitada pela enzima polimerase, leva à amplificação exponencial dos amplicons alvo. Os resultados são obtidos em poucas horas. Protocolos detalhados sobre o método de PCR são compartilhados pela OMS e pelo CDC. Pelo contrário, o método isotérmico dos laboratórios Abbott não é limitado pela restrição da ciclagem térmica e os resultados positivos para COVID-19 são obtidos em 5 minutos, enquanto resultados negativos são obtidos em 13 minutos ¹ .

As regiões únicas no SARS-CoV-2 identificadas por análises comparativas do genoma servem como marcadores distintivos para a concepção de primers ou sondas usadas em kits baseados em DNA. O SARS-CoV-2 é um vírus de RNA de fita simples com um genoma de quase 30.000 bases. O genoma viral codifica quatro proteínas estruturais, a saber, as proteínas do envelope (E), da membrana (M), do nucleocapsídeo (N) e do pico (S).

As análises comparativas do genoma identificaram diferentes regiões exclusivas do SARS-CoV-2. A singularidade da sequência é validada pela pesquisa de sequências semelhantes usando o algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) no banco de dados do GenBank, um repositório global de todos os genomas sequenciados. As regiões únicas em genes como ORF1ab, N, RdRp e S são atualmente usadas como iniciadores no diagnóstico de RT-PCR SARS-CoV-2 ² , enquanto o teste rápido ID NOW ™ COVID-19 da Abbott tem como alvo o gene RdRp.

Novos métodos no horizonte

CRISPR, uma tecnologia popular de edição de genes, é considerada uma opção escalonável para testes populacionais. Este método usa a capacidade da máquina CRISPR de reconhecer sequências genéticas específicas e cortá-las. O CRISPR também corta uma molécula repórter adicionada à reação que pode revelar rapidamente a presença de material genético viral. O SHERLOCK baseado em CRISPR (Desbloqueio específico de repórter enzimático de alta sensibilidade) é descrito como um método de vareta de medição de papel que pode produzir resultados em uma hora. SHERLOCK foi co-desenvolvido por Feng Zhang do Broad Institute of MIT e Harvard ³ . Outro método desenvolvido por Jennifer Doudna na University of California, Berkeley, usurpa a pré-amplificação isotérmica com DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Repórter (DETECTR) para coronavírus. DETECTR pode fornecer resultados em 30 minutos ⁴ .

Os métodos baseados em sequência fornecem informações críticas sobre a presença ou ausência do vírus em um paciente, informações que são especialmente valiosas no desenvolvimento de políticas públicas de saúde e segurança. Atualmente, nos EUA, testamos apenas pessoas que apresentam sintomas de COVID-19. No entanto, com uma doença como a COVID-19, há uma séria ameaça de que pessoas assintomáticas possam espalhar o vírus na comunidade.

Como sabemos se uma pessoa já teve a infecção SARS-CoV-2 e desenvolveu imunidade?

Teste baseado em anticorpos

O teste de anticorpos identifica indivíduos assintomáticos que já tiveram infecção e provavelmente estão imunes. O teste de anticorpos também é a melhor estratégia para rastrear toda a população e aliviar o medo da disseminação da comunidade. Indivíduos com resultados de anticorpos positivos também podem ser uma fonte potencial de plasma que pode ser injetado em pacientes COVID-19, uma abordagem que está sendo testada atualmente nos EUA.

Os testes de anticorpos requerem algum conhecimento das proteínas que são cruciais para o vírus, por exemplo, a proteína do revestimento viral. Idealmente, as proteínas virais que ativam o sistema imunológico são as melhores candidatas, pois iniciam a produção de anticorpos que sinalizam ou neutralizam o vírus. É então necessário produzir essas porções ou seções da proteína viral no laboratório e transfectá-las em linhas celulares para inclusão em um imunoensaio como o ELISA que detecta a presença de anticorpos.

Esses imunoensaios podem formar a base para kits de testes caseiros para detectar imunidade a doenças como COVID-19. No entanto, o desenvolvimento desses kits leva tempo. O gargalo mais desafiador neste processo é expressar a proteína ou segmento de proteína na conformação correta.

A proteína spike SARS-CoV-2 apresenta uma via potencial para o desenvolvimento de diagnósticos, uma vez que possui poucas regiões exclusivas. Várias equipes estão testando o domínio de ligação ao receptor da proteína S, enquanto algumas estão investigando toda a proteína spike ² . Outros candidatos potenciais incluem a proteína do nucleocapsídeo e a proteína S. O FDA está avaliando diferentes métodos de teste de anticorpos e aprovou recentemente o primeiro teste, que ajudará a determinar quantas pessoas na população têm imunidade ⁵ .





Em meio à pandemia de COVID-19 de hoje, os testes diagnósticos baseados em DNA e em anticorpos estão fazendo uma diferença crucial nas iniciativas de saúde pública que adotamos para conter e mitigar o vírus SARS-CoV-2. À medida que nos esforçamos para “nivelar a curva”, os testes rápidos são importantes.

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Modelagem e simulação propõe novos insights para SARS-CoV-2 Decodificando os Genomas SARS-CoV-2 - Origem