Restaurando Luminescência de Pontos Quânticos CdSe/ZnS-Cis Envelhecidos via Desagregação Induzida por TPPS₄

Resumo

Pontos quânticos (PQs) são cada vez mais usados em imagem biomédica e terapia fotodinâmica devido à sua emissão estreita, sintonizável e alta fotostabilidade. No entanto, armazenamento de longo prazo de PQs de CdSe/ZnS revestidos com cisteína em meio aquoso tipicamente leva a agregação, resultando em rendimento quântico (RQ) reduzido e vidas de fluorescência encurtadas. Neste estudo, demonstramos que a adição de meso-tetrakis (p-sulfonato-fenil) porfirina (TPPS₄) a soluções de PQs envelhecidos desencadeia desagregação, restaurando RQ a níveis comparáveis a amostras recém-preparadas. Fluorescência resolvida no tempo revela que a recuperação é impulsionada principalmente pelo re-emergimento do componente de emissão relacionado ao revestimento. Nossos achados fornecem uma estratégia simples, baseada em molécula, para rejuvenescer PQs envelhecidos, com implicações para desempenho sustentado em bioimagem e diagnósticos.

Introdução

Nanocristais semicondutores coloidais, ou pontos quânticos, combinam absorção de banda larga intensa com fotoluminescência estreita, dependente de tamanho, e excepcional estabilidade térmica e fotoestabilidade, tornando-os atraentes para uma gama de aplicações desde imagem médica a combustíveis solares. Funcionalizar superfícies de PQs com ligantes orgânicos aumenta solubilidade em água, reduz citotoxicidade e confere biocompatibilidade, permitindo marcação direcionada de estruturas celulares. As bandas de emissão de alta intensidade e estreitas de PQs também servem como antenas de luz eficientes para fotossensibilizadores (FS) em terapia fotodinâmica (TFD), melhorando captura de energia de luz e eficiência de ativação do FS. Consequentemente, híbridos PQ-FS são foco de pesquisa em diagnósticos de fluorescência (DF) e fotoquimioterapia (FQT).

PQs de CdSe/ZnS revestidos com cisteína (PQ-Cis) são particularmente atraentes devido ao seu pequeno tamanho hidrodinâmico (~3 nm diâmetro do núcleo), alto RQ de fotoluminescência (~0,75) e baixa adsorção inespecífica. A porfirina sintética meso-tetrakis (p-sulfonato-fenil) porfirina (TPPS₄) é um fotossensibilizador solúvel em água, não-tóxico, já testado em ensaios clínicos de terapia fotodinâmica. Trabalhos prévios mostraram que transferência de energia ou carga entre TPPS₄ e PQs tipicamente quencha emissão de PQ, enquanto agregação de PQs através de interações eletrostáticas ou de ligação de hidrogênio também pode auto-quenchar sua fluorescência. Aqui relatamos, pela primeira vez, que TPPS₄ pode realmente aumentar a luminescência de PQs envelhecidos promovendo desagregação.

Experimental

Preparação de Pontos Quânticos (CdSe/ZnS)-Cis

PQs de núcleo-casca CdSe/ZnS (~3,0 mg) foram sintetizados seguindo procedimento adaptado que envolve crescimento de núcleo CdSe por injeção quente seguido por epitaxia de casca ZnS. Para introduzir ligantes de cisteína, os PQs hidrofóbicos foram purificados por lavagem trifásica clorofórmio/metanol, então redispersos em clorofórmio (1,0 mL). Adição gota a gota de DL-cisteína (30 mg mL⁻¹, 200 mL) em metanol, mistura vigorosa e centrifugação (10.000 rpm, 5 min) removeram excesso de solvente. Lavagens subsequentes de metanol (16.000 rpm, 10 min, 3×) eliminaram cisteína não ligada, após o que o precipitado de PQ foi seco sob vácuo e redisperso em água Milli-Q com 1 M NaOH, filtrado através de filtro de seringa 0,02 µm (Anotop 25 Plus, Whatman).

Preparação de Amostras Porfirina + (CdSe/ZnS)-Cis PQs

TPPS₄ (Midcentury Chemicals, EUA) foi usado como recebido. Soluções experimentais foram preparadas em tampão fosfato (pH 7,3, 7,5 mM) usando água Milli-Q. Para PQs envelhecidos (armazenados a 276 K por 3 meses), alíquotas de um estoque de 140 µM TPPS₄ foram adicionadas à solução de PQ sem diluição. Experimentos controle envolveram substituição de volumes equivalentes com tampão. Todas as medições foram realizadas a 297 K.

Concentração de TPPS₄ foi monitorada por absorbância a 515 nm (ε₅₁₅ nm = 1,3 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹). Concentração de PQ envelhecido foi calculada a partir do primeiro pico excitônico a 520 nm usando relação empírica de Yu (ε = 5857 D²·⁶⁵) com D derivado do ajuste polinomial (Eq. 1). Para λ = 520 nm, D = 2,6 nm e ε = 7,4 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹.

Instrumentos

Espectros de absorção foram registrados em espectrofotômetro Beckman Coulter DU640. Fotoluminescência de estado estacionário foi medida em espectrofluorímetro Hitachi F-7000 (λ_ex = 480 nm, λ_em = 558 nm). RQ de PQ envelhecido foi determinado pelo método relativo usando C12-NBD-PC (RQ = 0,34 em etanol) como padrão via Equação (2).

Curvas de decaimento resolvidas no tempo foram obtidas com configuração de contagem de fóton único correlacionada no tempo: laser de safira-titânio Tsunami 3950 (8 MHz, 480 nm segunda harmônica) acoplado a espectrômetro Edinburgh FL900 e fotomultiplicador de placa de microcanal refrigerado Hamamatsu R3809U. Função de resposta do instrumento (≈100 ps LLM) forneceu resolução temporal de 12 ps. Dados de decaimento foram ajustados usando OriginPro9, com bondade avaliada por χ² reduzido e análise de resíduos.

Espalhamento dinâmico de luz (NanoBrook 90Plus) foi realizado a 640 nm excitação, laser HeNe 40 mW, para determinar diâmetros hidrodinâmicos.

Resultados e Discussão

PQs (CdSe/ZnS)-Cis recém-sintetizados exibem pico de emissão agudo a 558 nm (Fig. 1, preto) com RQ de 0,75. Após armazenamento de 3 meses a 276 K, a emissão deslocamento para azul para 556 nm, alarga e torna-se assimétrica, enquanto RQ cai para 0,23 ± 0,03 (Fig. 1, vermelho).

Espectros de luminescência normalizados de PQs (CdSe/ZnS)-Cis 558 em tampão fosfato (7,5 mM, pH 7,3): fresco (preto, λ_max = 558 nm), envelhecido (vermelho, λ_max = 556 nm), e envelhecido mais 5,0 µM TPPS₄ (azul, λ_max = 559 nm). Excitação a 480 nm.

Adição de TPPS₄ a soluções de PQ envelhecidas produz recuperação pronunciada de luminescência, com RQ subindo para 0,75 ± 0,08 (Fig. 2a, inserção). A banda de emissão também torna-se simétrica, com deslocamento para vermelho até 559 nm, correspondendo ao espectro de PQ fresco. Medidas resolvidas no tempo ajustam decaimento tri-exponencial (Eq. 3). O componente mais rápido (≈100 ps) corresponde à luz de excitação espalhada. Os componentes intermediário (τ₂) e longo (τ₃), associados a recombinação de núcleo e casca, são significativamente mais curtos em PQs envelhecidos mas recuperam-se com adição de TPPS₄ (Tabela 1). A contribuição relativa do componente da casca (I₃, Eq. 4) aumenta com concentração de TPPS₄ e paralela a tendência de RQ, indicando que emissão relacionada à casca é primariamente restaurada.

a Espectros de luminescência e RQ de PQs (CdSe/ZnS)-Cis 558 envelhecidos (570 nM) em função da concentração de TPPS₄. b Cinética de decaimento e razão I₃ versus concentração de TPPS₄.

A melhoria observada não pode ser atribuída a transferência reversa de energia de TPPS₄ (cuja fluorescência está além de 600 nm) ou transferência ressonante de energia de Förster (FRET) porque TPPS₄ absorve negligivelmente no comprimento de onda de excitação e seu espectro de absorção permanece inalterado em misturas. Em vez disso, os dados suportam mecanismo de desagregação: PQs envelhecidos agregam durante armazenamento, reduzindo RQ; ligação de TPPS₄ aumenta carga superficial negativa líquida, amplificando repulsão eletrostática e separando partículas (Esquema 1). A interação é mediada pelo núcleo porfirina π-conjugado, que liga superfícies metálicas com alta afinidade, superando repulsão eletrostática entre grupos sulfonato e superfície de PQ carregada negativamente.

Esquema 1: Adsorção de TPPS₄ em PQs (CdSe/ZnS)-Cis 558 envelhecidos aumenta carga superficial negativa, promovendo desagregação via repulsão eletrostática aprimorada.

Estimando área superficial de PQ de 2,6 nm (≈145 nm²) mostra que ~80 moléculas de TPPS₄ seriam necessárias para cobrir toda a superfície. No entanto, saturação de RQ e I₃ ocorre a apenas ~2 µM TPPS₄ (≈4 moléculas por PQ), implicando que poucas porfirinas ligadas bastam para desencadear repulsão significativa. Densidades de carga calculadas (σ) confirmam isso: PQ sozinho tem σ_PQ = −0,25 mV/nm², enquanto PQ ligado a quatro moléculas de TPPS₄ tem σ_PQ+TPPS₄ = −1,29 mV/nm², mais de cinco vezes maior, resultando em repulsão >25 vezes mais forte.

Consistente com hipótese de agregação, diluir soluções de PQ envelhecidos também aumenta RQ e I₃ (Fig. 4). Espalhamento dinâmico de luz mostra diâmetros hidrodinâmicos de 330 ± 170 nm para PQs envelhecidos, que encolhem para 25 ± 6 nm com diluição, evidenciando diretamente desagregação.

a Espectros de luminescência e RQ de PQs (CdSe/ZnS)-Cis 558 envelhecidos em concentrações variadas. b Cinética de decaimento e I₃ versus concentração.

Trabalhos futuros explorarão se TPPS₄ pode preemptivamente estabilizar PQs recém-preparados durante armazenamento a baixa temperatura, potencialmente estendendo vida útil para aplicações biomédicas.

Conclusões

Armazenamento de longo prazo de PQs CdSe/ZnS-Cis em meio aquoso induz agregação que diminui tanto rendimento quântico quanto vidas de fluorescência. Introdução de TPPS₄ desagrega PQs envelhecidos aumentando carga superficial negativa, restaurando RQ e emissão relacionada à casca a níveis de amostra fresca. Este efeito de desagregação também é observado na simples diluição, ressaltando o papel da eletrostática inter-partícula. Nossos resultados fornecem estratégia prática para rejuvenescer PQs envelhecidos, aumentando sua adequação para bioimagem sustentada e diagnósticos de fluorescência, enquanto também oferece meio para reduzir tamanho de partícula para captação celular melhorada.

Abreviações

C12-NBD-PC:

1-Palmitoil,2-(12-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino]dodecanoil)-sn-glicero-3-fosfocolina

DF:

Diagnósticos de fluorescência

FP:

Sondas fluorescentes

FWHM:

Largura total na metade do máximo

FQT:

Fotoquimioterapia

TFD:

Terapia fotodinâmica

FS:

Fotossensibilizadores

PQ:

Pontos quânticos

PQ-Cis:

PQ revestido com cisteína

RQ:

Rendimento quântico

TOPO:

Óxido de trioctilfosfina

TPPS₄:

meso-tetrakis (p-sulfonato-fenil) porfirina