Síntese Livre de Fosfina de Pontos Quânticos Núcleo-Casca ZnSe/CdS/ZnS com Supressão de Reabsorção e Aplicação em Detecção Sensível de CRP

Resumo

Descrevemos um protocolo livre de fosfina, em panela única, para criar pontos quânticos (QDs) núcleo-casca ZnSe/CdS/ZnS que combinam alinhamentos de banda tipo-II e tipo-I para suprimir reabsorção. Os QDs resultantes de emissão vermelha alcançam um impressionante rendimento quântico de fotoluminescência (QY) de 82% e excepcional estabilidade óptica. Comparados com QDs tipo-I convencionais, os QDs compostos exibem um deslocamento de Stokes marcadamente maior e reabsorção reduzida, o que se traduz em maior saída de fluorescência. Aproveitando estas propriedades, empregamos os QDs como marcadores fluorescentes em um ensaio imunoenzimático ligado a fluorescência (FLISA) para proteína C-reativa (CRP). O ensaio alcançou um limite de detecção (LOD) de 0,85 ng mL⁻¹ — 15% mais sensível que um FLISA baseado em CdSe/ZnS (1,00 ng mL⁻¹). Estas descobertas demonstram que QDs ZnSe/CdS/ZnS tipo-II/tipo-I são fortes candidatos para diagnóstico biomédico e aplicações fotônicas.

Fundamentação

Pontos quânticos núcleo/casca de semicondutor possuem traços ópticos superiores — amplas faixas de emissão, altos rendimentos quânticos (QYs) e robusta estabilidade química — tornando-os marcadores fluorescentes ideais para diagnóstico, imageamento e optoeletrônica [1-7]. Sua estrutura eletrônica enquadra-se em três categorias baseadas em alinhamento de banda: tipo-I, tipo-I reverso e tipo-II. QDs tipo-I confinam tanto elétrons quanto lacunas no núcleo, aumentando recombinação radiativa e isolando o núcleo ativo de defeitos de superfície [6-9]. No entanto, o pequeno deslocamento de Stokes (≈10 nm) comum a QDs tipo-I causa reabsorção significativa, diminuindo intensidade de emissão e limitando ensaios quantitativos [10,11]. QDs tipo-II separam elétrons e lacunas através do núcleo e casca, produzindo emissão deslocada para o vermelho e pico de absorção do primeiro exciton achatado. Isso reduz sobreposição espectral, suprime reabsorção e melhora detecção quantitativa [12-13]. QDs ZnSe/CdS tipo-II abrangem emissão do azul-violeta ao vermelho com reabsorção suprimida [13], mas suas cascas ricas em Cd podem sofrer de quenching induzido por armadilhas de superfície e biotoxicidade. Revestimento com casca externa de ZnS tanto passiva a superfície, aumenta QY e limita lixiviação de Cd [14-15]. Sínteses prévias de QDs ZnSe/CdS/ZnS requeriram fosfinas tóxicas e purificação em múltiplas etapas, sem aplicações biológicas relatadas.

Aqui introduzimos uma rota livre de fosfina, em uma panela, para produzir QDs ZnSe/CdS/ZnS vermelhos de alta qualidade que suprimem reabsorção. O método emprega um precursor de Se de baixa toxicidade (ODE-Se) e oleato de zinco para formar núcleos ZnSe, seguido por crescimento in-situ de cascas CdS e ZnS sem purificação intermediária — facilitando produção escalável. Os QDs atingem 82% de QY com teor reduzido de Cd, e seu grande deslocamento de Stokes mais perfil de absorção achatado produzem baixa reabsorção. Finalmente, demonstramos seu primeiro uso como sondas fluorescentes em FLISA para CRP, alcançando LOD de 0,85 ng mL⁻¹ — superando ensaio de referência CdSe/ZnS.

Métodos

Químicos

Todos os reagentes foram usados como recebidos: CdO (99,99%), ZnO (99,9%), Se (99,9%), 1-octadeeno (ODE, 90%), 1-octanotiol (OT, 98%), ácido oleico (OA, 90%), PMAO, MES e solventes de laboratório padrão (óleo de parafina, acetona, hexanos, metanol). Constituintes de tampão (NaOH, HCl, Na₂CO₃, NaHCO₃, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, H₃BO₃, Na₂B₄O₇·10H₂O, Tween-20) foram obtidos da Shanghai Sangon Co., Ltd. BSA e soro de bezerro foram da Sigma. EDC, sulfo-NHS e microplacas foram da Thermo Fisher Scientific. Anticorpo monoclonal anti-CRP de camundongo e antígeno CRP foram obtidos da Abcam. Todos os químicos foram usados sem purificação adicional.

Precursor de Se (0,1 M)

Se (6 mmol) foi dissolvido em 60 mL ODE e aquecido a 220 °C por 180 min sob nitrogênio, produzindo solução amarela clara.

Precursores de Zn e Cd

ZnO (30 mmol) foi combinado com 30 mL OA e 45 mL ODE, então aquecido a 310 °C sob nitrogênio para formar solução clara; a mistura resfriou a 140 °C para injeção. O precursor de Cd foi preparado identicamente, mas a 240 °C e concentração 0,2 M.

Síntese de QDs ZnSe/CdS/ZnS Tipo-II/Tipo-I

Uma execução típica começou aquecendo 4 mL de precursor de Se e 15 mL ODE a 310 °C. Nesta temperatura, 2 mL de precursor de Zn foi injetado rapidamente. Aliquotas foram coletadas em intervalos para monitorar deslocamentos de PL ligados ao crescimento de partícula. Uma vez que o núcleo atingiu o tamanho desejado, a temperatura foi baixada a 230 °C para crescimento de casca CdS. Precursor de Cd e OT (OT : cátion = 1 : 1,2) foram então adicionados gota a gota a 3 mL h⁻¹ enquanto elevava a temperatura a 310 °C. A casca ZnS foi crescida pelo mesmo método. QDs foram purificados por precipitação com acetona e redispersos em clorofórmio.

QDs CdSe/ZnS Tipo-I

Estes QDs foram sintetizados seguindo protocolos estabelecidos [7] e subsequentemente usados para transferência de fase e preparação de FLISA idêntica ao procedimento ZnSe/CdS/ZnS.

Transferência de Fase para Água

Oligômero anfifílico polimaleico anidrido-octadeeno (PMAO) foi usado para tornar os QDs hidrofóbicos solúveis em água. QDs e PMAO foram dissolvidos em clorofórmio (QD/PMAO = 1 : 7) com sonicação, então clorofórmio foi evaporado a 45 °C. Volume igual de NaHCO₃ 0,1 M (pH 8,5) foi adicionado para dissolver o complexo. Os QDs-PMAO resultantes mantiveram fluorescência total e exibiram excelente estabilidade aquosa em ampla faixa de pH.

Conjugação QDs-Anticorpo

QDs-PMAO foram ativados com EDC/sulfo-NHS para ligar grupos carboxilo a anticorpos monoclonais de CRP. Após incubação em PBS e bloqueio com BSA, os conjugados foram lavados por centrifugação e armazenados em 50 μL tampão BS (5 mM, pH 8,0).

Preparação de Microplaca Revestida com Anticorpo

Poços de microplaca foram revestidos com 1,8 mg mL⁻¹ anticorpo monoclonal CRP em tampão carbonato-bicarbonato 50 mM (pH 9,6), incubados a 4 °C por 24 h, lavados três vezes com 0,05% Tween-20 em PBS 10 mM, e bloqueados com 0,5% BSA em PBS (pH 7,4) durante a noite. Placas foram secas e armazenadas a 4 °C.

Quantificação de CRP por FLISA

Em cada poço, 100 μL de CRP padrão ou amostra (diluída em tampão) foi adicionado à placa revestida com anticorpo, incubado a 37 °C por 30 min, e lavado cinco vezes. Em seguida, 100 μL de sonda QDs-mAb (diluída em 10% soro de bezerro/PBS) foi adicionado, incubado, e lavado como antes.

Caracterização

Espectros de absorção UV-vis e PL foram registrados com espectrofotômetro Ocean Optics PC2000-ISA. QYs foram medidos relativamente a Rodamina 101 (QY = 100%) em etanol. Imagem MET empregou JEOL JEM-2010 a 200 kV. Análise de fase usou XRD D8-ADVANCE com radiação Cu-Kα (λ = 1,54 Å). Diâmetros hidrodinâmicos foram determinados por espalhamento dinâmico de luz (Nano-ZS 90, Malvern).

Resultados e Discussão

A evolução dos espectros UV-vis e PL durante crescimento de casca é ilustrada na Figura 1. O núcleo ZnSe nu mostra absorção a 420 nm e emissão a 428 nm (FWHM = 17 nm). Adicionar uma única monocamada de CdS expande o deslocamento de Stokes para 54 nm, com absorção a 497 nm e emissão a 551 nm (FWHM = 38 nm). Crescimento subsequente de casca CdS desloca ainda mais o PL para 629 nm e alarga FWHM para 52 nm, refletindo acoplamento exciton-fonon aumentado. O pico de absorção do primeiro exciton achatado e forte absorção de curto comprimento de onda (<500 nm) juntos reduzem sobreposição espectral, efetivamente suprimindo reabsorção. A casca ZnS subsequentemente desloca a emissão para a esquerda e estreita FWHM para 43 nm, enquanto o QY sobe de 20% para 82% através da sequência de crescimento CdS/ZnS.

Figura 2 confirma a evolução estrutural: picos XRD afiam e deslocam para posições de CdS e ZnS wurtzita, indicando crescimento bem-sucedido de multi-casca e transição zinco-blenda para wurtzita. Imagens MET (Fig. 2a-f) revelam QDs esféricos monodispersos expandindo de 3,90 nm (núcleo) a 11,92 nm (núcleo/casca completo). Espaçamentos de rede METAR (0,32 nm para ZnSe, 0,35 nm para CdS, 0,31 nm para ZnS) correspondem aos dados de XRD, confirmando fidelidade composicional.

Análise EDS (Tabela S1) mostra razões Cd/(Zn+Cd) aumentam durante crescimento de casca CdS devido a troca de cátions a >200 °C, mas teor geral de Cd permanece baixo (~13%) comparado a QDs tipo-I típicos CdSe/CdS/ZnS (~40%). Esta carga reduzida de Cd diminui biotoxicidade.

Transferência de fase para meios aquosos via PMAO (Fig. S1) preserva intensidade de PL e morfologia, conforme confirmado por espectros UV-vis, PL, MET e FTIR. Espectros FTIR demonstram abertura bem-sucedida do anel anidrido e formação de COOH na superfície do QD.

Testes de estabilidade (Fig. 3) demonstram que QDs hidrofóbicos retêm 85% de PL após purificações repetidas, e QDs encapsulados em PMAO mantêm >85% de PL após 400 h em PBS, em pH 1-13, e até 90 °C (restantes 76% PL). Estes resultados confirmam adequação para ensaios biológicos.

Conjugação com anticorpos CRP (Fig. 4a) reduz intensidade de PL em ~40% devido a perdas de separação mas preserva forma espectral. ELD mostra aumento de diâmetro hidrodinâmico de 46 nm (QDs-PMAO) para 120 nm (QDs-mAb), confirmando conjugação bem-sucedida sem agregação.

Usando QDs-mAb em FLISA (Fig. 5a) produz clara resposta dose-resposta quadrática (R² = 0,9991) sobre 0-400 ng mL⁻¹. O LOD de 0,85 ng mL⁻¹ supera a referência CdSe/ZnS em 15%. Experimentos de recuperação (Tabela 1) mostram 83,6-105,9% de precisão em concentrações baixas, médias e altas de CRP, ressaltando confiabilidade do ensaio.

Conclusões

Desenvolvemos uma síntese escalável, livre de fosfina, de QDs núcleo/casca ZnSe/CdS/ZnS com supressão de reabsorção que combinam estruturas de banda tipo-II e tipo-I. Os QDs entregam alto QY (82%), grande deslocamento de Stokes e excelente estabilidade, permitindo FLISA altamente sensível para detecção de CRP (LOD = 0,85 ng mL⁻¹). Estas propriedades posicionam QDs ZnSe/CdS/ZnS como ferramentas promissoras para diagnóstico biomédico e dispositivos optoeletrônicos.

Abreviações

BSA

Albumina sérica bovina

CRP

Proteína C-reativa

DLS

Espalhamento dinâmico de luz

EDC

1-etil-3-(3-(dimetilamino)propil)carbodiimida

EDS

Espectroscopia de raios X dispersiva em energia

ELISA

Ensaio imunoenzimático ligado a enzima

FLISA

Ensaio imunoenzimático ligado a fluorescência

FWHM

Largura total na metade do máximo

LOD

Limite de detecção

MES

Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico

OT

1-octanotiol

PMAO

Poli(anidrido maleico-alt-1-octadeeno)

QDs

Pontos quânticos

QYs

Rendimentos quânticos

sulfo-NHS

N-hidroxissuccinimida sulfonada