Comparação entre o ácido fólico e a funcionalização baseada no peptídeo gH625 de nanopartículas magnéticas Fe3O4 para internalização celular aprimorada

Resumo

Uma rota sintética versátil baseada em Fe magnético ₃ O ₄ A pré-funcionalização de nanopartículas (MNP) com uma monocamada de ácido fosfônico tem sido usada para ligar covalentemente o peptídeo gH625 na superfície das nanopartículas. O gH625 é um peptídeo membranotrópico capaz de cruzar facilmente as membranas de várias células, incluindo os componentes típicos da barreira hematoencefálica humana. Uma rota sintética semelhante foi usada para preparar outra classe de MNPs com um revestimento funcional baseado em PEG, rodamina e ácido fólico, uma molécula alvo bem conhecida, para comparar o desempenho dos dois sistemas de penetração celular (ou seja, gH625 e fólico ácido). Nossos resultados demonstram que a captação de MNPs decorados com gH625 em células endoteliais microvasculares do cérebro humano imortalizadas após 24 h é mais evidente em comparação com MNPs funcionalizados com ácido fólico, conforme evidenciado por microscopia confocal de varredura a laser. Por outro lado, ambos os sistemas funcionalizados mostraram-se capazes de serem internalizados em uma linha de células tumorais cerebrais (ou seja, glioblastoma A-172). Esses achados indicam que a funcionalização de MNPs com gH625 melhora sua internalização de células endoteliais, sugerindo uma estratégia viável no projeto de nanoestruturas funcionais capazes de primeiro cruzar a BBB e, a seguir, atingir células cerebrais tumorais específicas.

Histórico

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma interface dinâmica entre o sangue e o cérebro que desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase do sistema nervoso central (SNC). Os principais componentes do BBB são as células endoteliais (ou seja, astrócitos e pericitos), que formam uma folha contínua cobrindo a superfície interna dos microvasos do cérebro. Eles são interconectados por junções justas, que são críticas tanto para o controle da permeabilidade vascular BBB [1] quanto para a proteção do cérebro de várias toxinas circulantes e outras moléculas prejudiciais [2, 3]. Neurônios e microglia, que são outros componentes da unidade neurovascular, desempenham um papel diferente no BBB [4, 5].

Devido à folha contínua da célula endotelial, 98% dos fármacos de moléculas pequenas e 100% dos fármacos de moléculas grandes não passam pela BBB, deixando de entregar os fármacos ao tecido cerebral [6]. Portanto, a fim de desenvolver sistemas de entrega eficientes para o tratamento de muitas doenças cerebrais, é crucial investigar a capacidade dos portadores de passar pelo BBB [7].

Na última década, os sistemas baseados em nanopartículas foram amplamente estudados como agentes terapêuticos eficazes para o direcionamento e terapia do câncer. Nesse contexto, nanopartículas de ferro magnético funcionalizadas orgânicas (MNPs) têm despertado muito interesse, pois combinam a versatilidade da funcionalização da superfície com as propriedades magnéticas e a natureza biocompatível atóxica de seu núcleo. Os MNPs são amplamente adotados para aplicações teranósticas (diagnósticas e terapêuticas), como classificação e manipulação de proteínas e células [8, 9], marcação de células [10, 11], distribuição de drogas controlada magneticamente [12, 13], imagem por ressonância magnética (MRI) [14, 15] e hipertermia [16,17,18,19]. Para serem usados com eficiência para aplicações biomédicas, os MNPs devem ser capazes de atravessar as membranas celulares e, em particular, de atravessar as várias barreiras biológicas. A modificação da superfície dos MNPs com moléculas funcionais tem sido freqüentemente usada para melhorar sua internalização celular, mas em muitos casos, o cruzamento da BBB continua sendo um problema.

Neste contexto, o uso de peptídeos de penetração celular (CPPs), um grupo de peptídeos relativamente curtos (5-40 aminoácidos) derivados de fontes naturais ou de construções projetadas sinteticamente, que podem facilmente atravessar a bicamada da membrana, pode ser visto como uma abordagem promissora. Entre os numerosos CPPs disponíveis, o peptídeo de 20 resíduos gH625, derivado da glicoproteína H (gH) do vírus Herpes simplex 1, foi recentemente desenvolvido e usado para cruzar o BBB para aumentar a absorção de uma variedade de cargas [20, 21] no citosol.

No presente estudo, os MNPs foram funcionalizados com duas classes diferentes de revestimentos de direcionamento com base em uma camada de acoplamento de ácido 3-aminopropilfosfônico (NH ₂ -PA). Os dois revestimentos foram obtidos conectando-se ao NH ₂ -PA-MNPs modificados (NH ₂ @MNPs) ou o peptídeo de penetração celular gH625 (gH625 @ MNPs) ou moléculas de PEG e ácido fólico (PEG, FA @ MNPs). Em particular, a introdução de ácido fólico (AF) nas nanopartículas PEGuiladas visa melhorar tanto a captação celular em células tumorais por meio da internalização mediada pelo receptor de FA [22] e a biocompatibilidade do nanossistema geral [23]. Os efeitos dos dois revestimentos de superfície na captação intracelular de MNP em células endoteliais microvasculares primárias do cérebro humano (HBMECs) foram avaliados por microscopia confocal de varredura a laser. Para tanto, sondas luminescentes foram incorporadas a ambos os sistemas. Em particular, gH625 foi marcado com a sonda 4-cloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD), enquanto um carboxi- X -rodamina (rhod) sonda foi adicionada ao invólucro de PEG, FA @ MNPs.

O estudo da captação intracelular de MNPs modificados com gH625 em células endoteliais e sua comparação com os MNPs modificados com FA, até onde sabemos, nunca foram relatados antes.

Além da capacidade de cruzar o BBB, alvejar células tumorais cerebrais é outro requisito importante para agentes terapêuticos de tumor cerebral. Portanto, a internalização celular dos dois MNPs revestidos de forma diferente em um dos gliomas malignos humanos mais comuns, o glioblastoma A-172, também foi avaliada.

Observe que embora nanopartículas de ferro funcionalizadas com gH625 tenham sido preparadas recentemente por Perillo et al. [24], no presente trabalho, relatamos uma estratégia sintética diferente baseada em uma plataforma de ácido fosfônico altamente versátil. Em particular, a química do ácido fosfônico permite a formação de ligações fortes entre MNPs e monocamadas fosfônicas cuja estabilidade é comparável à do MNP silanizado. Além disso, uma vez que a autocondensação de P-O-P é desprezível, o uso de ligantes fosfônicos supera as desvantagens de formação de oligômero que são freqüentemente encontradas ao usar silanos [25].

Métodos

Materiais

Todos os reagentes usados para a síntese e funcionalização de MNP, FeCl ₂ · 4H ₂ O, FeCl ₃ · 6H ₂ O, ácido 3-aminopropilfosfônico, ácido metoxipolietilenoglicol acético N -succinimidil éster (PEG-NHS) com peso molecular 5000 Da, ácido fólico, N -hidroxissuccinimida (NHS), e carboxi- X -rodamina N -succinimidil éster (Rhod-NHS) foram adquiridos da Sigma-Aldrich e usados sem purificação adicional. Os aminoácidos protegidos com 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) usados para a síntese de peptídeos foram adquiridos por Romil Del Chimica, Chemicals, e foram usados sem purificação adicional. A água era de grau Milli-Q (18,2 MO cm) e foi filtrada através de um filtro de 0,22 μm.

Síntese de MNPs

Os MNPs de óxido de ferro puro foram sintetizados pela co-precipitação alcalina de Fe ³⁺ e Fe ²⁺ , de acordo com o protocolo descrito na literatura [26]. Resumidamente, FeCl ₂ · 4H ₂ O e FeCl ₃ · 6H ₂ O (razão molar 1:2) foram dissolvidos em água (50 ml) sob um N ₂ atmosfera com agitação vigorosa. NH ₃ 25% em H ₂ O (5 mL) foi adicionado à solução a 80 ° C, e a reação foi continuada durante 30 min. A suspensão resultante foi resfriada à temperatura ambiente e lavada com água ultrapura. As nanopartículas magnéticas nuas obtidas (MNPs nuas) foram isoladas do solvente por decantação magnética.

Síntese de gH625

O peptídeo foi preparado conforme relatado anteriormente [27], adotando o método padrão de fase sólida 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc). Resumidamente, 50 μmol do peptídeo foi sintetizado em uma resina Wang (0,75 mmol / g) por ciclos consecutivos de desproteção e acoplamento. O péptido ligado à resina foi então feito reagir com 4-cloro-7-nitrobenzofurazano (NBD-Cl); a reação foi realizada durante a noite na presença de DIPEA. O péptido foi clivado da resina e desprotegido por tratamento com uma mistura de ácido trifluoroacético (TFA) e eliminadores e depois precipitado em éter etílico gelado. O péptido foi dissolvido em água e liofilizado. A caracterização do peptídeo bruto foi realizada por ionização por eletropulverização (ESI) LC-MS adotando um gradiente linear de acetonitrila (0,1% TFA) em água (0,1% TFA) de 20 a 80% em 15 min. Foi então purificado por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa preparativa (RP-HPLC).

Síntese de N Éster de ácido fólico -hidroxissuccinimida (FA-NHS)

FA-NHS foi preparado pelo seguinte método publicado [28]. Quinhentos miligramas de ácido fólico (FA) foram dissolvidos em 10 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) com 240 ml de trietilamina. NHS (260 mg) e N , N -diciclohexilcarbodiimida (470 mg) foram adicionados, e a mistura foi feita reagir durante a noite à temperatura ambiente no escuro. O subproduto, diciclohexilureia, foi removido por filtração. A solução de DMSO foi então concentrada sob pressão reduzida e FA-NHS foi precipitado em éter dietílico. O produto foi lavado várias vezes com éter anidro e seco ao ar.

Síntese de MNPs funcionalizados

Síntese de NH ₂ @MNPs

MNPs (200 mg) foram dispersos em H ₂ O (25 ml) usando um banho ultrassônico por 30 min. NH ₂ Foi adicionado -PA (100 mg) e a suspensão foi agitada durante 2 h à temperatura ambiente. As partículas foram separadas magneticamente e lavadas quatro vezes com H ₂ O e depois com etanol e seco ao ar.

Síntese de gH625 @ MNPs

NH ₂ @MNPs (300 mg) e gH625 (1,2 mg) foram dispersos em DMSO (20 ml). A solução foi misturada durante a noite a 25 ° C. As partículas obtidas foram separadas magneticamente; lavado com DMSO, H ₂ O, e etanol; e seco ao ar.

Síntese de PEG, FA @ MNPs

NH ₂ @MNPs (300 mg), PEG-NHS (30 mg), FA-NHS (3 mg) e Rhod-NHS (3 mg) foram dispersos em DMSO (15 ml) e a solução foi misturada durante a noite a 25 ° C . As partículas obtidas foram separadas magneticamente; lavado com DMSO, H ₂ O, e etanol; e seco ao ar.

Amostra de caracterizações

As medições de difração de pó de raios-X (XRD) foram realizadas com um θ - θ Difratômetro 5005 Bruker-AXS (Zeiss, Oberkochen, Alemanha) usando radiação Cu Kα operando a 40 kV e 30 mA. A espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) foi realizada com um espectrômetro ESCA-Auger multi-técnica PHI 5600 com uma fonte de raios-X Al-Kα padrão. As análises foram realizadas com um ângulo de fotoelétrons de 45 ° (em relação à superfície da amostra) com um ângulo de aceitação de ± 7 °. A escala de energia de ligação XPS (B.E.) foi calibrada centralizando o pico C 1s devido às frações de hidrocarbonetos e carbono adventício em 285,0 eV. As medições de UV / Vis foram realizadas com um espectrofotômetro JASCO V-560 UV / Vis, e os espectros foram registrados com uma resolução de ± 0,2 nm. Espalhamento de luz dinâmico (DLS) e medições de potencial zeta de MNPs foram realizadas a 25 ° C com um Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) equipado com laser He-Ne (633 nm) e um detector de retroespalhamento (173 ° ) As medições de transmissão FT-IR foram registradas com um espectrômetro JASCO FTIR 430, usando a técnica de pelota KBr, com 100 varreduras coletadas por espectro (faixa de varredura 560-4000 cm ^{- 1} , resolução 4 cm ^{- 1} )

Cultura de células

As células endoteliais microvasculares do cérebro humano (HBMEC) e a linha de células de glioblastoma humano A-172 foram cultivadas até a confluência em frascos de cultura de tecido revestidos com colágeno tipo I de cauda de rato, de acordo com o método relatado [29]. Resumidamente, as HBMEC foram cultivadas no meio de células endoteliais suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de suplemento de crescimento de células endoteliais. A linha de células A-172 foi cultivada em DMEM contendo 2 mM de glutamina e 10% de FBS como descrito anteriormente [30]. Em ambos os casos, 100 U / ml de penicilina e 100 μg / ml de estreptomicina também foram adicionados às culturas.

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi determinada com o [3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2 H teste de brometo de tetrazólio] (MTT) [31]. Em todas as condições experimentais, a concentração de FBS foi reduzida para 1% (meio de fome). As células foram semeadas em placas de 96 poços a 7000 células / poço para obter densidade celular ideal ao longo do experimento. Em todos os ensaios, as células foram primeiro incubadas a 37 ° C com MTT durante 3 h; em seguida, isopropanol com 0,04 M de HCl foi adicionado, e a absorvância foi medida em 1 h em um leitor de placas (Synergy 2-BioTek) com um comprimento de onda de teste de 570 nm [32].

Microscopia Confocal

A microscopia confocal foi realizada em células de glioblastoma HBMEC e A-172 cultivadas em vidros de cobertura de microscópio colocados em uma placa de 24 poços. Após incubações com ou sem MNPs, as células foram fixadas pela adição de paraformaldeído a 4% em PBS e processadas para imunocitoquímica, conforme descrito anteriormente [33]. As análises de microscopia confocal foram realizadas com um microscópio de varredura a laser confocal Olympus FV1000 (LSM) equipado com as seguintes fontes de excitação:laser de diodo (405 nm), laser Ar multilinha (457, 488 e 515 nm), laser HeNe (G) ( 543 nm) e laser HeNe (R) (633 nm). Foi utilizada uma objetiva de imersão em óleo (60xO PLAPO), e a luz emitida foi detectada em modo sequencial através de um sistema de filtragem espectral. O ganho do detector foi fixado em um valor constante e as imagens foram obtidas para todas as amostras em locais aleatórios em toda a área do poço. Os seguintes parâmetros de aquisição foram usados: λ ex / em =405/425 - 475 nm (canal azul, coloração nuclear por DAPI); λ ex / em =488/500 - 530 nm (canal verde, marcação gH625 @ MNPs por NBD); e λ ex / em =633/650 - 700 nm (canal vermelho, PEG, FA @ MNPs rotulagem por rhod). A análise quantitativa da fluorescência foi realizada usando o software ImageJ (versão 1.50i, NIH).

Resultados e discussão

Síntese e caracterização de MNPs

A estratégia geral implementada para preparar gH625 @ MNPs e PEG, FA @ MNPs de Fe ₃ O ₄ nanopartículas, obtidas por co-precipitação, envolve duas etapas conforme ilustrado na Fig. 1. A primeira etapa, que é a mesma para ambas as classes de nanopartículas, é baseada na funcionalização de MNP com um ácido fosfônico contendo um grupo amino (NH ₂ -PA). Na segunda etapa, o NH ₂ -PA-MNPs pré-funcionalizados (NH ₂ @MNPs) são ainda conjugados com moléculas funcionais específicas por meio de reações de acoplamento NHS. Em particular, o N -hidroxissuccinimida ativada forma de gH625 marcada com NBD foi usada para a preparação de gH625 @ MNPs, e N As formas ativadas de -hidroxissuccinimida de PEG, FA e Rhod foram usadas para obter PEG, FA @ MNPs. Observe que tanto gH625 @ MNPs quanto PEG, FA @ MNPs foram marcados com sondas luminescentes (isto é, NBD e Rhod, respectivamente) para realizar estudos de microscopia confocal de varredura a laser.

Esquema de reação. Etapas de reação para a preparação de MNPs funcionalizados

A caracterização difratométrica de raios-X (XRD) de MNPs nus obtidos após a etapa de co-precipitação é semelhante ao relatado em nossos artigos anteriores [34, 35]. Resumidamente, um padrão típico (Fig. 2a) mostra quatro picos de difração (2 θ =30,16 °, 35,48 °, 43,10 ° e 57,04 °) que é consistente com a presença de magnetita, maghemita ou qualquer composição intermediária entre as duas fases. A constante de rede, a , que foi encontrado para ser 8,389 (4) Å em bom acordo com o parâmetro de rede da magnetita em massa (8,396 Å), bem como o tamanho médio do cristal de 11,2, determinado aplicando a equação de Debye-Scherrer, são comparáveis com os valores anteriores relatado [34, 35].

Espectros XRD e XPS típicos de MNPs. Padrão de XRD de a) MNPs simples e Fe 2p de alta resolução _3/2 Regiões espectrais XPS de b) MNPs nus ec) NH ₂ @MNPs

Observe que, como a estrutura cristalina do Fe ₃ O ₄ magnetita é muito semelhante à de γ-Fe ₂ O ₃ maghemita, é muito difícil distinguir as duas fases por XRD. Por esse motivo, a espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) foi usada para analisar mais detalhadamente os MNPs. A Figura 2b mostra Fe 2p _3/2 espectros XPS de alta resolução de MNPs nus. O centróide da banda, observado em 710,9 eV, corresponde ao Fe 2p _3/2 pico. Este valor é inferior ao relatado para Fe ³⁺ tanto em orifícios octaédricos de α-Fe ₂ O ₃ (711,6 eV) [36, 37] ou em orifícios tetraédricos e octaédricos mistos de γ-Fe ₂ O ₃ (711,4 eV), e é consistente com o estado de oxidação mista de Fe em Fe ₃ O ₄ [37, 38].

Finalmente, uma caracterização magnética detalhada de MNPs semelhantes é relatada em nossos artigos anteriores [34, 35].

O processo de funcionalização foi avaliado por FT-IR e XPS. Após funcionalização com monocamadas fosfônicas, o Fe 2p _3/2 banda (Fig. 2c) não mostra modificações relevantes, confirmando assim que o Fe ₃ O ₄ fase é retida. No entanto, uma ligeira mudança (0,4 eV) do Fe 2p _3/2 Observou-se centróide para menor energia de ligação (B.E), que foi associada à ancoragem da monocamada fosfônica. Mudanças semelhantes foram, de fato, observadas na adsorção de fosfato de vários óxidos férricos [39] e podem ser atribuídas a alguma transferência de carga do adsorbato para átomos de Fe. The Fe 2p _3/2 A posição de 710,5 eV foi mantida após todas as etapas de funcionalização para ancoragem do PEG e AF.

A Figura 3 relata a comparação das regiões espectrais P2p, N1s e C 1s de NH ₂ @MNPs, PEG, FA @ MNPs e gH625 @ MNPs, respectivamente. A posição do pico P2p (133,2 eV) de NH ₂ @MNPs está tipicamente associado à presença do ácido fosfônico ancorado na superfície de forma bidentada [40,41,42,43]. A posição da banda P2p no espectro de gH625 @ MNPs e PEG, FA @ MNPs é a mesma observada em NH ₂ Espectro @MNPs, revelando assim que as moléculas fosfônicas não são removidas durante as reações de acoplamento para a imobilização do peptídeo e ácido fólico.

Caracterização XPS de MNPs funcionalizados. Regiões espectrais de alta resolução P 2p, C 1s e N 1s XPS de a) NH ₂ @MNPs, b) PEG, FA @ MNPs e c) gH625 @ MNPs

A forma e a posição do pico dos espectros N1s de NH ₂ @MNPs são consistentes com a presença do NH ancorado ₂ -PA. A banda consiste em dois componentes distintos:o primeiro em 399,9 eV está associado aos grupos –NH do aminopropilfosfato ancorado, e o segundo componente centrado em 401,5 eV é devido aos grupos amino interagindo com a superfície de Fe ₃ O ₄ através da protonação ou formação de ligações –H.

Após a ancoragem do peptídeo gH625 ou FA, PEG e Rhod, o componente N1s em 399,8 eV aumenta em comparação com o componente em 401,8 eV relacionado a porções amino protonadas de NH ₂ @MNPs. Este incremento é devido aos sinais sobrepostos dos átomos de N envolvidos na ligação amídica (400,2 eV) entre o aminopropilfosfato ancorado e as moléculas conjugadas (por exemplo, gh625, FA, PEG e Rhod), bem como dos átomos de N de gh625 e FA (em 399,1 e 400,6 eV).

A banda C 1s de NH ₂ O espectro @MNPs consiste em um único pico em 285,0 eV atribuído a carbonos alifáticos, conforme relatado anteriormente [40].

Nos espectros C1s de gH625 @ MNPs e PEG, FA @ MNPs, a presença de um componente C 1s em 288,3 eV é devido aos grupos carboxílicos e amídicos das moléculas gh625, FA e Rhod.

Espectros FT-IR de NH ₂ @MNPs, gH625 @ MNPs e PEG, FA @ MNPs são relatados na Fig. 4. Em todas as amostras, os espectros não mostram as bandas em 1250 cm ^{- 1} devido a P =O e os picos agudos em 900-1050 cm ^{- 1} varia devido ao alongamento P – O – H [44,45,46], mas uma banda larga e forte em 1040 cm ^{- 1} , que está associado às vibrações do PO ₃ ²⁻ grupo ligado à superfície de ferro. Esta banda indica, de acordo com os resultados do XPS, que os ácidos fosfônicos são desprotonados e estão ancorados na superfície por meio de ligações P – O – Fe, conforme relatado anteriormente [34, 40, 41]. A região espectral de IV entre 1500 e 1700 cm ^{- 1} mostra as bandas pertencentes aos grupos amino e amida de gH625 e FA. Em particular, espectro de NH ₂ @MNPs mostra um pico nítido em torno de 1650 cm ^{- 1} associado ao NH ₂ flexão [47]. Após a ancoragem PEG, Rhod e FA, 1700–1500 cm ^{- 1} região de PEG, FA @ MNPs mostra bandas mais largas devido à convolução das vibrações de NH não reagido ₂ , grupos amida e anéis de benzeno de FA e Rhod (1630-1600 cm ^{- 1} ) [35]. Analogamente, após a ancoragem do peptídeo, as bandas largas em cerca de 1650-1600 cm ^{- 1} pode ser devido à contribuição de várias vibrações devido ao NH ₂ não reagido e porções amínicas das cadeias laterais do peptídeo e ao trecho C =O das ligações amídicas do peptídeo [48]. Além disso, um componente em cerca de 1540 cm ^{- 1} devido ao δ combinado As vibrações (N – H) / ν (C – N) do peptídeo [48] também estão presentes.

Caracterização de FT-IR de MNPs funcionalizados. Região espectral FT-IR em 850-1900 cm ⁻¹ intervalo de a) NH ₂ @MNPs, b) gH625 @ MNPs e c) PEG, FA @ MNPs

A ancoragem de FA em MNPs também foi comprovada pelos espectros de UV / Vis de uma solução coloidal de PEG, FA @ MNPs. A Figura 5 compara os espectros de NH ₂ @MNPs e PEG, dispersões coloidais de FA @ MNPs. O espectro de uma solução de FA (5 μM) foi adicionado como uma referência. Uma banda evidente em 274 nm típica do FA é claramente visível tanto na referência quanto na solução coloidal de PEG, FA @ MNPs, confirmando assim a presença de FA nos MNPs. Observe que o ligeiro deslocamento é da absorção de FA-NHS em 280 nm para o valor de 274 nm após a ancoragem é provavelmente devido à mudança do ambiente de FA-NHS livre e FA ancorado em nanopartículas. A presença de deslocamentos variáveis da banda de absorção em 280 nm após a ancoragem da superfície de FA ou conjugação com outras moléculas já foi observada na literatura [49,50,51].

Caracterização UV / Vis de MNPs funcionalizados. Espectros UV / Vis de uma solução 5 μM FA-NHS e de NH ₂ @MNPs e PEG, FA @ MNPs dispersões coloidais. Observe que o fundo alto observado no espectro de NH ₂ @MNPs e PEG, FA @ MNPs é devido ao espalhamento da dispersão coloidal de nanopartículas

O diâmetro hidrodinâmico médio, o índice de polidispersidade (PDI) e o potencial zeta de MNPs funcionalizados foram determinados por DLS em tampão PBS a pH 7,4 em dispersões de MNP preparadas e após 72 h de envelhecimento (Tabela 1). Os diâmetros hidrodinâmicos de NH ₂ -PA @ MNPs, gH625 @ MNPs e PEG, FA @ MNPs foram 73,0 ± 3,0 nm, 104,0 ± 4,0 nm e 51 ± 2 nm, respectivamente, e os valores de PDI indicam uma distribuição suficientemente estreita do tamanho de partícula. Como esperado, a conjugação com gH625 aumentou o tamanho das nanopartículas, enquanto o decréscimo no tamanho do PEG, FA @ MNPs é devido a uma melhor dispersão do que o NH ₂ @MNPs, relacionado à presença das cadeias de PEG.

Em qualquer caso, observe que o potencial zeta altamente negativo (<- 30 mV) foi observado para todos os sistemas. Esses valores de potencial zeta negativos garantem estabilidade a longo prazo e evitam a agregação de partículas extensa [52, 53]. Na verdade, a carga superficial negativa era apenas ligeiramente dependente do revestimento, mas resultou principalmente da combinação do núcleo carregado negativamente de Fe ₃ O ₄ nanopartículas [54] e o efeito de grupos de ácido fosfônico conforme observado para sistemas semelhantes [52, 34]. Portanto, em comparação com outras estratégias sintéticas usadas para funcionalizar MNPs, o uso de monocamadas de ácido fosfônico como ligantes não só permite a formação de ligações estáveis entre a superfície e os grupos funcionais, mas também induz potencial zeta altamente negativo. Após 72 horas de envelhecimento, o tamanho e o potencial zeta de NH ₂ -PA @ MNPs, gH625 @ MNPs e PEG, FA @ MNPs permanecem aproximadamente os mesmos, sugerindo que todas as superfícies decoradas são estáveis ao longo do tempo.

Viabilidade celular

A viabilidade de células HBMEC e A-172 incubadas com gH625 @ MNPs e FA, PEG @ MNPs foi avaliada usando o ensaio de MTT em diferentes tempos de incubação e na presença de diferentes concentrações de nanopartículas (10 e 20 μg / ml). Conforme mostrado na Fig. 6, nenhuma concentração e / ou efeito citotóxico dependente do tempo (24-48-72 h) dos sistemas decorados em células HBMEC e A-172 foi observada.

Viabilidade celular. Viabilidade celular de a HBMEC e b Células A-172 incubadas por 24, 48 e 72 h com gH625 @ MNPs 10 μg / ml (barra preta), gH625 @ MNPs 20 μg / ml (barra vermelha), PEG, FA @ MNPs 10 μg / ml (barra azul ), e PEG, FA @ MNPs 20 μg / ml (barra magenta)

Captação intracelular

A fim de determinar se a capacidade de penetração celular do peptídeo gH625 é retida após sua imobilização na superfície das nanopartículas e comparar a capacidade de gH625 e FA de cruzar a BBB, a internalização em células endoteliais do cérebro humano de gH625 @ MNPs marcados com NBD e PEG marcado com Rhod, FA @ MNPs foram investigados com microscopia confocal de varredura a laser.

Após 24 h de incubação, a absorção de PEG-FA @ MNPs não é evidente, enquanto a internalização de gH625 @ MNPs é claramente visível (Fig. 7). A conjugação com gH625 leva a uma absorção mais rápida e a uma intensidade quase duas vezes maior da fluorescência intracelular (Fig. 8).

Micrografias de fluorescência LSM de HBMEC. Micrografias de fluorescência LSM de HBMEC incubadas por 24 h ( b , f ) e 72 h ( d , h ) com gH625 @ MNPs rotulado com NBD 15 μg / ml ( b , d ) e seus controles ( a , c ) ou PEG rotulado com rod, FA @ MNPs 15 μg / ml ( f , h ) e seus controles ( e , g ) Barra de escala =20 μm

Intensidades normalizadas de fluorescência intracelular. Análise quantitativa da fluorescência intracelular após incubação de HBMEC em 24 e 72 h com gH625 @ MNPs marcado com NBD e FA marcado com Rhod, PEG @ MNPs

Para tempos de incubação mais longos (72 h), as diferenças entre a internalização dos dois sistemas são reduzidas. Este comportamento não é inesperado, pois para longos tempos de incubação, processos de internalização inespecíficos de FA, PEG @ MNPs podem ocorrer e nossos resultados confirmam o que relatamos anteriormente para a absorção de nanopartículas de poliestireno funcionalizadas e não funcionalizadas [55].

Para explorar ainda mais a possibilidade de usar gH625 @ MNPs como um agente terapêutico para tumores cerebrais, as captações celulares de gH625 @ MNPs e FA, PEG @ MNPs foram investigadas usando a linha de células de glioblastoma A-172. O glioblastoma é um dos tumores cerebrais primários mais comuns e também um dos cânceres mais letais.

A absorção celular de gH625 @ MNPs e FA, PEG @ MNPs após 24 h de incubação são comparáveis, como mostrado na Fig. 9.

Micrografias de fluorescência LSM de células de glioblastoma. Micrografias de fluorescência LSM de células de glioblastoma. Imagens mescladas em azul esverdeado:células de controle ( a ) e células incubadas com 15 μg / ml de gH625 @ MNPs marcado com NBD ( b ) Imagens azul-vermelho mescladas:células de controle ( c ) e células incubadas com 15 μg / ml de PEG marcado com rhod, FA @ MNPs ( d ) Barra de escala =20 μm

Este comportamento sugere que o gH625 é capaz de direcionar o tumor cerebral com a mesma eficiência da unidade de direcionamento de FA mais frequentemente adotada.

Conclusões

Fe ₃ O ₄ nanopartículas foram funcionalizadas com o peptídeo de penetração celular viral gH625 adotando uma rota versátil baseada na pré-funcionalização de MNP com uma monocamada que consiste em um ligante fosfônico bifuncional, ácido 3-aminopropilfosfônico. The cell internalization capabilities of this system have been evaluated by comparing them with those of a reference system based on MNPs functionalized with PEG, rhodamine, and folic acid, obtained adopting the same NH₂ -PA-based platform. The uptake of the two differently decorated MNPs was assessed in primary microvascular endothelial cells from human brain, which are the main components of the BBB and simulate an in vitro model of the BBB. These surface modifications influence the internalization of MNPs in HBMEC and, therefore, their capability to cross the BBB. In fact, conjugation with the gH625 peptide upgraded the delivery of nanoparticles across the in vitro BBB, leading to significant higher cell uptake in HBMEC after 24 h compared with that of FA bearing MNPs (FA,PEG@MNPs). Note that also other strategies have been used to enhance nanoparticle uptake across the BBB. A common approach is to attach targeting ligands in order to activate receptor-mediated endocytosis. As examples, transferrin-coupling nanoparticles can penetrate into the BBB through a transferrin receptor-mediated process [56]. Analogously, the linkage of the apolipoprotein E to the nanoparticles enhances the BBB penetration [57]. Besides, nanoparticles having a surface charges modified with polyethylenimine (PEI) has been reported to cross the BBB by absorptive-mediated transcytosis [58]. Finally, the ability of MNPs to pass through human brain microvascular endothelial cells, used as an in vitro BBB model, can be also facilitated by an external magnet [59]. In our work, we studied a different approach which use a cell penetrating peptide, the gh625, to improve internalization capabilities of Fe₃ O ₄ nanopartículas. These results are in accordance with those previously obtained by D. Guarnieri et al. using different kinds of MNPs [55, 60] confirming that the gH625-decorated magnetic nanoparticle has a relevant role in crossing the BBB and could be used as a safe and effective drug delivery system.

Abreviações

A-172:: Human glioblastoma cell line
B.E.:: Energia de ligação
BBB:: Blood-brain barrier
CNS:: Central nervous system
CPPs:: Cell-penetrating peptides
DIPEA:: N , N -Diisopropylethylamine
DLS:: Espalhamento de luz dinâmico
DMEM:: Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DAPI:: 4′,6-Diamidino-2-phenylindole
DMSO:: Dimethyl sulfoxide
FA:: Folic acid
FA-NHS:: Activated form of FA with NHS
FBS:: Soro fetal bovino
Fmoc:: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
FT-IR:: Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
gh625:: 20-Residue peptide derived from the glycoprotein H (gH) of the Herpes simplex virus 1
gH625@MNPs:: NH ₂ @MNPs functionalized with gh625
HBMECs:: Microvascular endothelial cells from human brain
MNPs:: Magnetic iron nanoparticles
MTT:: 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H -tetrazolium bromide
NBD:: 4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole
NH₂ @MNPs:: MNPs modified with NH₂ -PA
NH₂ -PA:: 3-Aminopropylphosphonic acid
NHS:: N -Hydroxysuccinimide
PBS:: Phosphate-buffered saline
PDI:: Polydispersity index
PEG:: Polietileno glicol
PEG,FA@MNPs:: NH ₂ @MNPs functionalized with FA, Rhod and PEG
PEG-NHS:: Methoxypolyethylene glycol acetic acid N -succinimidyl ester
PEI:: Polietilenimina
Rhod:: Carboxy-X -rhodamine
Rhod-NHS:: Carboxy-X -rhodamine N -succinimidyl ester
TFA:: Trifluoroacetic acid
XPS:: espectroscopia de fotoelétrons de raios-X
XRD:: Difração de pó de raios-x