Nanopartículas de Gd₂O₃ Funcionalizadas com Ácido Hialurônico: Aprimorando Radioterapia Guiada por RM para Tumores

Resumo

Localização imprecisa e radiorresistência intrínseca de tumores sólidos dificultam seriamente a implementação clínica da radioterapia. Neste estudo, fabricamos nanopartículas de óxido de gadolínio funcionalizadas com ácido hialurônico (HA-Gd₂O₃ NPs) via processo hidrotérmico one-pot para imagem de ressonância magnética (RM) eficaz e radiossensibilização de tumores. Em virtude da funcionalização com HA, as NPs HA-Gd₂O₃ preparadas com diâmetro de 105 nm mostraram dispersibilidade favorável em água, baixa citotoxicidade e excelente biocompatibilidade e entraram prontamente no citoplasma de células cancerígenas por endocitose mediada por receptor de HA. Importante, NPs HA-Gd₂O₃ exibiram alta relaxividade longitudinal (r₁) 6,0 mM⁻¹S⁻¹ como agentes de contraste de RM e aumento de radiossensibilização de maneira dependente de dose. Estas descobertas demonstraram que NPs HA-Gd₂O₃ como agentes teranósticos bifuncionais têm grande potencial em diagnóstico e radioterapia de tumores.

Introdução

A radioterapia tem sido amplamente aplicada no câncer, que envolve raios X de alta energia e deposição de doses de irradiação em sítios tumorais causando dano por radicais livres ou dano ao DNA [1,2,3,4]. No entanto, baixa radiossensibilidade, imprecisão de localização do tumor e discriminação pobre entre lesões e tecidos normais causando efeitos colaterais de irradiação limitam a implementação clínica da radioterapia [5]. Portanto, é importante desenvolver métodos para aumentar a radiossensibilidade do tumor enquanto minimiza efeitos colaterais sistêmicos. A combinação de nanotecnologia e radioterapia é uma prioridade bem estabelecida para radiossensibilização.

Nos últimos anos, a nanotecnologia tem sido considerada uma estratégia atraente para diagnóstico e terapia do câncer [6,7,8,9,10,11]. Uma das funções principais das nanopartículas (NPs) é uma segmentação tumoral precisa baseada no acúmulo seletivo de NPs em tecidos tumorais via segmentação passiva, efeito de permeabilidade e retenção aumentada (EPR), segmentação ativa e tempo de circulação prolongado [12,13,14]. Nosso trabalho anterior demonstrou que dopar NPs de carbono com heteroátomos efetivamente ajusta suas propriedades intrínsecas e introduz características benéficas [15,16,17]. Interessantemente, NPs podem ser usadas como radiossensibilizadores [18]. NPs de metais pesados (com elementos de alto Z) (ex: Au, Bi, Gd) como radiossensibilizadores promissores podem ser usadas em terapia de radiossensibilização devido à sua alta seção de choque de captura de fótons de raios X e efeito de espalhamento Compton [19]. Quando raios X interagem com nanopartículas de alto Z, elétrons Auger e fotoelétrons, a liberação de elétrons secundários ferem células cancerígenas, proporcionando aumento de dose durante radioterapia [20]. Até o momento, NPs baseadas em gadolínio (GdNPs) são mostradas como agentes de contraste (CAs) de RM eficazes [21, 22] e diferenciam tecido normal de tecido doente e lesões de maneira não invasiva e em tempo real. Esses agentes encurtam tempo de relaxamento longitudinal para afetar relaxividade longitudinal r₁ [23], e sua segmentação imprecisa frequentemente resulta em efeito colateral. É bem conhecido que ácido hialurônico (HA) é um ligante principal e transportador de fármacos para sítios alvo com receptores de HA como determinante de cluster 44 (CD44) [24,25,26].

Baseado nos resultados de estudos anteriores, usamos HA como ligante de segmentação para funcionalizar NPs de Gd₂O₃ com funções duplas: CAs de RM com segmentação tumoral eficaz e radiossensibilizadores para superar radiorresistência intrínseca e imprecisão de localização do tumor. Além disso, NPs HA-Gd₂O₃ exibem alta relaxividade longitudinal (r₁) como agentes promissores de imagem RM com melhor qualidade de imagem RM. Comparado com CAs atualmente disponíveis [27, 28], as NPs HA-Gd₂O₃ resultantes mostram três vantagens significativas: primeiro, as NPs HA-Gd₂O₃ exibem biocompatibilidade favorável devido ao uso da matriz extracelular natural como precursores. Segundo, a funcionalização com HA melhora significativamente a segmentação tumoral e reduz efeitos colaterais. Finalmente, as NPs HA-Gd₂O₃ possuem capacidade bifuncional em diagnóstico e terapia. Para verificar a eficácia e explorar o mecanismo de aumentos de radiossensibilização, avaliamos o efeito radiossensibilizante de NPs HA-Gd₂O₃ na viabilidade de células tumorais, ciclo celular e apoptose.

Resultados e Discussão

Preparação e Caracterização de NPs HA-Gd₂O₃

Neste estudo, NPs HA-Gd₂O₃ foram preparadas com sucesso usando um processo hidrotérmico simples como mostrado no Esquema 1. Tamanhos de partícula foram analisados por espalhamento dinâmico de luz, enquanto exame morfológico foi conduzido por microscopia eletrônica de transmissão. Como mostrado na Fig. 1a, NPs HA-Gd₂O₃ exibiram dispersão uniforme e formas quase esféricas discretas sem agregação aparente. Os diâmetros médios das NPs HA-Gd₂O₃ foram 105 nm. Comparado a tecidos normais, a permeabilidade capilar endotelial de tecidos tumorais foi aumentada e a fenda endotelial foi de 100-600 nm [29]. Portanto, NPs com tamanhos desejáveis foram facilmente imersas em tecidos tumorais e podem aumentar dramaticamente a eficiência de entrega passiva de fármacos.

Síntese esquemática de NPs HA-Gd₂O₃ do método hidrotérmico (A) e as seguintes aplicações biomédicas (B).

Caracterização de NPs HA-Gd₂O₃. Imagens TEM de baixa (a) e alta (b) ampliação. Distribuição de diâmetro (c) e padrões XRD (d) de NPs HA-Gd₂O₃.

A estrutura de fase de NPs HA-Gd₂O₃ foi investigada por XRD usando óxido de grafite (GO) em pó como controle. Como mostrado na Fig. 1d, um pico principal de difração (2θ = 12,04°) e dois picos menores (2θ = 29,6°, 42,1°) foram observados no padrão de difração de NPs HA-Gd₂O₃, que corresponderam aos picos característicos de GO (plano 100) e grafite (plano 002), respectivamente. O espaçamento de rede principal de NPs HA-Gd₂O₃ mostrou espaçamento menor (0,73 nm calculado pela fórmula de Bragg) que o espaçamento de GO de d₀₀₁ = 0,85 nm, onde o deslocamento para cima na posição do pico pode ser atribuído à diminuição no espaçamento entre camadas sp³. Todos os picos de difração amplos demonstraram que NPs HA-Gd₂O₃ tinham estrutura amorfa, que pode ser atribuída ao carbono altamente desordenado e diminuição no espaçamento de camada sp² (C–C) durante o processo de carbonização. O resultado indicou ainda que NPs HA-Gd₂O₃ com natureza cristalina pobre possuíam estrutura multicamada heterogênea, que foi consistente com nossos relatórios anteriores sobre pontos de carbono [30, 31].

Estrutura Química e Composição de Superfície de NPs HA-Gd₂O₃

Grupos funcionais de superfície e composição de NPs HA-Gd₂O₃ foram investigados usando espectroscopia de fotoelétrons de raios X e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. Como mostrado na Fig. 2a, o espectro XPS mostrou quatro picos típicos em 284,0, 400,0, 530,6 e 1188,5 eV, indicando que NPs HA-Gd₂O₃ eram principalmente compostas de gadolínio, carbono, oxigênio e hidrogênio. O espectro de alta resolução de Gd_3d (Fig. 2b) revelou a presença de dois picos fortes em 1187,5 eV e 1221 eV, correspondendo a uma divisão spin-órbita de 32 eV, correspondendo respectivamente aos níveis de energia 3d_5/2 e 3d_3/2 de Gd. Estas observações estavam em bom acordo com relatórios anteriores de NPs HA-Gd₂O₃. O espectro O (1s) mostrado na Fig. 2c foi dominado por um pico principal posicionado em 531,4 eV, que correspondeu à ligação entre O²⁻ e Gd³⁺. Espectroscopia FITR foi conduzida para amostras nuas e NPs HA-Gd₂O₃ (Fig. 2d). Para amostras nuas, como mostrado na Fig. 2a, bandas de absorção características de v_as O–C–O em 1580 e 1380 cm⁻¹ revelaram a presença de grupo carbonato. Os picos amplos em 3340 e 2900 cm⁻¹ foram atribuídos a vibrações de alongamento O–H e C–H, respectivamente, que corresponderam à água adsorvida na superfície. Para NPs HA-Gd₂O₃, as vibrações de alongamento de COO⁻ em 1580 e 1380 cm⁻¹ foram aprimoradas, indicando a introdução do grupo carboxílico do ácido hialurônico. Estes resultados revelaram que os grupos funcionais de NPs HA-Gd₂O₃ continham principalmente numerosos grupos carbonil, carboxilato e hidroxila. A presença destes grupos funcionais localizados na superfície dotou NPs HA-Gd₂O₃ com excelente dispersibilidade em água. Importante, o íon Gd incorporado na superfície das NPs pode ser útil para imagem RM e radiossensibilização, que previne dramaticamente o íon Gd de vazar para ambientes circundantes.

A estrutura química e composição das NPs HA-Gd₂O₃. a Espectro XPS de varredura completa de NPs HA-Gd₂O₃. b Espectro Gd_3d. c Espectro O_1S. d Espectro FTIR de NPs HA-Gd₂O₃.

Biocompatibilidade de NPs HA-Gd₂O₃

Biocompatibilidade de NPs HA-Gd₂O₃, como agentes biomédicos potenciais, é crítica para sua aplicação biomédica. Primeiro, a citotoxicidade inerente de NPs HA-Gd₂O₃ foi avaliada em células HepG2 e VSMC usando ensaio CCK-8. Como mostrado na Fig. 3a e S. Fig. 1, NPs HA-Gd₂O₃ não exibiram citotoxicidade óbvia até 3 dias. Mesmo a uma concentração de 200 μg/mL após tempo de exposição de 24 h, viabilidade celular foi aproximadamente 90%. Segundo, a hemocompatibilidade de NPs HA-Gd₂O₃ in vivo foi estimada usando ensaio de hemólise. Como mostrado na Fig. 3b, observamos hemólise de hemácias na água (controle positivo). Em contraste, nenhuma hemólise óbvia foi observada após incubação de NPs HA-Gd₂O₃ em diferentes concentrações de 0 a 200 μg/mL por 2 h, que foi similar aos resultados para solução PBS (controle negativo). Comparado ao controle negativo, a porcentagem de hemólise em diferentes concentrações de NPs HA-Gd₂O₃ foi ligeiramente avaliada baseada na absorbância do sobrenadante a 541 nm. Os resultados mostraram que as porcentagens de hemólise de NPs HA-Gd₂O₃ foram todas menores que 3% na concentração estudada, verificando sua hemocompatibilidade favorável. Para examinar toxicidade potencial, NPs HA-Gd₂O₃ foram injetadas intravenosamente em camundongos Balb/c (como visto em S. Fig. 2). Após 1 semana, estes camundongos foram sacrificados, e bexiga, rim e baço foram colhidos para análise de secção patológica. Como mostrado em S. Fig. 2, o resultado de secções patológicas mostrou que não houve lesão ou resposta inflamatória observável nos órgãos de camundongos tratados com NPs HA-Gd₂O₃. Estes resultados indicaram claramente que as NPs HA-Gd₂O₃ sintetizadas tinham citocompatibilidade favorável e boa hemocompatibilidade.

a Efeito de NPs HA-Gd₂O₃ na viabilidade de células HepG2 e VSMC usando ensaio CCK-8. b Atividade hemolítica de NPs HA-Gd₂O₃ em diferentes concentrações (50, 100, 200, 300 e 400 μg/mL). PBS e água foram usados como controle negativo e positivo, respectivamente.

Estudo de Phantom de RM

Os tempos de relaxamento longitudinal (T₁) de NPs HA-Gd₂O₃ foram investigados in vitro junto com o contraste comercial Magnevist (Gd-DTPA) como controle usando salina fosfatada tamponada (pH = 7,4, 0,2 M). Com aumento das concentrações de Gd, a intensidade de sinal de imagens phantom T₁-pesadas aumentou claramente, indicando que todas as amostras poderiam gerar aumento de contraste de RM em sequências T₁-pesadas (Fig. 4a). Além disso, gráficos da intensidade de sinal versus tempo de inversão deram tempos de relaxamento T₁ de cada agente de contraste em concentrações específicas. Como mostrado na Fig. 4b, o valor r₁ de NPs HA-Gd₂O₃ foi medido como 6,0 mM⁻¹S⁻¹, que foi significativamente maior que o de Magnevist (3,86 mM⁻¹S⁻¹) sob as mesmas condições. O r₁ aprimorado pode ser atribuído ao raio hidrodinâmico e área de superfície muito maiores de NPs HA-Gd₂O₃; portanto, mais átomos de Gd dopados na rede de NPs tornaram-se acessíveis a moléculas de água, encurtando o relaxamento longitudinal e aumentando o valor r₁.

a Imagens phantom T₁ de NPs HA-Gd₂O₃ com diferentes concentrações de íons Gd totais. b Gráficos correspondentes de 1/T₁ contra concentrações de íons Gd totais. c Imagem RM T₁ in vivo e análise de camundongos após injeção intravenosa de NPs HA-Gd₂O₃ como agentes de contraste. d Quantificação de mudanças de sinal (razão SNR) na bexiga e rim em diferentes pontos de tempo após administração (n = 3). *p < 0,05.

Imagem RM In Vivo

Para determinar aplicações potenciais in vivo, o desempenho de imagem RM e destino de circulação de NPs HA-Gd₂O₃ (10 mg/kg) foram investigados usando um scanner RM com camundongos BALB/c normais como modelo. Comparado com imagens pré-injeção (Fig. 4c), regiões mais brilhantes do rim e bexiga como indicado pelos círculos tracejados foram claramente observadas a 10 min pós-injeção, demonstrando que NPs HA-Gd₂O₃ poderiam ser usadas como CAs aumentam relaxamento T₁ nestes órgãos principais in vivo. Importante, o aumento de contraste de NPs HA-Gd₂O₃ foi mantido até 60 min pós-injeção, que foi muito mais longo que o de moléculas pequenas de complexo de Gd (meia-vida de cerca de vários minutos em animais pequenos) [27], indicando que NPs HA-Gd₂O₃ possuíam tempos de retenção mais longos in vivo que o contraste comercial. Para analisar o efeito de contraste RM quantitativamente, calculamos a razão sinal-ruído (SNR) analisando finamente regiões de interesse das imagens RM e calculamos os valores de SNR_post/SNR_pre para representar o aumento de sinal relativo (RSE) (Fig. 4d). Os valores RSE de NPs HA-Gd₂O₃ no rim foram 1,35, 1,99 e 1,86. Similarmente, os valores RSE de NPs HA-Gd₂O₃ na bexiga foram maiores que os no rim (1,29, 3,59 e 2,26). NPs HA-Gd₂O₃ com tamanho grande (mais de 100 nm) exibiram longos tempos de circulação, então podem ser eliminados via via biliar-intestinal de acordo com resultados anteriores [32]. Além disso, o tempo de circulação prolongado in vivo pode ter aumentado a segmentação passiva em tumores ao aprimorar o efeito EPR.

Imagem de Tumor

NPs HA-Gd₂O₃ com excelente desempenho de imagem RM e longo tempo de circulação fornecem grande oportunidade para imagem de tumores através de efeito EPR. Estabelecemos assim modelos de tumor hepático subcutâneo para investigar se carcinomas hepatocelulares (HCCs) podem ser detectados por RM aprimorada por NPs HA-Gd₂O₃. Após injeção intravenosa de NPs HA-Gd₂O₃, observamos que a região do tumor subcutâneo torna-se mais brilhante que o tecido circundante como visto por varredura coronal e transversal (Fig. 5a). O RES do tumor subcutâneo atingiu dramaticamente 1,54 e 1,83 com varredura transversal e coronal, respectivamente, indicando acúmulo eficaz de NPs HA-Gd₂O₃ na região do tumor através do efeito EPR. Estas descobertas demonstram que NPs HA-Gd₂O₃ são altamente sensíveis para visualização RM de tumores. Muitos estudos mostraram que longo tempo de circulação poderia promover eficiência de segmentação passiva através de vasculatura vazada de tumores sólidos [33].

Imagem RM ponderada em T₁ (a) e análise quantificacional correspondente (b) de tumores xenoenxertados de câncer hepático de camundongo Heps após injeção intravenosa de NPs HA-Gd₂O₃.

Aumento de Radiossensibilização de NPs HA-Gd₂O₃

O excelente desempenho de NPs HA-Gd₂O₃ como agente de contraste T₁ nos levou a determinar sua localização na radiossensibilização de tumores com precisão. Primeiro, se aumento de dose ocorria com este tratamento combinado foi explorado usando ensaio CCK-8. Como representado na Fig. 6a, NPs HA-Gd₂O₃ isoladas (concentração 0-200 μg/mL) não influenciaram significativamente a viabilidade de HepG-2, mas irradiação de raios X (faixa 0-9 Gy) diminuiu viabilidade de células HepG-2 para menos de 70% a 9 Gy. Importante, combinação de irradiação de raios X com NPs HA-Gd₂O₃ diminuiu dramaticamente viabilidade de células HepG-2 para menos de 50%, particularmente a concentração de 200 μg/mL a 9 Gy. Em seguida, ensaio clonogênico foi conduzido para avaliar viabilidade celular em células HepG-2 após combinação de irradiação de raios X e NPs HA-Gd₂O₃. Como mostrado na Fig. 6b, NPs HA-Gd₂O₃ isoladas não tiveram influência dramática na formação de colônia de células HepG-2, mas irradiação de raios X diminuiu formação de colônia de células HepG-2 para 46,7%. No entanto, tratamento com irradiação de raios X e NPs HA-Gd₂O₃ inibiu notavelmente viabilidade de formação de colônia para 29,8%. As imagens correspondentes verificaram ainda a radiossensibilização de NPs HA-Gd₂O₃ contra células HepG-2.

Efeito de radiossensibilização de NPs HA-Gd₂O₃ in vitro. a Efeito sinérgico de NPs HA-Gd₂O₃ (0 μg/mL, 12,5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL e 200 μg/mL) e radiação de raios X (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy e 9 Gy) na viabilidade de células HepG2 usando ensaio CCK-8. *p < 0,05, **p < 0,01, a diferença foi estatisticamente significativa. b Ensaios de sobrevivência de colônias de células HepG2 tratadas com NPs HA-Gd₂O₃ e radiação de raios X e c análise quantitativa correspondente de habilidades de clonogênese. d Curvas de crescimento de volume de tumor de diferentes grupos de camundongos após diferentes tratamentos. Grupos: a controle, b radiação, c NPs HA-Gd₂O₃ e d radiação + NPs HA-Gd₂O₃. e Fotos de tumores coletados de diferentes grupos de camundongos no final do tratamento.

A eficácia da radioterapia in vitro nos encorajou a aplicar NPs HA-Gd₂O₃ combinadas com irradiação para controlar crescimento de tumor em camundongos portadores de tumor. Os volumes de tumores no controle e tratamentos isolados de NPs HA-Gd₂O₃ cresceram rapidamente e ambos aumentaram em 180%. Comparado com tratamentos de irradiação isolada 58%, NPs HA-Gd₂O₃ combinadas com radiação mostraram inibição eficiente de tumor em 38% após 10 dias de irradiação (Fig. 6d). O tumor foi fotografado, e os volumes médios de tumor em cada grupo mostraram que o volume médio de tumor no grupo (a) foi o mais alto enquanto o do grupo (d) foi o mais baixo entre todos os grupos (Fig. 6e). Estes resultados revelam que as NPs HA-Gd₂O₃ preparadas são promissoras para inibição de crescimento de tumores sob irradiação de raios X.

Ensaios de citometria de fluxo e coloração vivo/morto foram conduzidos para entender ainda mais o mecanismo de radiossensibilização no tratamento combinado de NPs HA-Gd₂O₃ e radiação de raios X. Como mostrado na Fig. 7a, fluorescência verde intensiva sem vermelho foi observada em células HepG-2 tratadas com NPs HA-Gd₂O₃ isoladas, que verificou alta viabilidade celular. Pequena quantidade de fluorescência vermelha foi observada após tratamentos de radiação de raios X, indicando baixo nível de apoptose celular. No entanto, forte fluorescência vermelha foi observada após tratamento combinado de NPs HA-Gd₂O₃ (200 μg/mL) e radiação, demonstrando que NPs HA-Gd₂O₃ poderiam aumentar dramaticamente apoptose celular induzida por irradiação de raios X. O mecanismo de radiossensibilização de NPs HA-Gd₂O₃ foi investigado adicionalmente usando citometria de fluxo. Como representado na Fig. 7b, radiação isolada e NPs HA-Gd₂O₃ induziram 27,55% e 19,12% de parada na fase G2/M, respectivamente. No entanto, tratamento combinado de NPs HA-Gd₂O₃ e radiação aumentou notavelmente parada na fase G2/M, variando de 30,89 a 33,27% de maneira dependente de dose. Enquanto isso, o tratamento combinado induziu morte celular apoptótica de 10,63 a 22,67%, como refletido pelas proporções sub-G1 quando NPs HA-Gd₂O₃ isoladas e radiação induziram 3,02% e 13,87%. Para investigar ainda mais o possível mecanismo de morte celular, método Annexin V-EGFP/PI foi conduzido pela citometria de fluxo. Emissão de Annexin V-EGFP foi plotada no eixo x, enquanto emissão de PI foi plotada no eixo y (Fig. 8). Quantidades de células necróticas, células em apoptose precoce, células em apoptose tardia e células vivas foram determinadas pela porcentagem de Annexin V⁻/PI⁺(Q3), Annexin V⁺/PI⁺ (Q2) e Annexin V⁻/PI⁻ (Q4), respectivamente. A porcentagem apoptótica de células no grupo controle e grupo de NPs HA-Gd₂O₃ isoladas (100 μg/mL) foram menores que 5%, resultando em influência sutil. Comparado com grupos de tratamento de radiação isolada (8,8%), a taxa de apoptose da combinação de NPs HA-Gd₂O₃ e radiação aumentou com o aumento da concentração variando de 50 a 200 μg/mL. Especialmente, a taxa de apoptose precoce de células aumentou obviamente para 33,2%, e apoptose precoce e tardia atingiram 44,3% quando a concentração é 200 μg/mL. Geralmente, a combinação de NPs HA-Gd₂O₃ e irradiação de raios X teve efeito sinérgico na formação de colônia celular, viabilidade celular de maneira dependente de dose e efeito de aumento de radiossensibilização. Baseado nestes resultados, NPs HA-Gd₂O₃ podem ser uma alternativa eficiente para aumentar radiossensibilização para radioterapia.

Aumento de dose de radiação de NPs HA-Gd₂O₃. a Coloração vivo-morto de células HepG2. Verde (corante diacetato de fluoresceína) = células vivas, vermelho (corante iodeto de propídio) = células mortas. Barras de escala = 200 mm. b Distribuição do ciclo celular após diferentes tratamentos foram analisadas quantificando conteúdo de DNA usando ensaio de citometria de fluxo.

Análises de apoptose de NPs HA-Gd₂O₃. a Níveis de apoptose de células HepG-2 a 24 h após tratamento de radiação de raios X. b Análise quantitativa correspondente.

Conclusões

Em conclusão, desenvolvemos NPs HA-Gd₂O₃ bifuncionais para imagem RM eficaz e radiossensibilização de tumores em processo hidrotérmico one-pot. Após revestimento com HA, as NPs HA-Gd₂O₃ sintetizadas exibiram dispersibilidade favorável em água, excelente biocompatibilidade. As NPs HA-Gd₂O₃ resultantes encapsulando átomos de Gd não apenas exibiram efetivamente alta relaxividade longitudinal (r₁) para RM como agente de contraste T₁, mas também aumentaram radiossensibilidade de tumores induzindo apoptose celular e bloqueando ciclo celular como radiossensibilizador. Assim, as novas NPs HA-Gd₂O₃ mostram potencial promissor para diagnóstico e radioterapia de tumores.

Materiais e Métodos

Materiais

Diacetato de fluoresceína (FDA) e iodeto de propídio (PI) foram adquiridos da Sigma (Nova York, NY, EUA). GdCl₃·6H₂O, glicol etileno (99%) foram comprados da Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (Lianyungang, Jiangsu, República Popular da China). O Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8) foi comprado da Dojindo (Kumamoto, Japão). NaH₂PO₄, Na₂HPO₄ e H₂SO₄ foram obtidos do Instituto de Pesquisa Química Fina Guangfu (Nankai, Tianjin, República Popular da China). Soro fetal bovino e meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) foram comprados da Invitrogen China Limited (Xangai, República Popular da China). Todos os produtos químicos eram de grau analítico e foram utilizados sem purificação adicional.

Síntese de NPs HA-Gd₂O₃

NPs HA-Gd₂O₃ foram preparadas usando abordagem hidrotérmica one-pot como segue: Primeiro, 0,1 g de HA foi dissolvido em 20 mL de água sob agitação vigorosa a temperatura ambiente durante a noite. Subsequentemente, 0,1 g de GdCl₃·6H₂O e 0,5 mL de NaOH (1 M) foram adicionados, respectivamente. Então, a mistura foi agitada por mais 5 min para formar uma solução clara homogênea e transferida para um autoclave de 50 mL, selada e tratada hidrotermicamente a 120 °C por 6 h. Após resfriamento natural à temperatura ambiente, a suspensão transparente foi filtrada com membrana de 0,22 μm para remover qualquer aglomeração de grande tamanho. A solução preparada foi então dialisada contra água por 3 dias em bolsa de diálise com corte de peso molecular de 14 kDa. A solução de diálise foi coletada e liofilizada usando secador a vácuo. Os pós de NPs HA-Gd₂O₃ assim obtidos foram guardados para caracterização adicional.

Instrumentação e Caracterizações

As morfologias das NPs HA-Gd₂O₃ foram examinadas por microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução em microscópio JEM-2100 (JEOL, Tóquio, Japão) sob tensão de aceleração de 200 kV. A composição elemental de NPs HA-Gd₂O₃ foi determinada por medições XPS em espectrômetro de fotoelétrons MK II, usando Al-Ka (1486,6 eV) como fonte de raios X e espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, EUA). A estrutura cristalina das NPs HA-Gd₂O₃ foi caracterizada via padrões de difração de raios X (XRD) em difratômetro Rigaku-D/MAX2500 (Rigaku, Japão) equipado com Cu Kα (λ = 0,15405 nm) radiação a velocidade de varredura de 4°/min na faixa de 5 a 80°.

Ensaio de Viabilidade Celular

A influência de NPs HA-Gd₂O₃ na viabilidade celular foi estudada via ensaio Kit de Contagem Celular CCK-8 (ensaio CCK-8). Células HepG2 (hepatocarcinoma humano, Número ATCC: HB-8065) e VSMCs (células musculares lisas vasculares) foram semeadas em placa de 96 poços a densidade de 3 × 10³ células/poço e cultivadas a 37 °C em incubadora 5% CO₂ por 24 h, então usando DMEM contendo diferentes concentrações de NPs HA-Gd₂O₃ (0 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL e 200 μg/mL) substituindo o meio de crescimento. Após incubação por mais 4 h, adicionando 10 μL de solução CCK-8 a cada poço, células foram incubadas por 4 h em local escuro. A absorbância foi medida a 490 nm usando Leitor Multimodo Microplaca Synergy HT (Bio Tek, Winooski, VT, EUA). Células não tratadas (em DMEM) foram usadas como controle, e a viabilidade celular relativa (média DP, n = 5) foi expressa como Abssample/Abscontrol × 100%.

Ensaio de Hemólise

Brevemente, 19-21 g, idades de 6 semanas fêmeas camundongos BALB/c foram gentilmente preparados pelas Regras de Gestão Animal do Ministério da Saúde da República Popular da China. Três mililitros de sangue estabilizado com heparina sódica foi obtido da remoção de globos oculares. Então, foi centrifugado para remover o sobrenadante com 1200 rpm, 15 min de acordo com a literatura. Após isso, lavando o sedimento com PBS por cinco vezes para obter hemácias de camundongo (MRBCs), então tomando cerca de 3 mL de sangue pela remoção do globo ocular, estabilizado com heparina sódica, centrifugado (1.200 rpm, 15 min) para remover o sobrenadante de acordo com a literatura [27], lavado com PBS por cinco vezes para obter hemácias de camundongo (MRBCs). Diluindo dez vezes com PBS, 0,1 mL MRBCs foram transferidos para tubos de 1,5 mL pré-preenchidos com 0,9 mL PBS contendo diferentes concentrações de partículas (50-200 μg/mL) de NPs HA-Gd₂O₃, 0,9 mL água (como controle positivo) e 0,9 mL PBS (como controle negativo), respectivamente. A mistura foi incubada por 2 h a temperatura ambiente após agitação suave, então centrifugada a 12.000 rpm por 1 min. Finalmente, fotografias de todas as amostras foram tiradas e a absorbância do sobrenadante (hemoglobina) foi medida por espectrofotômetro UV-2450 UV–Vis. As porcentagens de hemólise de diferentes amostras foram calculadas dividindo a diferença de absorbância entre a amostra, o controle positivo e negativo a 541 nm.

Estudo de Phantom RM In Vitro e In Vivo

Imagens RM in vitro e in vivo foram adquiridas em scanner RM 3 Tesla (Magnetom Trio Tim, Siemens, Alemanha). Para estudar imagens phantom T₁ in vitro, a solução de NPs HA-Gd₂O₃ com diferentes concentrações variando de 0 a 16 mM foi adicionada a uma placa de cultura de 96 poços, usando Magnevist (agente de contraste RM comercial, Gd-DTPA) como controle. Para imagem RM in vivo, escolhemos camundongos BALB/c normais como modelo (n = 4). Experimentos com animais estritamente conformaram às Regras de Gestão Animal do Ministério da Saúde da República Popular da China. Dez miligramas por quilograma de NPs HA-Gd₂O₃ filtrados através de filtros de membrana esterilizados (tamanho de poro 0,22 μm) foram injetados intravenosamente nos animais, então imediatamente investigados com scanner RM. Estas amostras para imagem RM in vitro e animais in vivo foram imageadas com os seguintes parâmetros: TR/TE = 300/10 ms, matrizes 256 × 256, fatias = 5, espessura = 2 mm, médias = 2, FOV = 80 × 80.

Efeito de Radiossensibilização In Vitro

Ensaio CCK-8 foi usado para avaliar atividade radiossensibilizante de NPs HA-Gd₂O₃ in vitro. Células foram semeadas em cinco placas de 96 poços a densidade de 3 × 10³ células/poço, e cada placa foi tratada na mesma condição: cultivada a 37 °C em incubadora 5% CO₂ por 24 h, então usando DMEM contendo diferentes concentrações de NPs HA-Gd₂O₃ (0 μg/mL, 12,5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL e 200 μg/mL) substituindo o meio de crescimento. Após incubação por 4 h, cinco placas foram irradiadas em diferentes doses de raios X (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy e 9 Gy), 300 cGy/min, respectivamente. Após radiação, todas as placas foram incubadas por 4 h, então medindo a absorbância sob os mesmos parâmetros.

Ensaio de sobrevivência clonogênica também foi conduzido para estudar efeito de radiossensibilização in vitro. Células HepG2 foram semeadas em placas de seis poços a 4,0 × 10⁴ células/poço e permitidas crescer por 16 h. As células foram incubadas com NPs HA-Gd₂O₃ diluídas em meio de cultura celular por 6 h. As células foram então irradiadas a 6 Gy usando acelerador linear clínico (Oncor, Siemens, Alemanha) com irradiação de 6 MeV usando campo de radiação 10 cm × 10 cm a distância fonte-pele (SSD) de 100 cm para cobrir todas as células. Então, estas células irradiadas foram permitidas crescer por 14 dias, fixadas com 4% paraformaldeído a temperatura ambiente por 40 min, coradas com 1% violeta de cristal após lavagem das células.

Ensaio de Coloração Vivo-Morto e Citometria de Fluxo

Para estudar efeito de radiossensibilização de NPs HA-Gd₂O₃, células HepG2 foram semeadas em placas de seis poços a densidade de 4,0 × 10⁴ células/poço e permitidas crescer por 12 h e definidos seis grupos (controle, NPs HA-Gd₂O₃, radiação, radiação + 50 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃, radiação + 100 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃ e radiação + 200 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃). Quando células cresceram a 80% nas placas, o primeiro grupo não teve tratamento, o segundo grupo foi incubado com 100 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃ por 24 h, o terceiro grupo foi apenas irradiado, e o quarto ao sexto grupos foram irradiados e incubados com diferentes concentrações de NPs HA-Gd₂O₃ (50, 100 e 200 μg/mL) por 24 h, respectivamente. Após isso, tampão de trabalho FDA e PI foram adicionados para coloração celular. A fluorescência de células coradas foi observada sob microscópio de fluorescência (×20), e células vivas mostraram cor verde e mortas exibiram cor vermelha. Além disso, células por diferentes tratamentos foram lavadas três vezes com PBS, digeridas, coletadas e centrifugadas a velocidade de 2000 rpm por 5 min, então fixadas com 70% etanol a −20 °C durante a noite seguido por coloração PI. Fragmentação de DNA foi quantificada pela intensidade de fluorescência de PI em citômetro de fluxo (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), analisada por software (FLOWJO 7.6.2) para clarificar distribuição do ciclo celular.

Efeito de Radiossensibilização In Vivo

Fêmeas camundongos BALB/c com pesos corporais de 19-21 g e idades de 6 semanas foram obtidas do Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Yangzhou sob condições padrão. Experimentos com animais foram conformes às Regras de Gestão Animal do Ministério da Saúde da República Popular da China. Modelo de tumor subcutâneo foi estabelecido como seguintes procedimentos: Primeiro, 1 × 10⁶ células HepS foram inoculadas em camundongos intraperitonealmente, e o ascite foi coletado após 5 dias. Então, estes ascites foram injetados subcutaneamente. Quando os tamanhos de tumor atingiram aproximadamente 100 mm³, modelos de tumor subcutâneo foram estabelecidos e aplicados aos seguintes experimentos.

Oito camundongos portadores de tumores subcutâneos por grupo foram tratados com radiação a 3 Gy por fração a dose total de 9 Gy dentro de 7 dias. A radioterapia foi conduzida após 3 h injeção intravenosa de NPs HA-Gd₂O₃ (10 mg/Kg), em acelerador linear clínico Siemens Primus (6 MeV) usando dispositivo auto-fabricado para cobrir todo o tumor. Estes camundongos foram anestesiados por 1% pentobarbital (50 mg/kg) para assegurar imobilidade durante irradiação. O volume foi medido e registrado todo dia, determinado a partir de medição de paquímetro e calculado pela fórmula: V = 0,5 × a × b², onde V (mm³) é o volume do tumor, e a (mm) e b (mm) são o comprimento e largura do tumor, respectivamente. Volumes relativos de tumor foram normalizados aos seus tamanhos iniciais. Cada grupo foi conduzido em oito camundongos, onde análise estatística foi realizada usando teste t bilateral de Student (*p < 0,05, **p < 0,001).

Disponibilidade de Dados e Materiais

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