Anticorpo monoclonal de heparanase marcado com nanopartículas de ouro magnético e sua aplicação subsequente para imagens de ressonância magnética de tumor

Resumo

A heparanase (HPA) é expressa de forma ubíqua em vários tumores malignos metastáticos; estudos anteriores demonstraram que o HPA era um potencial antígeno associado ao tumor (TAA) para a imunoterapia do tumor. Procuramos avaliar a viabilidade de HPA como um TAA comum para imagem por ressonância magnética (MRI) de metástases tumorais e sua aplicação potencial na imagem molecular de tumor. Preparamos uma sonda direcionada com base em nanopartículas de ouro magnéticas acopladas a um anticorpo anti-HPA para a detecção específica de HPA por ressonância magnética. A especificidade da sonda alvo foi validada in vitro por incubação da sonda com várias células tumorais, e a sonda foi capaz de detectar células HPA (+) seletivamente. Descobrimos que as sondas exibiam intensidade de sinal significativamente reduzida em várias células tumorais e a intensidade do sinal diminuiu significativamente após a sonda-alvo ter sido injetada em camundongos nus portadores de tumor. No estudo, demonstramos que a sonda HPA &GoldMag tinha excelentes propriedades físicas e químicas e atividades imunológicas e poderia atingir especificamente muitos tecidos de células tumorais in vitro e in vivo. Isso pode fornecer uma base experimental para a imagem molecular de heparanase tumoral que expressa altamente usando mAbs HPA.

Histórico

A metástase tumoral é um comportamento maligno que é a principal causa de morte em pacientes com tumor. Atualmente, não há estratégias eficazes para detectar metástases tumorais precoces. Ultrassons tipo B, tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (MRI) são atualmente as ferramentas padrão para o diagnóstico de metástases tumorais, mas eles só podem distinguir tumores metastáticos de certos tamanhos quando a maioria dos pacientes já sofre metástase à distância [1 , 2]. Assim, é urgente desenvolver novas estratégias para detectar metástases tumorais precoces.

Nos últimos anos, a imagem molecular, como a imagem molecular por RM, tornou-se uma nova opção para o diagnóstico e tratamento precoce de tumores devido à sua boa resolução espacial e sensibilidade média ao agente de contraste [3, 4]. O desenvolvimento de novos agentes de contraste que fornecem mais do que realce de imagem é uma das principais motivações no desenvolvimento de ressonância magnética. Recentemente, o uso de sondas moleculares superparamagnéticas como um sistema de amplificação de sinal forte aumenta muito a sensibilidade de agentes de contraste de direcionamento de RM. Complexos de íons paramagnéticos ou mAbs conjugados com partículas magnéticas têm sido usados para alterar o tempo de relaxamento do tumor [5]. A imagem molecular usando uma combinação de nanomateriais magnéticos e mAbs contra antígenos associados a tumores (TAAs) é um foco de pesquisa recente. A maioria dos TAAs descobertos até o momento, como AFP, PSA e CEA, são específicos do tecido tumoral [6]. Assim, a combinação de mAbs contra esses TAAs com nanomateriais magnéticos é útil para tumores que expressam esses antígenos específicos. Portanto, a identificação de um antígeno tumoral comum que é adequado para uma variedade de tumores e a marcação de mAbs contra tal antígeno com nanomateriais magnéticos é útil na imagem molecular de tumor.

A heparanase (HPA) é um gene associado à metástase tumoral que foi clonado simultaneamente por quatro laboratórios em 1999 [7,8,9,10]. Apenas a endoglicosidase endógena pode degradar o proteoglicano de heparan sulfato (HSPG), o principal componente do proteoglicano na matriz extracelular (ECM). O HPA é expresso de forma ubíqua em tumores malignos metastáticos e seu nível de expressão está intimamente associado à metástase tumoral. HPA pode interromper a integridade da ECM e da membrana basal (BM) através da clivagem de HSPG na ECM e BM, levando à liberação e ativação de moléculas ancoradas na ECM e, em seguida, promovendo a angiogênese tumoral e metástase [11, 12]. Nossos estudos anteriores demonstraram que o HPA pode ser usado como um TAA para imunoterapia tumoral [13,14,15,16]. Aqui, procuramos avaliar se o HPA está disponível para ser um TAA comum para imagens moleculares de metástases tumorais e sua potencial aplicação em imagens moleculares de tumores.

Neste estudo, usamos nanopartículas magnéticas de ouro (30 nm) como o agente de contraste e mAbs HPA como vetores de direcionamento para construir sondas moleculares HPA e GoldMag, e examinamos a viabilidade e a importância dessas sondas em imagens moleculares de RM para o diagnóstico precoce de tumor metástase. Os efeitos biológicos antitumorais in vitro de anticorpos HPA também foram avaliados para fornecer uma base experimental para a aplicação de mAbs HPA no tratamento de tumores.

Métodos

Linhas celulares e ratos

Sete linhas celulares foram utilizadas neste estudo. As linhas de células positivas para heparanase, incluindo a linha de células de câncer de fígado HepG2, as linhas de células de câncer gástrico humano MKN45 e SGC-7901, a linha de células de câncer de cólon SW480 e a linha de células de osteossarcoma humano U2OS, foram adquiridas da American Type Culture Collection. As linhas de células negativas para heparanase, a linha de células de câncer de mama humano MCF-7 e a linha de células de fibroblastos embrionários primários humanos HF foram fornecidas pelo Dr. Liang (Burn Research Institute, Third Military Medical University, Chongqing, China). As células HepG2 foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino. As células SGC-7901, SW480, U2OS e HF foram cultivadas em RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino. As células MKN45 e MCF-7 foram cultivadas em RPMI 1640 contendo 15% de soro fetal bovino. Todas as células foram cultivadas em 5% CO ₂ incubadora a 37 ° C e passadas a cada 24-48 h. Quinze ratinhos nus BALB / c (4 a 5 semanas de idade) foram adquiridos no Animal Department, Third Military Medical University. Os estudos em animais foram realizados de acordo com o comitê de ética local da Terceira Universidade Médica Militar. Todos os camundongos nus foram mantidos em um ambiente livre de patógenos específicos.

Western Blot

Western blot foi realizado para detectar a expressão da proteína Hpa seguindo o procedimento descrito em nosso estudo anterior [17]. Cada linha celular foi lisada com o reagente de extração M-PER (Pierce Co.). As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio BCA (Bio-Rad, CA, EUA). Trinta microgramas de proteínas foram fracionados por SDS-PAGE 10% e depois transferidos para uma membrana de polivinilidenodifluoreto (PVDF) (Roche, Rotkreuz, Suíça). A membrana foi bloqueada com 5% ( w / v ) leite desnatado em TBST (20 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl e 0,1% [ v / v ] Tween-20) por 2 h em temperatura ambiente. Em seguida, a membrana foi sondada com uma diluição de 1:200 de anticorpo anti-HPA (Insight, Israel) em tampão de bloqueio a 4 ° C durante a noite. A membrana foi lavada quatro vezes com TBST e incubada com um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano silvestre contra IgG de camundongo por 1 h em temperatura ambiente. A membrana foi então enxaguada com TBST e as bandas de proteína foram visualizadas com ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare, NJ, EUA). As imagens foram analisadas com o software Quantity One 4.1 (Bio-Rad). Os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.

Coloração imunohistoquímica

A expressão de Hpa nas linhas celulares acima foi detectada por imunocitoquímica. Resumidamente, as células acima foram cultivadas em lamínulas estéreis a 37 ° C em 5% de CO ₂ incubadora por 48 h. Após a atividade da peroxidase endógena ter sido bloqueada pelo tratamento com 0,3% H ₂ O ₂ -metanol por 20 min, as células foram incubadas com o anticorpo primário Hpa (a diluição do anticorpo foi de 1:100) durante a noite a 4 ° C. Após lavagem completa com PBS contendo 0,1% de Triton X-100, as lâminas foram incubadas com um anticorpo secundário por 20 min a 20 ° C. Finalmente, as lâminas foram incubadas por 15 min com um reagente enzimático avidina-biotina. As lâminas foram então imersas em uma solução de 3,3′-diaminobenzidina / H2O2. PBS foi usado como controle negativo.

Construção da sonda molecular HPA &GoldMag e micrografia de força atômica

A construção da sonda molecular foi realizada usando o kit GoldMagTM-CS (empresa de nanotecnologia magnética Xi’an Gold, GNK0202, Xi’an, China) de acordo com as instruções de operação. A concentração do anticorpo HPA é de 1 mg / ml. Uma micrografia de força atômica (AFM) foi usada para avaliar a forma, o tamanho e a aparência da superfície das nanopartículas. As nanopartículas de ouro magnéticas não rotuladas ou nanopartículas de ouro magnéticas rotuladas foram colocadas na lamela e foram secas ao ar em temperatura ambiente por 24 h. As amostras secas foram analisadas usando um microscópio de força atômica (AFM, Nanoscope, Digital Instruments, Santa Barbara, CA).

Imunofluorescência

Resumidamente, as células foram cultivadas em lamínulas estéreis a 37 ° C em um CO 5% ₂ incubadora por 48 h. Em seguida, as células foram fixadas com 4% ( w / v ) formaldeído em PBS por 30 min e permeabilizado com 0,2% ( v / v ) Triton X-100 por 5 min em temperatura ambiente. As células foram bloqueadas incubando as lamelas com 10% ( v / v ) soro de cabra em PBS por 30 min. Em seguida, as células foram coradas com sondas moleculares HPA e GoldMag ou sondas normais de IgG e GoldMag de camundongo em uma diluição de 1:50 seguido por IgG de cabra anti-camundongo marcado com Cy3 em uma diluição de 1:100. As células foram então coradas com 0,4 mg / mL de DAPI (Sigma-Aldrich) durante 10 min à temperatura ambiente. As imagens microscópicas foram adquiridas usando um microscópio confocal a laser. Sondas normais de IgG e GoldMag de camundongo foram usadas como controle negativo.

Citometria de fluxo

A atividade da sonda HPA &GoldMag foi determinada por citometria de fluxo. As células foram bloqueadas com soro de cabra por 1 h. Em seguida, as células foram coradas com uma sonda HPA &GoldMag de 10 μg ou IgG &GoldMag de camundongo normal a 4 ° C durante a noite, lavadas quatro vezes com PBS e, em seguida, incubadas com um anticorpo marcado com FITC contra IgG de camundongo por 1 h a 37 ° C. As células foram lavadas com PBS e a intensidade da fluorescência medida com um citômetro de fluxo (Becton Dickinson).

Estudo in vitro de nanopartículas magnéticas de ouro para imagens de ressonância magnética

A solução magnética de nanopartículas de ouro (5 mg / ml) foi diluída em série duas vezes (1:20–1:1280) usando uma solução de agarose a 1%. As soluções foram solidificadas em tubos de EP. A varredura MR foi realizada usando um gel de agarose a 1% como um controle em branco. Os parâmetros de varredura foram os seguintes:T1WI; TR600 ms / TE12 ms; espessura, 2,0 mm; FOV, 150 mm; e T2WI; TR6000 ms / TE92 ms; espessura, 2,0 mm; FOV, 150 mm. As sondas moleculares HPA e GoldMag MR foram construídas usando mAbs HPA marcados com partículas magnéticas de ouro de 30 nm. As células foram rotineiramente cultivadas em placas de cultura de 100 mm, e sondas HPA e GoldMag ou sondas IgG e GoldMag negativas foram então adicionadas às culturas de células e incubadas a 37 ° C por 90 min. As sondas não ligadas foram bloqueadas pela adição de uma quantidade apropriada de soro de cabra. Após lavagem com PBS três vezes, as células foram digeridas com tripsina. As células foram então coletadas, misturadas com uma solução de agarose a 1% e transferidas para tubos EP de 1,5 ml. A varredura de RM foi realizada usando um scanner de RM de 3,0 T (os parâmetros de varredura foram os mesmos que os descritos acima) usando a bobina de ressonância magnética específica para animais. Antes da varredura, os camundongos foram anestesiados com pentobarbital a 1% e colocados na cama de varredura.

Estudo In Vivo de Nanopartículas Magnéticas de Ouro para Imagens de RM

Camundongos nus machos de quatro a 6 semanas de idade (26-30 g) foram injetados por via subcutânea no quadril com 200 μl de células MKN45. Cada rato nu foi injetado com aproximadamente 2,0 × 10 ⁶ células. Após 2 semanas, os tumores são visíveis e usados para imagens de ressonância magnética. Antes da injeção e 2 h após a injeção, a varredura de RM foi realizada usando um scanner de RM 3.0 T. Os parâmetros foram T2WI, TR6000 ms / TE92 ms; espessura, 1,5 mm; e FOV, 120 mm. Posteriormente, o tumor, baço, fígado, rim, baço, coração e tecidos pulmonares foram coletados para realizar a coloração com azul da Prússia.

Análise estatística

Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão. A análise ANOVA foi realizada usando o software SPSS13.0. A P valor <0,05 indicou que a diferença foi significativa.

Resultados

HPA foi expresso de forma diferente em várias células cancerosas

As análises de Western blot e de coloração imuno-histoquímica foram usadas para testar a expressão de Hpa em células HepG2, SGC-7901, MKN45, MCF-7, SW480 e U2OS. Os resultados mostraram que a expressão de Hpa foi muito maior em células HepG2, SGC-7901, MKN45, SW480 e U2OS, enquanto uma expressão muito mais baixa de Hpa foi detectada em células MCF-7 (Fig. 1).

Expressão de proteínas Hpa em várias linhas celulares. a Western blot foi usado para detectar a expressão da proteína HPA (65 kDa) em várias linhas de células tumorais. Pista 1, HepG2; pista 2, SGC-7901; pista 3, MKN45; pista 4, MCF-7; pista 5, SW480; pista 5, U2OS. b Análise imunohistoquímica da expressão de HPA em linhas celulares HepG2, SGC-7901, MKN45, MCF-7, SW480 e U2OS

Construção e detecção de sonda molecular HPA e GoldMag

A sonda molecular HPA &GoldMag foi preparada pelo acoplamento dos mAbs HPA com nanopartículas magnéticas de ouro usando a reação de acoplamento entre as superfícies das nanopartículas magnéticas de ouro. A microscopia de força atômica (AFM) foi usada para observar diretamente a estrutura da superfície da sonda. Mostramos que o diâmetro médio das nanopartículas de ouro magnéticas era de 13,78 nm sem marcação com mAbs HPA (Fig. 2a); os tamanhos das partículas eram homogêneos. Depois de ser marcado com mAbs HPA, o diâmetro médio foi de aproximadamente 24,80 nm (Fig. 2b). Estes resultados sugeriram que nanopartículas magnéticas de ouro eram adequadas para acoplamento com mAbs HPA.

a Modelo de acoplamento de nanopartículas magnéticas de ouro com mAbs HPA. b Varredura de força atômica de nanopartículas de ouro magnéticas

As sondas moleculares HPA e GoldMag podem se ligar especificamente a HPA

Primeiro, a especificidade da ligação entre a sonda molecular e HPA foi avaliada por imunofluorescência. Os resultados mostraram que uma grande quantidade de fluorescência vermelha foi detectada no citoplasma das células HepG2, MKN45, SW480 e U2OS, enquanto apenas uma pequena quantidade de fluorescência vermelha foi detectada nas células MCF-7, e nenhuma fluorescência foi detectada nas células HF . No entanto, IgG e GoldMag de camundongo negativo não mostraram qualquer interação com HPA em nenhuma linhagem de células (Fig. 3). Além disso, usamos a citometria de fluxo para testar a especificidade da sonda molecular HPA &GoldMag. Mostramos uma resposta negativa em células HF e observamos 40% de taxas positivas em células MCF-7 e 95% de taxas positivas em células HepG2, SW480, U2OS e MKN45. Estes resultados indicam que as sondas podem ligar-se especificamente a HPA expresso em células tumorais.

Especificidade e atividade de ligação da sonda detectada por imunofluorescência e citometria de fluxo. a A imunofluorescência foi realizada usando sondas conforme indicado. b A citometria de fluxo foi usada para testar a especificidade da sonda molecular HPA &GoldMag

Imagens de RM de sondas HPA e GoldMag in vitro

Após a diluição em série usando agarose a 1%, a imagem de RM de nanopartículas de ouro magnéticas usando uma sequência T2WI mostrou redução de sinal diferente. O sinal T2WI de uma diluição de 1:640 foi muito menor do que o do controle de gel de agarose a 1% ( P <0,05) (Fig. 4a, b). Os resultados mostraram que as nanopartículas magnéticas de ouro podem reduzir o sinal MR de forma eficaz, mesmo em uma concentração baixa, sugerindo que as nanopartículas magnéticas de ouro podem ser adequadas para imagens moleculares. Em seguida, as sondas moleculares HPA e GoldMag foram usadas para marcar células HepG2, SGC7901, MKN45, SW480, U2OS, HF e MCF-7 que foram então misturadas com agarose a 1% e colocadas sob ressonância magnética 3,0 T (MR) (Fig. 4c). Varredura de RM usando T1WI (Fig. 4c, d) ou sequência T2WI (Fig. 4c, e) para varredura axial e coronal. Os resultados mostraram que, em comparação com a sequência T1WI, o sinal usando a sequência T2WI de varredura MR foi significativamente reduzido ( P <0,05) enquanto o sinal nas células HF após a marcação não foi significativamente alterado ( P > 0,05), e o sinal nas células MCF-7 após a marcação foi minimamente reduzido ( P <0,05).

a Imagem de RM de nanopartículas de ouro magnéticas após duas diluições em série. b Diagrama dos resultados estatísticos das intensidades do sinal de imagem de RM de duas nanopartículas de ouro magnéticas diluídas em série. c Imagem de RM de todas as células após a marcação com as sondas. Pista 1, HF; pista 2, MCF-7; pista 3, HepG2; pista 4, SGC-7901; pista 5, MKN45; pista 5, SW480; pista 6, U2OS. d Resultados estatísticos comparando as intensidades do sinal de imagens de RM usando a sequência T1WI em células marcadas com sondas HPA e GoldMag. e Resultados estatísticos para as intensidades de sinal detectadas com imagens de RM usando a sequência T2WI em células marcadas com sondas HPA e GoldMag

Imagens de RM de sondas HPA e GoldMag em camundongos nus

Todos os camundongos nus foram anestesiados com pentobarbital sódico na dose de 50 mg / kg. A sonda molecular foi injetada na veia da cauda dos camundongos nus, e a ressonância magnética foi realizada antes e 2 h após a administração. Uma vez que a sonda pode ser absorvida por macrófagos no pulmão e fígado e excretada pelo rim, os resultados da varredura mostraram que, após a injeção, o tumor, fígado, rim e tecidos pulmonares em camundongos nus reduziram significativamente os sinais, em comparação com os sinais que foram detectados antes da injeção ( P < 0,05) (Fig. 5).

a Imagem de RM de camundongos nus antes e 2 h após a injeção de sondas de controle ou HPA &GoldMag. A seta indica os tumores em camundongos. b Comparação das intensidades do sinal de imagens MR usando T2WI antes e depois da injeção do controle ou sondas HPA &GoldMag em camundongos nus. ^* P <0,01

Discussão

A invasão e metástase do tumor é um processo biológico complexo que causa o mau prognóstico dos tumores. Assim, o diagnóstico precoce da metástase tumoral é uma estratégia importante para a seleção de estratégias de tratamento clínico. A ressonância magnética é um método não invasivo útil para a detecção de tumor; ele permite imagens de tecidos de alto contraste multidimensionais. No entanto, a ressonância magnética não pode detectar tumores com um tamanho pequeno e agentes de alto contraste, como nanopartículas de metal (ferro, ouro, etc.) devem ser usados para melhorar a visualização do tumor [18,19,20]. O desenvolvimento de novos agentes de contraste baseados em novos nanomateriais é benéfico para aprimorar as técnicas de ressonância magnética para a detecção precoce de cânceres. Entre os agentes de imagem, a partícula de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) é usada como um agente de contraste comum na imagem molecular MR, em que as nanopartículas magnéticas de ouro são materiais nanocompósitos superparamagnéticos com Fe ₃ O ₄ (núcleos) / estrutura Au (casca) [21,22,23,24]. As propriedades superparamagnéticas de nanopartículas inorgânicas são úteis para imagens de ressonância magnética (MRI) [25]. Uma combinação dessas nanopartículas com agentes específicos de tecido (anticorpos ou substâncias de baixo peso molecular) permite a detecção e diagnóstico precisos de tumores. Numerosos estudos demonstraram que o HPA é expresso em muitos tumores, e seu nível de expressão está intimamente associado ao potencial metastático dos tumores [26]. O HPA pode destruir a integridade da ECM e BM por meio da degradação do HSPG, que libera moléculas ativas como bFGF, HGF e VEGF ancoradas na ECM, promovendo assim a progressão tumoral [27,28,29,30]. Uma vez que o HPA é expresso principalmente em tumores de estágio intermediário a tardio, nossos estudos anteriores mostraram que o HPA poderia ser usado como um TAA comum para terapia tumoral [13,14,15]. Portanto, o HPA pode ser um alvo potencialmente útil para terapia e imagens moleculares de tumor.

Nanopartículas magnéticas de ouro são nanomateriais compostos superparamagnéticos com Fe ₃ O ₄ (núcleo) / estrutura Au (casca) que são produzidas pela redução de Au ³⁺ por cloridrato de hidroxilamina a partir de Fe superparamagnético ₃ O ₄ partículas [31, 32]. Uma vez que o método de marcação é bastante simples, eles podem ser usados para aplicações biológicas, como seleção de células, purificação de proteínas, separação de ácido nucleico e imunoensaios. Portanto, seguindo um procedimento estabelecido, fomos capazes de preparar e caracterizar com sucesso nanopartículas de óxido de ferro revestidas de ouro ligadas a anticorpos anti-HPA. Nesta pesquisa, partículas magnéticas de ouro de 30 nm foram usadas porque são muito mais estáveis do que partículas magnéticas de ouro de 50 nm. Um miligrama de partículas magnéticas de ouro de 30 nm pode se ligar a aproximadamente 200 μg de mAbs HPA. Nossos dados mostraram que o uso de nanopartículas magnéticas de ouro em uma diluição de 1:640 (aproximadamente 10 μg) produziu sinalização reduzida em comparação com o grupo de controle em branco em varredura de RM de 3,0 T ( P < 0,05). Assim, o valor crítico para imagens in vivo usando partículas magnéticas de ouro pode ser calculado.

A atividade e a especificidade das sondas de mAb HPA acopladas a nanopartículas de ouro magnéticas foram posteriormente detectadas usando microscopia confocal a laser, citometria de fluxo e microscopia de força atômica. Resumidamente, a sonda foi testada in vitro por incubação da sonda alvo e da sonda de controle negativo com células HPA (+) e (-). Aqui, as células de câncer de mama MCF-7 humanas exibiram expressão de HPA fraca, enquanto as células MKN45, SW480, U2OS, HepG2 e SGC-7901 tiveram expressão de HPA mais alta. Além disso, IgG de camundongo normal foi usado como um controle para os mAbs HPA para provar ainda mais a especificidade da nanopartícula.

Depois que a especificidade da sonda foi testada in vitro , as sondas direcionadas e de controle foram injetadas em camundongos nus injetados por via subcutânea com células de câncer gástrico humano MKN45. Uma vez que o diâmetro dos tecidos tumorais atingiu 1 cm, a varredura de RM foi realizada usando uma câmara de RM de 3,0 T para detectar mudanças de sinal em tumores antes e depois da injeção com sondas. Os resultados da varredura mostraram que os sinais do tumor foram significativamente reduzidos 2 h após a injeção da sonda em comparação com os sinais antes da injeção da sonda. Estes resultados demonstraram que as sondas HPA e GoldMag tinham excelentes atividades imunológicas e melhores efeitos em camundongos nus com células MKN45.

Conclusões

Em resumo, demonstramos que as sondas moleculares HPA e GoldMag acopladas aos mAbs HPA tinham excelentes propriedades físicas e químicas. A sonda pode ter como alvo específico muitas células tumorais que expressam alto HPA tanto in vitro quanto in vivo. Usando varredura de RM de 3,0 T, as sondas mostraram reduzir significativamente o sinal T2WI em tecidos tumorais; isso pode fornecer uma base experimental para imagens moleculares de metástases tumorais.

Abreviações

AFM:: Micrografia de força atômica
BM:: Membrana basal
CT:: Tomografia computadorizada
ECM:: Matriz extracelular
HPA:: Heparanase
HSPG:: Proteoglicano de heparano sulfato
MRI:: Imagem de ressonância magnética
PVDF:: Polivinilidenodifluoreto
TAA:: Antígeno associado ao tumor

Estrutura Eletrônica e Características I-V das Nanoribbons InSe Preparação de polietileno de peso molecular ultra-alto / nanocompósito de grafeno polimerização in situ via estrutura esférica e sanduíche de grafeno / suporte Sio2

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