Estimulação de cisteína revestida com CdSe / ZnS Quantum Dot Luminescência por meso-Tetrakis (p-sulfonato-fenil) Porfirina

Resumo

A interação entre porfirinas e pontos quânticos (QD) via energia e / ou transferência de carga é geralmente acompanhada pela redução da intensidade de luminescência e do tempo de vida do QD. No entanto, para soluções de água CdSe / ZnS-Cys QD, mantidas a 276 K durante 3 meses (QD envelhecido), o aumento significativo na intensidade de luminescência com a adição de meso -tetraquis (p-sulfonato-fenil) porfirina (TPPS ₄ ) foi observada neste estudo. A agregação de QD durante o armazenamento provoca redução no rendimento quântico e tempo de vida de sua luminescência. Usando técnicas de fluorescência em estado estacionário e resolvido no tempo, demonstramos que TPPS ₄ estimulou a desagregação de CdSe / ZnS-Cys QD envelhecido em soluções aquosas, aumentando o rendimento quântico de sua luminescência, que finalmente atingiu o do QD recém-preparado. A desagregação ocorre devido ao aumento da repulsão eletrostática entre QD em sua ligação com moléculas de porfirina carregadas negativamente. A ligação de apenas quatro moléculas de porfirina por QD único foi suficiente para a desagregação QD total. A análise das curvas de decaimento da luminescência QD demonstrou que a desagregação mais forte afetou a luminescência relacionada com a aniquilação elétron-buraco na camada QD. Os resultados obtidos demonstram a forma de reparar o QD envelhecido pela adição de algumas moléculas ou íons às soluções, estimulando a desagregação do QD e restaurando suas características de luminescência, o que pode ser importante para aplicações biomédicas de QD, como bioimagem e diagnóstico de fluorescência. Por outro lado, a desagregação é importante para aplicações QD em biologia e medicina, pois reduz o tamanho das partículas facilitando sua internalização em células vivas através da membrana celular.

Histórico

Nanocristais semicondutores coloidais ou pontos quânticos (QD) devido às suas características específicas, ampla absorção intensa e espectros de luminescência estreitos com posição máxima dependente do tamanho e alta estabilidade térmica e fotoestabilidade [1, 2], encontram aplicações em vários campos da tecnologia moderna, como como imagens e diagnósticos médicos, nanodispositivos de computação modernos, sondas fluorescentes para aplicações bioanalíticas, geração fotoeletroquímica de hidrogênio, etc. ([3,4,5,6,7] e referências nele). A funcionalização da superfície QD com moléculas orgânicas possibilita aumentar sua solubilidade em água, reduzir sua toxicidade e aumentar sua biocompatibilidade, preparando QD com afinidade seletiva para estruturas desejáveis de organismos vivos [8]. Portanto, QD atrai interesse especial para aplicações em biologia [5] e medicina [6], onde poderiam ser aplicadas com sucesso como sondas fluorescentes (FP) para diagnósticos de fluorescência (FD) [9] e fotossensibilizadores (PS) para fotoquimioterapia (PCT) [10]. A absorção intensa em uma ampla região espectral faz do QD uma antena eficaz para o acúmulo de energia luminosa, e a banda de luminescência estreita e intensa facilita a transferência de energia para o PS correspondente, aumentando assim a eficiência de utilização da energia luminosa e conseqüentemente aumentando a eficácia do PS [7, 11] . Isso torna os pares (QD + PS) promissores para aplicação em DF e PCT e estimula estudos na interação QD e FS, principalmente na transferência de energia e carga entre eles.

Entre outros, revestido com cisteína (CdSe / ZnS) QD ((CdSe / ZnS) -Cys QD) e meso -tetraquis (p-sulfonato-fenil) porfirina (TPPS ₄ ) atraem um interesse especial pelos seguintes motivos:um tamanho pequeno de QD revestido de cisteína (QD-Cys) que aumenta sua mobilidade e a probabilidade de penetrar na membrana celular, sua alta estabilidade química, baixa adsorção não específica e alto rendimento quântico de luminescência [ 12, 13]. Por outro lado, TPPS sintético ₄ a porfirina é um PS promissor, uma vez que é fotoativo, solúvel em água e não tóxico e já foi testado em clínicas em aplicação em terapia fotodinâmica (TFD) demonstrando características promissoras [14, 15].

Interação entre TPPS ₄ e QD via energia e / ou transferência de carga já foi documentado [16]. Normalmente, esses processos são acompanhados por redução na intensidade de luminescência QD e tempo de vida. Mais um processo que causa a auto-extinção da luminescência no QD é a auto-agregação via interações eletrostáticas ou formação de ligações de hidrogênio, em muitos casos, tornando o processo de agregação reversível [17].

Neste trabalho, relatamos pela primeira vez a estimulação da luminescência QD via interação com porfirina no exemplo de (CdSe / ZnS) -Cys QD e TPPS ₄ porfirina.

Experimental

Preparação de (CdSe / ZnS) -Cys Quantum Dots

O (CdSe / ZnS) -Cys QD foi sintetizado de acordo com o método adaptado de [18]. O método inclui o seguinte:(1) síntese de nanocristais de núcleo de CdSe coloidal hidrofóbico e (2) crescimento de uma camada de ZnS epitaxial em torno do núcleo de CdSe. Para funcionalizar o QD com cisteína, o QD núcleo-casca de CdSe / ZnS resultante (~ 3,0 mg) foi purificado a partir de TOPO via dispersão tripla em clorofórmio (500 mL) e precipitação com metanol (800 mL). Os QD purificados foram redispersos em clorofórmio (1,0 mL). DL-cisteína em metanol (30 mg mL ^{- 1} , 200 mL) gota a gota à dispersão QD e misturada vigorosamente seguida por centrifugação (10.000 rpm, 5 min), removendo o clorofórmio. Após lavagem com metanol para remover o excesso de DL-Cisteína por centrifugação (16.000 rpm, 10 min, 3 vezes), o precipitado QD foi seco sob vácuo e redisperso em água Milli-Q com NaOH 1 M (20 mL) gota a gota adicionado e filtrado com filtro de seringa Anotop 25 Plus (0,02 μm, Whatman).

Preparação de porfirina + (CdSe / ZnS) -Cys QD Samples

O TPPS ₄ a porfirina foi obtida da Midcentury Chemicals (EUA) e usada sem purificação adicional. As soluções experimentais foram preparadas em tampão fosfato (pH 7,3; 7,5 mM), utilizando água de qualidade Milli-Q. Para medições de luminescência em (CdSe / ZnS) -Cys QD mantido a 276 K por 3 meses (QD envelhecido), alíquotas de um TPPS concentrado ₄ solução de estoque ([TPPS ₄ ] _estoque =140 μM) foram adicionados à solução inicial (CdSe / ZnS) -Cys QD, evitando efeitos de diluição. Para o experimento de diluição QD envelhecido, alíquotas da solução inicial foram substituídas pela mesma quantidade de tampão fosfato. Todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente (297 K).

A concentração de TPPS ₄ foi controlado espectrofotometricamente usando ε _515nm =1,3 × 10 ⁴ M ^{- 1} cm ^{- 1} [19]. A concentração do ponto quântico envelhecido (CdSe / ZnS) -Cys foi calculada usando o primeiro pico de absorção excitônica a 520 nm usando ε =5857 ( D ) ^2,65 de acordo com o cálculo empírico de Yu [20], onde D (nm) é o diâmetro de um determinado nanocristal. O D o valor foi determinado a partir da função de ajuste empírico da curva apresentada em [20]. Para nanocristais de CdSe, esta função é:
$$ D =\ left (1,6122 \ times {10} ^ {- 9} \ right) {\ lambda} ^ 4- \ left (2,6575 \ times {10} ^ {- 6} \ right) {\ lambda} ^ 3+ \ left (1,6242 \ times {10} ^ {- 3} \ right) {\ lambda} ^ 2- (0,4277) \ lambda + (41,57) $$ (1)
Em nosso caso, λ =520 nm, D =2,6 nm, e ε =7,4 × 10 ⁴ M ^{- 1} cm ^{- 1} .

Instrumentos

Os espectros de absorção foram monitorados com um espectrofotômetro Beckman Coulter DU640. As medições de luminescência em estado estacionário foram feitas em um espectrofluorímetro Hitachi F-7000 em λ _ex =480 nm e λ _em =558 nm. O rendimento quântico de luminescência QD envelhecido (QY) foi determinado através do método relativo [21] com uma medição de ponto único, λ _ex =480 nm e λ _em =558 nm, usando 1-palmitoil, 2- (12- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) amino] dodecanoil) -sn-glicero-3-fosfocolina (C12 -NBD-PC) como um padrão (QY =0,34 em etanol) [22, 23] de acordo com a equação:
$$ {\ Phi} _ {fl} ={\ Phi} _ {fl0} \ frac {n ^ 2 {I} _ {fl}} {n_0 ^ 2 {I} _ {fl0}} \ frac {A_0} {A} $$ (2)
onde eu _fl e eu _fl0 são as intensidades integrais de fluorescência de QD e C12-NBD-PC, A e A ₀ são suas absorvâncias em λ _ex =480 nm e n e n ₀ são índices de refração dos solventes usados, respectivamente.

Os experimentos resolvidos no tempo foram realizados usando um aparelho baseado no método de contagem de fóton único correlacionado no tempo. A fonte de excitação foi um laser de safira de titânio Tsunami 3950 Spectra Physics, bombeado por um laser de estado sólido Millenia X Spectra Physics. A frequência de repetição do pulso do laser foi de 8,0 MHz usando o seletor de pulso 3980 Spectra Physics. O laser foi sintonizado de forma que o cristal BBO gerador de segundo harmônico (GWN-23PL Spectra Physics) desse os pulsos de excitação de 480 nm que foram direcionados a um espectrômetro Edinburgh FL900. O espectrômetro estava na configuração de formato L, o comprimento de onda de emissão foi selecionado por um monocromador e os fótons emitidos foram detectados por um fotomultiplicador de placa de microcanais Hamamatsu R3809U refrigerado. A largura total na metade do máximo (FWHM) da função de resposta do instrumento foi normalmente de 100 ps, e a resolução de tempo foi de 12 ps por canal. O software fornecido pela Edinburgh Instruments e o software comercial “OriginPro9” foram usados para ajustar as curvas experimentais de decaimento de luminescência.

A qualidade do ajuste foi avaliada pela análise do parâmetro estatístico reduzido- χ ² e pela inspeção da distribuição dos resíduos.

A dispersão de luz dinâmica foi medida com o analisador de tamanho de partícula NanoBrook 90Plus Zeta com excitação a 640 nm usando um laser HeNe de 40 mW (Brookhaven Instruments Corporation).

Resultados e discussão

Preparado de fresco (CdSe / ZnS) -Cys QD possui o máximo do espectro de luminescência a 558 nm (Fig. 1, linha preta), conforme relatado anteriormente por Liu et al. [13] e rendimento quântico (QY) 0,75 [2, 24, 25]. A adição de TPPS ₄ para a solução fresca não induz alterações, tanto na intensidade de luminescência QD e no perfil do espectro de luminescência.

Para (CdSe / ZnS) -Cys QD dissolvido em água e mantido na geladeira a 276 K por 3 meses (QD envelhecido), a posição do máximo do espectro de luminescência, medido em tampão de fosfato (7,5 mM) em pH 7,3, foi deslocado para o azul por 2 nm ( λ _máximo =556 nm), em comparação com o de QD fresco. A banda de emissão apareceu alargada e ligeiramente assimétrica (Fig. 1, linha vermelha). O rendimento quântico da luminescência QD envelhecida, determinado pelo método descrito acima, foi de 0,23 ± 0,03.

A adição de TPPS ₄ para a solução QD envelhecida induziu aumento significativo na intensidade de luminescência (Fig. 2a), valor QY atingindo 0,75 ± 0,08 (Fig. 2a, inserção), o valor próximo ao de QD fresco [2, 24, 25].

Além disso, na presença de TPPS ₄ , foi observada a simetrização da banda de luminescência do QD envelhecido e a redução da sua largura de banda, acompanhada de desvio máximo para o vermelho até λ _máximo =559 nm, perto do máximo do espectro QD fresco (Fig. 1, linha azul.).

As curvas de decaimento de luminescência obtidas na excitação de 480 nm para soluções de QD fresco e envelhecido foram ajustadas sucessivamente como uma soma de três exponenciais:
$$ I ={I} _ {0_1} {e} ^ {- t / {\ tau} _1} + {I} _ {0_2} {e} ^ {- t / {\ tau} _2} + {I } _ {0_3} {e} ^ {- t / {\ tau} _3} $$ (3)
onde \ ({I} _ {0_i} \) e τ _i são fator pré-exponencial (amplitude) e tempo de vida do i -ésimo componente de decaimento, respectivamente.

Os tempos de vida dos componentes para QD fresco e envelhecido são independentes da presença de porfirina (Tabela 1). Os tempos de vida de luminescência de soluções QD frescas são típicos para (CdSe / ZnS) -Cys QD [26, 27]. Para QD envelhecido, os tempos de vida dos componentes são muito mais curtos (Tabela 1).

Os valores de τ ₁ em todos os casos, QD fresco e envelhecido na presença e ausência de porfirina, estão perto da resolução de tempo do equipamento de contagem de fóton único (≈ 100 ps) usado neste estudo. Portanto, deve ser associado à luz espalhada do pulso de excitação.

É bem estabelecido [28,29,30] que os de curta duração ( τ ₂ ) e de longa duração ( τ ₃ ) componentes estão associados com a luminescência resultante da aniquilação elétron-buraco no núcleo QD ( τ ₂ ) e shell ( τ ₃ ), respectivamente. A intensidade total desses dois componentes caracteriza todo o processo de aniquilação no QD. Neste caso, a intensidade relativa (amplitude) do τ ₃ componente deve demonstrar a contribuição da aniquilação elétron-buraco na camada QD. A contribuição relativa eu ₃ do 3º componente da curva de decaimento foi calculado como:
$$ {I} _3 =\ frac {I_ {0_3}} {I_ {0_2} + {I} _ {0_3}} $$ (4)
A adição de TPPS ₄ para soluções QD frescas não muda significativamente o conteúdo relativo dos componentes (dados não mostrados), enquanto para soluções QD antigas, o conteúdo relativo de τ ₃ componente I ₃ aumenta com o TPPS ₄ concentração (Fig. 2b, inserção). A dependência de QY para luminescência de ponto quântico envelhecido no TPPS ₄ a concentração é semelhante à de I ₃ (Fig. 2a, b, inserções), ambas atingindo os valores máximos de aproximadamente 2,0 μM TPPS ₄ . Isso significa que TPPS ₄ interagir com o QD envelhecido afeta mais a luminescência do invólucro do QD do que a de seu núcleo. No entanto, TPPS ₄ em soluções QD frescas não demonstra nenhum efeito sobre a luminescência QD. Portanto, concluímos que o TPPS ₄ O efeito observado para a solução QD envelhecida não pode ser explicado pela ligação da porfirina à superfície QD.

Por outro lado, o aumento observado da intensidade de luminescência do QD envelhecido na interação com TPPS ₄ não pode ser explicado via transferência reversa de energia do TPPS ₄ para QD, desde o TPPS ₄ espectro de fluorescência está localizado no intervalo λ > 600 nm onde a absorção QD é fraca (arquivo adicional 1:Figura S3). Portanto, a transferência de energia através do mecanismo de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) é baixa probabilidade. Além disso, a luminescência QD foi excitada em 460 ou 480 nm, onde TPPS ₄ a absorção óptica é insignificante. Além disso, o espectro de absorção de TPPS ₄ permaneceu inalterado nas soluções misturadas, demonstrando a ausência de transferência de carga entre QD e TPPS ₄ (Arquivo adicional 1:Figura S4b, c).

A habilidade dos pontos quânticos de se agregar através da formação de ligações de hidrogênio NH ··· H não covalentes entre os grupos de superfície QD já foi documentada [13, 17]. A agregação reduz a luminescência QD, extinguindo de forma mais eficaz o componente atribuído ao invólucro QD [13, 17]. A redução da intensidade de luminescência QD e do tempo de vida foi observada para CdSe-QD em filmes sólidos devido à formação de agregados 3D [31]. Os autores propuseram um modelo, onde esta redução está associada à transferência de energia entre os indivíduos QD no agregado [32].

Com base nessas evidências, acreditamos que enquanto na geladeira, o QD se agrega, o que reduz a intensidade da luminescência e o tempo de vida. Portanto, associamos o aumento observado na intensidade de luminescência QD e tempos de vida na presença de TPPS ₄ com desagregação QD, estimulada por TPPS ₄ em sua ligação com o agregado. O efeito semelhante foi observado para a emissão de QD agregado em sua interação com íons de flúor [17].

As alterações observadas no perfil da banda de luminescência para o QD envelhecido (Fig. 1) podem ser explicadas também pela agregação do QD, sendo sua assimetria associada à existência de diferentes tipos de agregados. Interação com TPPS ₄ reduz a agregação e torna o perfil da banda de luminescência semelhante ao do QD não agregado, observado em soluções frescas.

Em pH neutro, a superfície QD-Cys possui carga líquida negativa devido à desprotonação de grupos amino terminais em sua superfície [17, 33, 34]. Neste pH, TPPS ₄ tem carga líquida (4-) devido a quatro grupos fenil sulfonato carregados negativamente em sua estrutura ([35, 36] e referências nele). Portanto, a interação entre os grupos de cisteína QD e TPPS ₄ moléculas são baixas, provavelmente devido à repulsão eletrostática. No entanto, a alta afinidade do sistema conjugado com porfirina π para superfícies de metal está bem documentada [37]. Esta afinidade deve ser responsável por TPPS ₄ ligação na superfície dos pontos quânticos, apesar da repulsão eletrostática entre os grupos laterais QD e porfirina. A interação entre a superfície QD e o sistema conjugado π da porfirina ligada poderia explicar o alargamento fraco do espectro de fluorescência da porfirina (Figs. 1, 3 e Arquivo adicional 1:Figura S3a, inserção) e mudanças observadas no espectro de excitação de fluorescência (Adicional arquivo 1:Figura S5b, inserção) [38].

A ligação de algumas moléculas de porfirina na superfície QD aumenta a carga negativa da superfície QD, aumentando assim a repulsão eletrostática entre as partículas e induzindo sua desagregação (Esquema 1) [39].

A área de superfície QD A _QD ≈ 145 nm ² é suficiente para adsorver vários TPPS ₄ moléculas ( A _TPPS4 ≈ 1,8 nm ² por unidade) [40], como foi observado para porfirinas interagindo com nanopartículas magnéticas e de ouro [41, 42].

Para cobrir toda a área de QD por porfirinas, são necessárias 80 moléculas de porfirina por QD individual. No entanto, a saturação da luminescência QY e I ₃ valores na solução QD de 570 nM foram observados em aproximadamente [TPPS ₄ ] =2,0 μM (Fig. 2), o que demonstra que a ligação de quatro moléculas de porfirina por QD é suficiente para a desagregação QD. Isso pode ser explicado pela maior densidade de carga na molécula de porfirina em comparação com a de QD (arquivo adicional 1:Figura S6), que produz repulsão eletrostática mais forte entre QD com porfirinas ligadas. De fato, potencial Zeta para o idoso QD (ζ _QD ) é - 36,1 mV e para TPPS ₄ molécula (ζ _TPPS4 ) é - 37,6 mV. Densidade de carga média, calculada como σ =ζ / A _QD , para um indivíduo com idade QD é

σ _QD =- 36,1 mV / 145 nm ² =- 0,25 mV / nm ² .

Ao mesmo tempo, para um indivíduo com idade QD vinculado a quatro TPPS ₄ moléculas, a densidade de carga média (σ _{QD + TPPS4} ) é

σ _{QD + TPPS4} =- (36,1 + 37,6 × 4) mV / 145 nm ² =- 1,29 mV / nm ² .

Assim, a ligação de quatro TPPS ₄ moléculas com um QD envelhecido individual aumenta seu σ mais de 5 vezes, aumentando a força de repulsão eletrostática mais de 25 vezes e induzindo a desagregação do QD envelhecido.

De acordo com a hipótese de agregação QD, um efeito semelhante ao induzido por TPPS ₄ a adição deve ser observada na diluição de soluções QD envelhecidas. Realmente, observamos o aumento no QY da luminescência QD na diluição de sua solução tampão (Fig. 4a, inserção), o que demonstra que a auto-extinção da luminescência QD em soluções QD-Cys envelhecidas depende da concentração de QD [17] . Simultaneamente, o eu ₃ o valor na cinética de luminescência QD também aumenta com a diluição (Fig. 4b, detalhe).

Além disso, os experimentos de espalhamento dinâmico de luz mostram que D _hd de partículas de dispersão nas soluções QD após o envelhecimento foi (330 ± 170) nm, que é muito maior do que o de QD fresco. A diluição reduz D _hd até (25 ± 6) nm, demonstrando assim diretamente a desagregação QD (Arquivo adicional 1:Tabela S1).

Existe mais um aspecto interessante do problema:adição de lata de TPPS ₄ à solução de QD fresco evita sua agregação durante o armazenamento em baixa temperatura, estabilizando assim suas características de luminescência? No entanto, o esclarecimento deste problema precisa de um estudo independente e detalhado usando vários métodos experimentais e condições experimentais variáveis, como concentrações de reagentes, temperatura, duração do armazenamento da solução (vários meses), etc. Pretendemos realizar este estudo profundo o mais próximo futuro.

Conclusões

Com base nos dados obtidos, podemos afirmar que o longo armazenamento de CdSe / ZnS-Cys QD em soluções aquosas mesmo em baixas temperaturas induz sua agregação, o que reduz o rendimento quântico e o tempo de vida da luminescência. A adição de TPPS ₄ a porfirina estimula a desagregação de CdSe / ZnS-Cys QD envelhecida, que é pronunciada por meio do aumento do rendimento quântico da luminescência QD e da contribuição da aniquilação elétron-buraco na camada QD na luminescência QD total. A desagregação, estimulada pela porfirina, ocorre devido ao aumento da repulsão eletrostática entre o QD agregado em sua ligação com moléculas de porfirina carregadas negativamente. A desagregação também foi observada na diluição da solução QD.

Os resultados obtidos demonstram a forma de reparar o QD envelhecido adicionando algumas moléculas ou íons às soluções, estimulando a desagregação do QD e restaurando suas características de luminescência, o que pode ser importante para aplicações biomédicas de QD, como bioimagem e diagnóstico de fluorescência. Por outro lado, a desagregação é importante para aplicações QD em biologia e medicina, uma vez que reduz o tamanho das partículas, facilitando sua internalização em células vivas através da membrana celular.

Abreviações

C12-NBD-PC:: 1-Palmitoil, 2- (12- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) amino] dodecanoil) -sn-glicero-3-fosfocolina
FD:: Diagnóstico de fluorescência
FP:: Sondas fluorescentes
FWHM:: Largura total pela metade no máximo
PCT:: Fotoquimioterapia
PDT:: Terapia fotodinâmica
PS:: Fotossensibilizadores
QD:: Pontos quânticos
QD-Cys:: QD revestido de cisteína
QY:: Rendimentos quânticos
TOPO:: Óxido de trioctilfosfina
TPPS ₄ ₄ :: meso -tetraquis (p-sulfonato-fenil) porfirina

Crescimento direto de diodo emissor de luz amarela à base de nitreto III-nanowire em quartzo amorfo usando camada intermediária de Ti fino Superfície insensível à polarização Modulador de eletro-absorção de polarização de plasma baseado em óxido de estanho de índio quase zero de épsilon

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

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