Nanobastões de ouro modificados com sílica conjugada com anticorpo para o diagnóstico e terapia fototérmica de Cryptococcus neoformans:um experimento in vitro

Resumo

Histórico

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada. Ainda existem poucas soluções rápidas e eficazes para o diagnóstico ou tratamento de C. neoformans infecção em um estágio inicial clínico. Nanobastões de ouro modificados com sílica conjugados com anticorpos (GNR-SiO ₂ -Ab) pode conjugar C. neoformans seletivamente. Pode ser uma possibilidade para o tratamento da criptococose com segurança e eficácia.

Métodos

Nanobastões de ouro (GNRs) foram sintetizados de acordo com o protocolo assistido por modelo mediado por sementes. Anti- C. neoformans o anticorpo foi covalentemente ancorado na superfície de GNRs com agente de acoplamento de silano. Imagens de tomografia computadorizada in vitro foram realizadas para explorar o efeito diagnóstico do GNR-SiO ₂ -Ab. A viabilidade das células foi avaliada para confirmar o efeito da fototerapia térmica do GNR-SiO ₂ -Ab combinado com luz laser infravermelho próximo (NIR).

Resultados

GNR-SiO ₂ -Ab tem uma aplicação potencial como um agente de contraste positivo para imagens de raios-X / TC. Um anticorpo pode induzir uma agregação muito maior de GNRs ligando-se à superfície de C. neoformans células resultando em valores de atenuação muito mais altos do que nunca. Após a irradiação, C. neoformans as células sofreram danos fototérmicos e a estrutura normal das células foi destruída. A viabilidade das células reduziu significativamente em comparação com as células não tratadas.

Conclusões

Nosso trabalho confirmou que os nanobastões de ouro modificados com sílica conjugados com anticorpos poderiam aumentar a atenuação de raios-X de C. neoformans células em imagens de TC. E GNRs imunes, que eram mediados por anticorpos, poderiam aumentar os efeitos da fototerapia induzida por NIR em C. neoformans células.

Histórico

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, que foi descrita pela primeira vez por Busse em 1894 [1]. Infecção com a levedura encapsulada Cryptococcus neoformans pode resultar na colonização inofensiva das vias aéreas, mas também pode levar à meningite ou doença disseminada [2], especialmente em pessoas com imunidade mediada por células defeituosa. A criptococose representa uma importante infecção fúngica com risco de vida em pacientes com infecção por HIV grave e também pode complicar o transplante de órgãos, malignidade reticuloendotelial, tratamento com corticosteroides ou sarcoidose [3]. A meningite criptocócica associada à infecção pelo HIV é responsável por mais de 600.000 mortes por ano em todo o mundo [4]. A meningite criptocócica e a doença disseminada eram invariavelmente fatais. Em 1995, Speed ​​e Dunt relataram uma taxa de mortalidade de 14% entre pacientes com doença criptocócica que foram tratados com anfotericina B mais flucitosina [5]. A investigação em pacientes com suspeita de criptococose dependeu da cultura do fungo. No entanto, ainda existem poucas soluções rápidas e eficazes para o diagnóstico ou tratamento de C. neoformans infecção em um estágio inicial. Além disso, a maioria dos pacientes com infecções criptocócicas não recebe os tratamentos imediatos, resultando em uma alta taxa de mortalidade.

Dentre todas as técnicas de imagem, a tomografia computadorizada de raios-X (TC) é uma das ferramentas diagnósticas mais úteis em hospitais em termos de disponibilidade, eficiência e custo [6]. A TC é capaz de identificar padrões anatômicos e fornecer informações anatômicas complementares, incluindo localização, tamanho e disseminação do tumor no contraste endógeno [7]. Uma manifestação comum da criptococose pulmonar é a presença de nódulos ou massas pulmonares solitários ou múltiplos, cavitação ou anormalidades do parênquima. Essas manifestações são claramente detectadas por imagens de tomografia computadorizada (TC) [8]. Usando imagens radiográficas, as seguintes características de meningite criptocócica são tipicamente apresentados:espaços de Virchow-Robin dilatados, realce meníngeo, fissura coróide proeminente e cistos parahipocampais [9]. No entanto, a criptococose precoce não pode ser detectada com imagens radiológicas. Ou seja, não podemos realizar um tratamento imediato em um estágio inicial. Recentemente, os avanços no controle da forma / morfologia da superfície de nanomateriais de ouro demonstraram a grande capacidade de projetar sua ressonância plasmônica de superfície localizada [10, 11]. Aqui, nós investigamos um tipo de material de ouro em nanoescala denominado nanobastões de ouro (GNRs), que pode formar conjunção seletiva com os fungos. Em imagens clínicas de TC, os compostos iodados são o meio de contraste mais comumente usado. No entanto, o número atômico e a densidade eletrônica do ouro são muito maiores do que os do iodo. O ouro pode induzir uma forte atenuação de raios-X, o que o torna um candidato ideal para agentes de contraste de TC [7]. Conjugando GNRs com anticorpos específicos, os cientistas têm como alvo e capturam imagens de tecidos e patógenos específicos [12].

A anfotericina B é um importante agente terapêutico para o tratamento da doença criptocócica, implantada desde o final dos anos 1960 [13]. No entanto, a eficácia clínica da anfotericina B é limitada e exibe nefrotoxicidade significativa [14]. A eficácia dos medicamentos atuais é comprometida pela toxicidade, resistência aos medicamentos ou uma gama inadequada de atividades [15, 16]. Portanto, novos métodos terapêuticos seletivos para doenças criptocócicas precisam ser concebidos. Recentemente, os tratamentos fototérmicos são amplamente usados ​​para atingir e destruir células cancerosas, vírus e bactérias [17,18,19]. Em comparação com os regimes terapêuticos tradicionais, o mecanismo de tais agentes terapêuticos é completamente diferente. A luz de laser infravermelho próximo (NIR) é um método de tratamento fototérmico ideal, que pode ser absorvido especificamente por tecidos ou materiais. A luz pode penetrar efetivamente através dos tecidos, acompanhando danos mínimos aos tecidos normais [20]. GNRs absorvem luz na região NIR (650–900 nm), e a energia luminosa absorvida pode ser convertida em energia térmica. Com base neste princípio, é um método ideal para combinar luz laser NIR com GNRs para tratamento. Comparados aos fotossensibilizadores clássicos, os GNRs têm várias características vantajosas:seção transversal de alta absorção, alta solubilidade, excelente compatibilidade biológica, hipotoxicidade, grande estabilidade à luz e fácil conjugação com moléculas alvo [21]. Vários relatórios descreveram como os GNRs podem ser usados ​​para tratamentos fototérmicos [22,23,24]. Carpin conduziu um experimento em células de câncer de mama, que superexpressaram o gene HER2 e foram incubadas com nanoconchas de sílica-ouro conjugadas com anti-HER2. Posteriormente, os complexos foram irradiados por radiação NIR de 808 nm. Comparado ao grupo controle, as células foram destruídas [17]. Wang relatou que GNRs conjugados com anticorpos podem selecionar o alvo e destruir Salmonella patogênica bactérias quando expostas à radiação NIR. Houve uma redução altamente significativa em Salmonella viabilidade celular [19].

Aqui, usamos nanobastões de ouro modificados com sílica conjugados com anticorpo para ligar especificamente C. neoformans células. Além disso, as células que se ligam aos complexos podem ser facilmente distinguidas em imagens de TC. Essas nanopartículas de ouro foram associadas a C. neoformans células por conjugação imune e lise fototérmica causaram uma redução significativa na viabilidade celular. Nosso estudo confirmou uma nova opção para o diagnóstico e terapia fototérmica de C. neoformans in vitro e oferece a possibilidade de tratamento da criptococose com segurança e eficácia.

Métodos

Materiais

Anti- C. neoformans o anticorpo foi adquirido na Meridian Life Science (Memphis, TN, EUA). Ácido cloroáurico (HAuCl ₄ · 3H ₂ O) foi obtido na Sigma (St. Louis, MO, EUA). Nitrato de prata (AgNO ₃ ), tetraetilortosilicato (TEOS), 3-aminopropiltrimetoxissilano (APTS), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), boro-hidreto de sódio (NaBH ₄ ), 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC), poli (4-estirenossulfonato de sódio) (PSS) e ácido ascórbico foram obtidos de J &K Chemical Limited (China). Todos os produtos químicos acima foram usados ​​sem qualquer purificação adicional. Água desionizada (grau Millipore Milli-Q) com uma resistividade de 18,2 MΩ cm foi usada em todas as preparações.

Síntese de nanobastões de ouro modificados com sílica conjugada por anticorpo

Em um experimento típico, GNRs foram sintetizados de acordo com o protocolo assistido por modelo mediado por sementes [25,26,27]. Via sintética para fazer os nanobastões de ouro modificados com sílica conjugada com anticorpo (GNR-SiO ₂ -Ab) é ilustrado na Fig. 1. Vinte e cinco mililitros da solução GNR foram centrifugados a 12000 rpm durante 15 min. O sobrenadante, contendo principalmente moléculas de CTAB, foi removido e o precipitado foi ressuspenso em 20 mL de etanol anidro ajustado para pH 10 com 20 μL de amônia 28%. Depois que o sistema foi sonicado, TEOS de 5 mL (10 mM) foi adicionado e, em seguida, todo o sistema foi agitado vigorosamente por 24 h. GNRs revestidos de sílica foram coletados por centrifugação a 4000 rpm por 30 min e foram lavados três vezes com água e duas vezes com etanol. O GNR-SiO purificado obtido ₂ as amostras foram redispersas em 10 mL de etanol para experimentos adicionais [28]. Subsequentemente, 10 mL de APTS foram adicionados para formar uma solução mista e deixados reagir sob refluxo a 60 ° C por 1 h. O resultante foi lavado com água desionizada por cinco vezes e seco a 60 ° C por 3 h em um forno a vácuo para obter o GNR-SiO ₂ -NH ₂ . O resultante foi ainda revestido com um polímero (PSS) por uma técnica de camada por camada que fornece grupos amina acessíveis ao solvente [29]. Esses nanobastões terminados em amina foram autorizados a reagir com o ácido carboxílico de anticorpos purificados por 12-16 h na presença de EDC, uma carbodiimida solúvel em água que promove a formação de ligação amida entre o ácido carboxílico e a amina primária [30]. Após a incubação, os complexos nanorod-anticorpo foram purificados por centrifugação e ressuspensos em PBS [31].

Procedimento sintético de GNR-SiO ₂ -Ab

Caracterização de GNR-SiO ₂ -Ab

O tamanho e a morfologia de GNR e GNR-SiO ₂ -Ab foram caracterizados usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM; Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, EUA), operando a uma tensão de aceleração de 120 kV [20]. Os espectros de UV-vis foram medidos a 20 ° C com um espectrofotômetro de UV-visível (Shimadzu UV-2450, Shimadzu, Japão) equipado com uma célula de quartzo de 10 mm, onde o comprimento do caminho da luz era de 1 cm. O comprimento de onda de 200 a 1000 nm foi verificado, uma vez que inclui os picos de absorbância dos GNRs, anti- C. neoformans anticorpo e GNR-SiO ₂ -Ab. O GNR-SiO ₂ -Ab foi incubado a 4 ° C durante 2 e 4 semanas. O comprimento de onda de 200 a 1000 nm foi varrido nos dois pontos de tempo.

Unidades Hounsfield do GNR-SiO ₂ -Ab Medição

A solução aquosa de GNR-SiO ₂ -Ab com concentração diferente na faixa de 0,04–4 mg / mL foi detectado diretamente usando um tomógrafo Philips Brilliance 64 (Philips Healthcare, Best, Holanda). Os valores de atenuação foram obtidos no software de imagem de TC.

Anexo de C. neoformans para GNR-SiO ₂ -Ab

C.neoformans a estirpe H99 do tipo A foi obtida do Shanghai Key Laboratory of Molecular Medical Mycology (Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, China). Os fungos foram permitidos a incubar com os GNRs e complexos de anticorpo-nanorod por 1 h antes da preparação para a análise de TEM. As imagens foram coletadas em um instrumento TEM (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, EUA) operando em uma tensão de aceleração de 120 kV.

Tomografia computadorizada in vitro de complexos fungo-anticorpo-nanorode

Os materiais e fungos foram divididos em três grupos, que incluem grupo de fungos (N), GPR-SiO ₂ Grupo -Ab (G) e GPR-SiO ₂ -Ab-anexado C. neoformans grupo (G + N). A concentração de GNR-SiO ₂ A solução aquosa -Ab acima era de 4 mg / mL. Para imagens de TC in vitro, as soluções dos três grupos foram preparadas em tubos Ep estéreis de 1,5 mL. Todas as varreduras de TC foram realizadas usando o sistema de TC acima.

Efeitos da fototerapia térmica in vitro

C. neoformans células incubadas com e sem GNR-SiO ₂ -Ab foram expostos à irradiação de laser NIR (LWIRL 808, Laserwave Ltd., China) por 5 min, com um comprimento de onda de 808 nm e uma intensidade de 30 mW (4 W / cm ² ) As imagens foram coletadas em um instrumento TEM (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, EUA) operando em uma tensão de aceleração de 120 kV. Após a irradiação, as células foram incubadas por 2 h a 37 ° C no escuro. C. neoformans células incubadas com e sem GNR-SiO ₂ -Ab foram concebidos como grupos de controle. A viabilidade celular foi determinada realizando o ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante [28]. Este ensaio de viabilidade celular particular era um método homogêneo, que poderia determinar o número de células viáveis. A reação catalisada por luciferase entre luciferina e ATP foi usada para a síntese de células metabolicamente ativas. Todos os experimentos foram repetidos seis vezes, e seus valores médios foram determinados.

Análise estatística

Todas as análises foram realizadas no SPSS versão 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). Os dados são expressos como média ± DP. P valor inferior a 0,05 foi considerado para indicar significância estatística. Todos os números mostrados neste artigo foram obtidos de mais de três experimentos independentes com resultados semelhantes.

Resultados

Síntese e caracterização de GNR-SiO ₂ -Ab

Um método para GNRs revestidos de sílica com TEOS como fonte de sílica e APTS como agente de acoplamento foi relatado anteriormente [30]. A forma ou tamanho dos GPRs não mudou quando eles foram conjugados com anti- C. neoformans . A Figura 2 mostra a imagem TEM de GNR-SiO ₂ -Ab. Essas nanopartículas têm 18,48 ± 2,39 nm de largura e 57,56 ± 4,57 nm de comprimento.

a , b Imagem TEM de GNR-SiO ₂ -Ab. Os nanobastões apresentaram aparência de bastonete. A forma ou tamanho dos GPRs não mudou quando eles foram conjugados com anti- C. neoformans

Propriedade espectroscópica e estabilidade do GNR-SiO ₂ -Ab

Com relação à propriedade fotofísica do GNR-SiO ₂ -Ab, Fig. 3 mostra os espectros de absorbância de GNR-SiO ₂ , GNR-SiO ₂ -Ab e anti- C. neoformans anticorpo. O espectro de GNR-SiO ₂ mostra que GNR-SiO ₂ tem duas bandas de absorção, um comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície transversal fraca (TSPRW) em torno de 520 nm e um comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície longitudinal forte (LSPRW) em torno de 808 nm. Depois de ser conjugado com anticorpos, o TSPRW e LSPRW de GNR-SiO ₂ -Ab são 540 e 835 nm, respectivamente. Em uma comparação entre o espectro do anticorpo e GNR-SiO2-Ab, ambos têm o mesmo pico especial em torno de 280 nm. Este resultado prova que o anti- C. neoformans o anticorpo foi conjugado com sucesso com GNR-SiO ₂ . Após incubar a 4 ° C por 2 semanas, o TSPRW e LSPRW de GNR-SiO ₂ -Ab são 540 e 835 nm, respectivamente. E os mesmos dados foram observados em 4 semanas. O TSPRW e LSPRW de GNR-SiO ₂ -Ab não mudou após incubação por 4 semanas. Ele confirmou a estabilidade do GNR-SiO ₂ -Ab.

Espectros de absorção de:GNR + SiO ₂ + Ab (A), GNR + SiO ₂ (B), e anti- C. neoformans anticorpo (C). O GNR-SiO ₂ tem duas bandas de absorção, um comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície transversal fraca (TSPRW) em torno de 520 nm e um comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície longitudinal forte (LSPRW) em torno de 808 nm. Depois de ser conjugado com anticorpos, o TSPRW e LSPRW de GNR-SiO ₂ -Ab são 540 e 835 nm, respectivamente

Unidades Hounsfield do GNR-SiO ₂ -Ab Medição

As unidades Hounsfield (Hu) de GNR-SiO ₂ -Ab conforme avaliado por uma TC clínica. A Figura 4 exibe as imagens de TC na faixa de 0,04–4 mg / mL de GNR-SiO ₂ -Ab. Como a concentração de GNR-SiO ₂ -Ab aumentado, a intensidade do sinal CT aumentou continuamente. Conforme mostrado na Fig. 3, Hu como uma função de GNR-SiO ₂ -A concentração de AB mostra uma relação linear bem correlacionada ( R ² =0,9903), descrito pela seguinte equação típica: y =12,52 x + 11.971. Estes resultados sugerem que GNR-SiO ₂ -Ab tem uma aplicação potencial como um agente de contraste positivo para imagens de raios-X / TC.

Unidades Hounsfield do GNR-SiO ₂ -Ab. a Imagens in vitro de CT de GNR-SiO ₂ -Ab suspenso em PBS. A concentração (mg / mL) em cada amostra é fornecida no topo da respectiva imagem. b Gráfico de atenuação de CT de GNR-SiO ₂ -Ab em várias concentrações na faixa de 0,04 a 4 mg / mL

Anexo de C. neoformans Células para GNR-SiO ₂ -Ab

Imagens TEM mostram a característica morfológica de C. neoformans células e complexos fungo-anticorpo-nanorod. Essas células têm um diâmetro que varia de 2 a 20 μm. A Figura 5a exibe a imagem TEM de C. neoformans células, que é rodeado por uma cápsula de polissacarídeo. Essas células tinham de 4 a 6 μm de diâmetro, sem se ligar a nenhuma estrutura. Conforme mostrado na Fig. 5b, o C. neoformans as células são cobertas por lotes de GNR-SiO ₂ agregados -Ab, após incubação com os complexos anticorpo-nanobastão. Incubamos as células do fungo com GNR-SiO ₂ para explorar se GNR-SiO ₂ foi anexado a C. neoformans. Nossos resultados indicaram que GNR-SiO ₂ foram espalhados como mostrado na Fig. 5c. Nosso estudo mostra que C. neoformans as células podem se conjugar com GNR-SiO ₂ -Ab seletivamente.

Imagens TEM ilustram a interação entre GNR-SiO ₂ -Ab e C. neoformans células. a Imagem TEM de C. neoformans células. b Imagem TEM de complexos fungo-anticorpo-nanorod. c Imagem TEM de C. neoformans células incubadas com GNR-SiO ₂

Tomografia computadorizada in vitro de complexos fungo-anticorpo-nanorode

Realizamos uma análise quantitativa da intensidade do sinal de CT por meio do programa de exibição padrão do fabricante (portal Philips, Philips Healthcare, Best, Holanda). A Figura 6 mostra os valores de atenuação de raios-X dos três grupos. Os valores do grupo G + N foram significativamente maiores do que os dos grupos G e N. Além disso, os valores de atenuação de raios-X do grupo G foram significativamente maiores do que os do grupo N. Este resultado está de acordo com os achados da literatura anterior [31].

a , b Tomografia computadorizada in vitro de diferentes grupos. Os valores do grupo G + N foram significativamente maiores do que os dos grupos G e N. Além disso, os valores de atenuação de raios-X do grupo G foram significativamente maiores do que os do grupo N

Efeitos in vitro da fototerapia térmica

Avaliamos a viabilidade celular realizando um ensaio de viabilidade celular em um instrumento luminescente CellTiter-Glo®. As células sem irradiação tiveram maior viabilidade do que as células irradiadas com NIR ( P <0,05). Além disso, a viabilidade dos fungos foi maior do que as células em conjunção com GNR-SiO ₂ -Ab após irradiação NIR ( P <0,05). Além disso, as células tiveram maior viabilidade do que os complexos fungo-anticorpo-nanorod ( P <0,05). A Figura 7 ilustra claramente a variação na viabilidade de C. neoformans células com diferentes tratamentos. Após a irradiação, C. neoformans as células sofreram danos fototérmicos e a estrutura normal das células foi destruída. Conforme mostrado na Fig. 8, as células apresentaram aparência atrófica, irregular e colapsada. A cápsula de polissacarídeo característica estava danificada.

Viabilidade de células que foram tratadas de forma diferente. As células sem irradiação tiveram maior viabilidade do que as células irradiadas com NIR ( P <0,05). Além disso, a viabilidade dos fungos foi maior do que a das células em conjunção com GNR-SiO ₂ -Ab após irradiação NIR ( P <0,05). Além disso, as células tiveram maior viabilidade do que os complexos fungo-anticorpo-nanorod ( P <0,05)

a , b Imagens TEM demonstram danos fototérmicos de C. neoformans células que foram conjuntamente com GNR-SiO ₂ -Ab. As células exibiam aparência atrófica, irregular e colapsada. A cápsula de polissacarídeo característica foi danificada

Discussão

A sílica tem muitas vantagens sobre o polímero [32]. Os processos preparativos envolvidos são bastante fáceis, e a espessura de uma casca de sílica pode ser ajustada para o tamanho e porosidade desejados. Além disso, a sílica é extremamente estável e tem biocompatibilidade, não tem inchaço ou alterações de porosidade com a mudança do pH e não é vulnerável ao ataque microbiano. Além disso, a sílica tem facilidade de modificação de superfície com uma variedade de grupos funcionais usando a química do silano e reagentes de organossilício disponíveis comercialmente para biotargeting. Os GNRs revestidos de sílica retêm as propriedades ópticas superiores dos GNRs e podem melhorar sua estabilidade térmica sob irradiação de alta energia. Em nosso estudo, após ser revestido com sílica e conjugado com anti- C. neoformans anticorpo, GNRs exibiram um desvio para o vermelho no pico de ressonância plasmônica de superfície, devido ao aumento no índice de refração do meio circundante [32, 33]. Os resultados também indicaram que o tamanho da amostra torna-se cada vez maior após a modificação e conjugação. Esses dados indicam que conjugamos nanopartículas de ouro com um anti- C. neoformans anticorpo. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de que o GNR-SiO ₂ ferida possui algum poder especial para conjugar células após a ligação com os anticorpos, e faremos um estudo mais aprofundado no futuro. Neste estudo, anexamos com sucesso GNR-SiO ₂ -Ab para a cápsula celular através de uma simples reação antígeno-anticorpo. Além disso, garantimos com sucesso que nossos complexos visassem antígenos na cápsula celular.

GNRs ganharam ampla atenção na última década. Hainfeld et al. [34] primeiramente relataram que GNRs podem ser usados ​​como um agente de contraste de raios-X. Os GNRs conferem várias vantagens sobre as moléculas iodadas, um agente de contraste condicional. Devido a um alto número atômico e densidade de elétrons, GNRs exibem um coeficiente de atenuação de raios-X relativamente alto. O número atômico e a densidade eletrônica do ouro (79 e 19,32 g / cm ³ , respectivamente) são mais elevados do que os de iodo (53 e 4,9 g / cm ³ ) [7]. O iodo como agente de contraste de raios-X tem muitos efeitos colaterais graves, como nefrotoxicidade e reações alérgicas graves. No entanto, os GNRs persistem no corpo por muito mais tempo do que os agentes de contraste iodo, o que significa que há tempo suficiente para observar as imagens. Além disso, GNRs podem ter como alvo células cancerosas, vírus e bactérias, por meio da funcionalização de superfície com uma variedade de moléculas, como peptídeos ou anticorpos. Reuveni et al. [31] mostraram que vários tipos diferentes de moléculas podem ser fixados na superfície de GNRs. Neste estudo, a intensidade do sinal de CT aumentou continuamente, junto com o aumento da concentração de GNR-SiO ₂ -Ab, resultando em imagens mais brilhantes. GNR-SiO ₂ -Ab exibiu potencial positivo significativo como agentes de contraste de imagens de raios-X / TC, bem como GNRs. A absorção de raios-X de nanobastões de ouro permaneceu inalterada, mesmo com a modificação da superfície. Esses dados indicam que as propriedades de atenuação de raios-X do GNR-SiO ₂ -Ab não mudou significativamente como resultado da modificação da superfície. Isso está de acordo com os achados relatados na literatura anterior [35,36,37]. A funcionalização de superfície é uma ferramenta poderosa que permite o direcionamento passivo ou ativo de GNRs para um local de interesse específico. Em nosso estudo, anexamos com sucesso GNR-SiO ₂ -Ab para as cápsulas de C. neoformans . Além disso, determinamos se essas partículas conjugadas com anticorpos poderiam ser usadas como nanossondas durante a realização de imagens de CT direcionadas de C. neoformans células in vitro. Observamos que as imagens de TC de C. neoformans as células dispersas em PBS pareceram bastante semelhantes às imagens derivadas de C. neoformans células dispersas em água. No entanto, é difícil distinguir as imagens de fungos de tecidos moles. Um anticorpo pode induzir uma agregação muito maior de GNRs ligando-se à superfície de C. neoformans células resultando em valores de atenuação muito mais altos do que nunca. Assim, podemos alcançar com sucesso a atenuação de raios-X distinguível de fungos. Com base em nossos resultados, a detecção de C. neoformans por imagens de TC pode ser alcançado e trazer novas oportunidades em diagnósticos.

GNRs têm sido amplamente empregados para terapia fototérmica de tumor [22, 38, 39]. Nosso estudo indica que GNR-SiO ₂ -Ab pode ser uma ferramenta seletiva para destruir C. neoformans células. Nossos resultados confirmaram que a membrana celular de C. neoformans as células sofreram destruição irreparável e grave após serem irradiadas por NIR. Além disso, a viabilidade das células reduziu significativamente em comparação com as células não tratadas. Esses resultados indicaram que a radiação NIR por si só causa a morte de C. neoformans células. No entanto, a viabilidade das células incubadas com GNR-SiO ₂ -Ab também estava deprimido. Em células incubadas com GNR-SiO ₂ -Ab e submetidas à irradiação NIR, a viabilidade das células reduziu significativamente em comparação aos outros grupos. Certificamo-nos de que o GNR-SiO ₂ -Ab conjugado com os fungos de forma seletiva e melhora os efeitos da radiação NIR. GNR-SiO ₂ -Ab tem a capacidade de efeitos seletivos da fototerapia sobre o C. neoformans células. O mecanismo de efeito não foi relatado antes. Especulamos que a ruptura na membrana celular foi provavelmente induzida pela morte celular induzida por irradiação. Norman et al. [18] relatou a viabilidade de Pseudomonas aeruginosa foi reduzido significativamente quando esta espécie foi exposta à irradiação e ligada com nanobastões de ouro, que foram covalentemente conjugados com anticorpos específicos. Essas células também mostraram áreas de membrana celular gravemente rompida com danos irreparáveis, que foram causados ​​pela exposição à radiação NIR. Quando as nanopartículas foram expostas à radiação NIR, a membrana celular foi danificada devido a vários fatores, incluindo explosão de nanopartículas, ondas de choque, formação de bolhas e desintegração térmica [40].

Neste estudo, a morte ou redução da atividade de C. neoformans células ocorreram quando a membrana celular foi desintegrada e destruída por energia térmica. No entanto, novos estudos devem ser realizados para confirmar essa hipótese. C. neoformans as células são danificadas pelos seguintes fatores:aumento localizado de temperatura, explosão de nanopartículas, ondas de choque, formação de bolhas e desintegração térmica causada pela radiação NIR. Em particular, C. neoformans as células foram substancialmente danificadas quando expostas apenas à radiação NIR. Existem duas razões possíveis para explicar como o GNR-SiO ₂ direcionado -Ab estimula a radiação NIR induzindo a destruição fototérmica de C. neoformans células. Uma possibilidade é que na cápsula de C. neoformans células, o GNR-SiO ₂ direcionado -Ab induz um aumento localizado da temperatura. A segunda possibilidade é que, devido a uma reação antígeno-anticorpo entre GNR-SiO ₂ -Ab e a cápsula de C. neoformans células, há mudanças estruturais na parede celular e na cápsula. Devido a tais mudanças, as células seriam mais sensíveis ao tratamento fototérmico [41]. Estudos anteriores confirmaram a baixa toxicidade dos nanobastões de ouro [22, 42, 43] e mais estudos serão necessários para investigar o efeito da fototerapia in vivo. O mais lamentável do nosso estudo é que não discutimos a capacidade de carregamento do GNR-SiO ₂ -Ab. Um estudo posterior se concentrará na relação entre a capacidade de carga do GNR-SiO ₂ -Ab e o efeito fototérmico.

Conclusões

We successfully fabricated GNR-SiO₂ -Ab, which was targeted towards C. neoformans células. These specific antibody-conjugated gold nanorods enhanced the X-ray attenuation of C. neoformans cells in CT images. Our results indicated that immune GNRs, which were mediated by antibodies, increased the effects of NIR-induced photo-thermal therapy in C. neoformans células. Furthermore, GNR-SiO₂ -Ab allowed easy manipulation and minimally invasive procedures in the diagnosis and treatment of C. neoformans infections, focusing on the potential clinical application of this approach.

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