Nanopartículas de Carbono Dopadas com Cério Sintetizadas de Forma Verde Entregam Escavação Superior de Radicais Hidroxila para Terapia Antioxidante

Resumo

Avanços recentes em nanomedicina destacaram nanopartículas de óxido de cério como poderosos antioxidantes. Apresentamos um método direto e ambientalmente benigno que usa albumina sérica bovina (BSA) para biomineralizar nanopartículas carbonáceas dopadas com cério (Ce-doped CNPs). As partículas resultantes são monodispersas, com média de 14,7 nm de diâmetro, e exibem abundantes grupos superficiais hidrofílicos que garantem dispersão de longo prazo em meios aquosos. Estudos de citotoxicidade in vitro (CCK-8) confirmam toxicidade celular negligenciável em ampla faixa de doses. Quando desafiadas com espécies reativas de oxigênio induzidas por peróxido de hidrogênio, Ce-doped CNPs exibem excepcional escavação de radicais hidroxila, protegendo células musculares lisas vasculares e células tumorais 7721 de dano oxidativo de maneira dose-dependente. Esses achados estabelecem Ce-doped CNPs como quelantes de ROS promissores, de baixa toxicidade, para tratamento de doenças relacionadas ao estresse oxidativo.

Introdução

Estresse oxidativo, definido como desequilíbrio entre produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e defesas antioxidantes, subjaz muitas doenças crônicas, incluindo aterosclerose, câncer e neurodegeneração. O radical hidroxila (•OH) altamente reativo é particularmente danoso, iniciando peroxidação lipídica, modificação de proteínas e quebras de fita de DNA que culminam em morte celular e lesão tecidual. Estratégias terapêuticas que reduzem níveis de ERO, especialmente •OH, são de grande interesse clínico.

Nanopartículas de óxido de cério (CeO₂ NPs) emergiram como nanoenzimas potentes devido ao ciclo redox reversível Ce³⁺/Ce⁴⁺. Isso permite imitar atividades de superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT), sequestrando •O₂⁻ e H₂O₂, respectivamente. No entanto, CeO₂ NPs convencionais frequentemente requerem revestimentos superficiais (ex: PVP) para alcançar estabilidade aquosa e biocompatibilidade, o que pode alterar suas propriedades intrínsecas. Nosso estudo contorna essa limitação incorporando íons de cério em uma estrutura carbonácea derivada de BSA, resultando em Ce-doped CNPs com hidrofilicidade intrínseca e robusto desempenho antioxidante.

Seção Experimental

Materiais e Reagentes

Albumina sérica bovina (BSA), diacetato de fluoresceína (FDA) e iodeto de propídio (PI) foram obtidos da Sigma (Nova York, EUA). Soro fetal bovino (FBS) e Meio Essencial Mínimo de Dulbecco (DMEM) da Invitrogen China Limited (Shanghai). Nitrato de cério hexaidratado (Ce(NO₃)₃·6H₂O), violeta de metila (MV), sulfato ferroso heptaidratado (FeSO₄·7H₂O) e H₂O₂ 30% foram comprados da Aladdin Reagent Corporation (Shanghai) e Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Pequim). Todos químicos eram grau analítico e usados sem purificação adicional; água desionizada foi empregada throughout.

Síntese de Nanopartículas Carbonáceas Dopadas com Cério

Ce-doped CNPs foram preparados via rota de biomineralização adaptada da síntese templada por BSA relatada por Wang et al. Em resumo, 1,25 g de BSA foi dissolvido em 50 mL água desionizada sob agitação contínua para formar solução clara. Solução de Ce(NO₃)₃·6H₂O 300 mM foi então adicionada gota a gota mantendo agitação vigorosa. Simultaneamente, 2,0 M NaOH foi introduzido lentamente para elevar pH a 12. A mistura foi agitada a 55 °C por 8 h, resultando em suspensão marrom que resfriou à temperatura ambiente. O produto foi filtrado através de membrana PES 0,22 µm para remover agregados grandes, dialisado contra água (PMCO 14 kDa) por 3 dias, e liofilizado sob vácuo. O pó resultante foi armazenado para caracterização posterior.

Técnicas de Caracterização

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM, JEOL JEM-2100) forneceu dados morfológicos a 200 kV. Distribuições de tamanho de partícula foram calculadas com ImageJ (NIH). Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR, Nicolet Nexus 470) e espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS, PHI 5000) identificaram grupos funcionais superficiais e estados de oxidação. Difração de raios-X (XRD, Rigaku D/MAX-2000) confirmou fases cristalinas. Espectros de absorção UV-Vis (Shimadzu UV-2550) foram registrados para estudos em solução.

Ensaio Fotométrico UV-Vis de Escavação de Radicais

Ce-doped CNPs (10 µM) foram dispersos em 0,1 M Tris-HCl (pH 5,0) e sonicados para aumentar solubilidade. Mistura de reação contendo 3,0 × 10⁻⁵ M MV, 0,15 mM FeSO₄·7H₂O, 1,0 M H₂O₂, e suspensão de Ce-doped CNP (0,17 mM) foi preparada em volume 10 mL. Após 5 min à temperatura ambiente, absorbância a 582 nm foi medida para quantificar recuperação de MV, refletindo escavação de radical hidroxila.

Ensaio de Viabilidade Celular (CCK-8)

Células VSMC e 7721 (1,5 × 10⁴ células/poço) foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas até ~80% de confluência. Após 24 h, meios foram substituídos por DMEM contendo 0–400 µg/mL Ce-doped CNPs, e células incubadas por 24 h. Reagente CCK-8 (10 µL/poço) foi adicionado e incubado por 4 h. Absorbância a 490 nm foi lida em leitor de microplacas Synergy HT; viabilidade expressa como % de controle não tratado.

Modelo de Estresse Oxidativo Induzido por Peróxido de Hidrogênio

Para modelar lesão oxidativa, células VSMC e 7721 foram expostas a H₂O₂ 30% em concentrações de 50 µmol mL⁻¹ a 800 µmol mL⁻¹ por 4 h. Pós-tratamento, viabilidade celular foi avaliada por CCK-8 como descrito, permitindo determinação da DL₅₀ de H₂O₂ (≈560 µM).

Ensaios de Apoptose e Live-Dead

Células pré-tratadas com Ce-doped CNPs (0–400 µg/mL) foram subsequentemente desafiadas com 560 µM H₂O₂ por 4 h. Coloração live-dead (Calceína-AM/PI) foi realizada em células 7721 cultivadas em placas de 6 poços, e imagens de fluorescência capturadas sob microscópio confocal.

Análise de Citometria de Fluxo de Apoptose

Após exposição a H₂O₂, células 7721 foram colhidas, lavadas, e coradas com Annexin V-FITC e PI. Amostras analisadas em citômetro Beckman Coulter Epics XL MCL; porcentagens de apoptose precoce (Annexin V⁺/PI⁻) e tardia (Annexin V⁺/PI⁺) calculadas usando FlowJo 7.6.2.

Análise Estatística

Dados representam média ± SEM. ANOVA one-way seguido de teste post-hoc de Tukey foi aplicado; p < 0,05 considerado estatisticamente significativo.

Resultados e Discussão

Síntese e Morfologia de Nanopartículas

A estratégia de biomineralização produziu Ce-doped CNPs altamente monodispersos, como mostrado por TEM (Figura 1a). As partículas exibiram morfologia poligonal, não agregada, com diâmetro médio de 14,7 ± 0,8 nm (Figura 1b). A dispersão aquosa permaneceu clara por vários dias, indicando excelente estabilidade coloidal — vantagem chave para entrega biomédica.

Química de Superfície e Estado de Oxidação

Análise XPS confirmou coexistência de Ce³⁺ (≈15,99%) e Ce⁴⁺, sustentando a natureza redox-ativa das partículas (Figura 2b). O espectro C 1s (Figura 2c) revelou picos a 285,0, 287,8 e 288,9 eV, correspondentes a C–C, C=O e C–O, enquanto o espectro O 1s (Figura 2d) exibiu picos a 530,5 e 531,8 eV, indicativos de ligações Ce–O e hidroxilas superficiais. Espectros FT-IR (Figura 3A) exibiram alargamento de estiramento O–H a 3400 cm⁻¹ e picos relacionados a nitrato a 1510 e 1450 cm⁻¹, confirmando presença de grupos funcionais hidrofílicos e incorporação bem-sucedida de íons de cério.

Padrões XRD (Figura 3B) revelaram picos característicos de rede híbrida carbono-cério, com picos de carbono perto de 24,4° e reflexões de céria a 30,3°, 35,23° e 43,2°, confirmando integração bem-sucedida de Ce na estrutura de carbono.

Citotoxicidade In Vitro

Ensaios CCK-8 demonstraram que Ce-doped CNPs não comprometeram viabilidade celular em concentrações até 400 µg/mL (Figura 4a). Mesmo na dose mais alta, viabilidade permaneceu acima de 90%, ressaltando excelente biocompatibilidade das partículas.

Eficácia Antioxidante

Peróxido de hidrogênio a 560 µM foi identificado como DL₅₀ para ambas VSMC e 7721. Pré-tratamento com Ce-doped CNPs melhorou significativamente sobrevivência de maneira dose-dependente, com 400 µg/mL restaurando viabilidade a ~88% (Figura 4c). Coloração live-dead (Figura 5) mostrou redução marcante de células vermelhas (PI-positivas) com aumento de Ce-doped CNPs, confirmando proteção contra apoptose oxidativa. Citometria de fluxo (Figura 6) quantificou apoptose: H₂O₂ sozinho induziu 46,4% de apoptose tardia, que caiu para 24,2, 20,0, 15,1 e 11,2% com 50, 100, 200 e 400 µg/mL Ce-doped CNPs, respectivamente.

Conclusões

Desenvolvemos síntese verde, em uma etapa, de nanopartículas carbonáceas dopadas com cério que são altamente dispersíveis, biocompatíveis e exibem potente escavação de radical hidroxila. As partículas retêm ciclagem redox intrínseca Ce³⁺/Ce⁴⁺, permitindo imitar atividades SOD e CAT e proteger células vasculares e tumorais de lesão oxidativa induzida por H₂O₂. Sua eficácia antioxidante dose-dependente e citotoxicidade mínima posicionam Ce-doped CNPs como candidatos atraentes para prevenção e tratamento de patologias relacionadas a estresse oxidativo.

Abreviações

BSA

Albumina sérica bovina

Ce-doped CNPs

Nanopartículas carbonáceas dopadas com cério

CCK-8

Kit de contagem de células-8

FT-IR

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

NP

Nanopartícula

ROS

Espécies reativas de oxigênio

SOD

Superóxido dismutase

CAT

Catalase

TEM

Microscopia eletrônica de transmissão

XPS

Espectroscopia de fotoelétrons de raios-X

XRD

Difração de raios-X