Síntese de nanopartículas carbonáceas dopadas com cério inspirada na biomineralização para atividade de eliminação de radical hidroxila elevada

Resumo

Nanopartículas de óxido de cério recentemente têm recebido grande atenção em aplicações biomédicas devido ao seu excelente desempenho antioxidante. Neste estudo, uma abordagem simples, suave e verde foi desenvolvida para sintetizar nanopartículas carbonáceas dopadas com cério (CNPs dopadas com Ce) usando bio-mineralização de albumina de soro de touro (BSA) como precursor. Os CNPs dopados com Ce resultantes exibiram morfologia uniforme e ultra pequena com um tamanho médio de 14,7 nm. Os resultados de XPS e FTIR revelaram a presença de grupo hidrofílico na superfície dos CNPs dopados com Ce, o que resultou em excelente dispersão em água. O ensaio de CCK-8 demonstrou que CNPs dopados com Ce possuíam biocompatibilidade favorável e citotoxicidade insignificante. Usando H ₂ O ₂ As espécies reativas de oxigênio induzidas (ROS) como modelo, CNPs dopadas com Ce mostraram uma alta capacidade de eliminação de radicais hidroxila. Além disso, os resultados de citometria de fluxo e de coloração com vida morta indicaram que CNPs dopados com Ce protegeram as células de H ₂ O ₂ - dano induzido em um efeito dependente da dose, que forneceu uma evidência direta para o desempenho antioxidante. Esses achados sugerem que os CNPs dopados com Ce como novos necrófagos de ROS podem fornecer uma perspectiva terapêutica potencial no tratamento de doenças associadas ao estresse oxidativo.

Histórico

A inflamação contínua e desregulada é considerada uma etapa comum de vários processos patológicos [1]. O estresse oxidativo foi encontrado em muitas doenças clínicas onde ROS tem uma expressão muito maior do que a eliminação de enzimas antioxidantes [2,3,4], que finalmente é definido como um desequilíbrio entre os desempenhos oxidativo e antioxidante. Os ROS altamente reativos têm tendência a produzir radicais livres (incluindo superóxido (O ₂ ^- ), HO _2ˋ e hidroxil ( _ˋ OH)) que causam danos às macromoléculas do organismo, como proteínas e ácidos nucléicos, enquanto a superprodução de ROS faz uma diferença crítica no dano oxidativo sustentado, levando a destruições significativas de estruturas e funções celulares, como infiltrados inflamatórios [5,6 , 7], os danos às membranas celulares e ao DNA [8, 9], e até aumentando a morte celular. Assim, o estresse oxidativo desempenha um papel fundamental na patogênese de doenças macrovasculares [10,11,12], câncer e algumas outras doenças do sistema nervoso [13]. Conseqüentemente, é um problema importante e urgente controlar a concentração de radicais livres de oxigênio reativos em organismos vivos e mantê-los em uma faixa adequada, o que também é básico para diminuir uma série de anormalidades oxidativas.

Recentemente, nanopartículas de óxido de cério (CeO ₂ NPs) têm atraído grandes atenções devido às suas propriedades redox únicas que foram amplamente aplicadas em energia, catálise e campos biomédicos [14,15,16]. Especialmente, CeO ₂ nanopartículas exibiram enorme potencial como antioxidante ideal para tratar doenças relacionadas com ROS em aplicações biomédicas [17, 18]. A atividade antioxidante das nanopartículas de céria deriva de sua capacidade de eliminar os radicais livres, como o superóxido (• O ²⁻ ) e radicais hidroxila (• OH), e mantém o efeito antioxidante como uma enzima por um período sustentado [19]. Há evidências crescentes de que CeO ₂ nanopartículas geralmente têm uma estrutura cristalina do tipo fluorita, e os íons de cério possuem a capacidade de conversão reversível entre tervalência (3+) e quadrivalência (4+) [20]. A troca de Ce ³⁺ para Ce ⁴⁺ estados de oxidação podem eliminar O ₂ ^- via superóxido dismutase (SOD) -iméticos, e • OH via reações redox, enquanto o Ce ⁴⁺ para Ce ³⁺ switch remove H ₂ O ₂ via miméticos da catalase (CAT) [21]. No entanto, propriedades físicas e químicas do CeO ₂ NPs podem influenciar o comportamento biológico, incluindo sua biodistribuição, farmacocinética, toxicidade, dissolução e eliminação [22]. Dada a hipótese de que está bem estabelecido na química superficial de CNPs dopados com Ce, a utilização biológica de CNPs dopados com Ce como uma abordagem terapêutica ainda precisa ser amplamente explorada [23, 24].

Este estudo concentra-se no desenvolvimento de novas nanopartículas à base de cério (denominadas CNPs dopadas com Ce) com excelente biocompatibilidade usando rota sintética simples e verde e explora ainda mais sua viabilidade como agente antioxidante para aplicações biomédicas. Uma série de métodos foi empregada para caracterizar as propriedades físicas e químicas dos CNPs dopados com Ce. Encorajados pelos desempenhos favoráveis, verificamos ainda mais a biocompatibilidade dos CNPs dopados com Ce preparados e os usamos como reagentes antioxidantes para eliminar os radicais livres de oxigênio usando H ₂ O ₂ modelo induzido. Finalmente, o mecanismo antioxidante dos CNPs dopados com Ce foi revelado a partir da via de apoptose celular usando a coloração fluorescente viva-morta e citometria de fluxo. Este estudo irá fornecer um novo e eficiente eliminador de ROS para aliviar os danos do estresse oxidativo em condições patológicas.

Seção Experimental

Materiais e Reagentes

Albumina de soro bull (BSA), diacetato de fluoresceína (FDA) e iodeto de propídio (PI) foram adquiridos na Sigma (New York, NY, USA). O soro fetal bovino (FBS) e o meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) foram adquiridos da Invitrogen China Limited (Xangai, República Popular da China). Ce (NÃO ₃ ) ₃ · 6H ₂ O, violeta de metila (MV) e sulfato ferroso hepta-hidratado (FeSO ₄ ^. 7H ₂ O) foram adquiridos da Aladdin Reagent Corporation (Xangai, República Popular da China) e o peróxido de hidrogênio (30%) foi obtido da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Pequim, República Popular da China). Todos os produtos químicos eram de reagentes analíticos e foram utilizados sem purificação adicional. Água desionizada foi usada nos experimentos.

Síntese de nanopartículas de óxido de cério

Os CNPs dopados com Ce foram preparados aplicando uma ligeira modificação do método de bio-mineralização baseado em álbum, conforme descrito no documento [24]. O processo de síntese é ilustrado como segue:1,25 g BSA foi dissolvido em 50,0 mL de água desionizada e constantemente agitado para formar a solução transparente. Então, a solução do precursor de metal 300 mM Ce (NO ₃ ) ₃ · 6H ₂ O foram adicionados lentamente sob agitação vigorosa, respectivamente. Simultaneamente, NaOH 2,0 M foi dissolvido em 50 mL de água desionizada, que foi empregada para ajustar o valor de pH da mistura. A solução que inclui NaOH deve ser adicionada lentamente é digna de atenção. CNPs dopados com Ce podem ser formados após agitação energética a PH 12 a 55 ° C. Um tempo de reação suficiente para a formação de CNPs dopados com Ce foi de cerca de 8 h; o sistema era um composto de marrom, resfriando à temperatura ambiente naturalmente. A suspensão adicional foi filtrada com uma membrana de 0,22 μm (poliéter sulfona) para esgotar as aglomerações em grande escala. A primeira solução foi finalmente dialisada contra água por 3 dias em uma bolsa de diálise com um peso molecular de corte de 14 kDa. A solução de diálise recolhida foi liofilizada usando um liofilizador a vácuo. Os pós CNPs dopados com Ce foram finalmente obtidos e guardados para posterior caracterização.

Instrumentos e caracterização de nanopartículas de óxido de cério

Morfologias de CNPs dopados com Ce foram examinadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) em um microscópio JEM-2100 (JEOL, Tóquio, Japão) sob uma tensão de aceleração de 200 kV. A distribuição do tamanho foi estudada pelo software ImagingJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). As estruturas químicas dos CNPs dopados com Ce foram analisadas usando um espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) (Nicolet Nexus 470, GMI e Ramsey, MN, EUA). A composição elementar foi determinada por análise elementar realizada por meio de espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS). A análise de difração de raios-X (XRD) foi realizada em um difratômetro Rigaku D / MAX-2000 (Japão) operado a 40 kV e 100 mA, com uma fenda de 0,5 ° e uma velocidade de varredura de 7 ° min ⁻¹ , equipado com uma fonte de radiação Cu Kα (λ =0,15418 nm). Os espectros de absorbância de UV-Vis foram registrados usando um espectrofotômetro UV-2550 UV-Vis (Shimadzu, Kyoto, Japão).

Experimentos fotométricos UV-vis

O desempenho antioxidante do CNP dopado com Ce e a atividade de eliminação de radicais livres foram avaliados por experimentos fotométricos de UV-vis. As soluções de MV foram preparadas em água desionizada na concentração de 3,0 × 10 ⁻⁴ M. E FeSO 0,15 mM ₄ ^. 7H ₂ O foi dissolvido como uma alternativa. A solução suspensa de CNPs dopados com Ce foi reservada para uso em concentrações de 10 μM por dispersão em tampão Tris-HCl 0,1 M em pH 5,0. Apropriadamente, o processamento ultrassônico pode aumentar a solidez dos CNPs dopados com Ce. As soluções de reação para fotométrica abrangeram 3,0 × 10 ⁻⁵ M MV, 0,15 mM FeSO ₄ ^. 7H ₂ O, 1,0 M H ₂ O ₂ , Tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 5,0) e CNPs dopados com Ce 0,17 mM para atingir um volume necessário de 10 mL (solução de mistura de MV / FeSO ₄ ^. 7H ₂ O / H ₂ O ₂ / CeO ₂ ) no final. A absorbância da solução de reação pode ser medida após incubação por 5 min em temperatura ambiente.

Citotoxicidade de nanopartículas de óxido de cério

A viabilidade celular de CNPs dopados com Ce foi avaliada em células VSMC e 7721 pelo ensaio CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) com base no anel de tetrazólio clivado e a descida de sal de tetrazólio solúvel em água da quantidade de corante de formazan por desidrogenases em células vivas. Resumidamente, células VSMC e 7721 (1,5 × 10 ⁴ células por poço) foram semeadas em placas de 96 poços com cinco réplicas para cada grupo. Após incubação por 24 h a 37 ° C e 5% CO ₂ e a densidade celular atingiu 80% de confluência, o meio de crescimento foi substituído por DMEM fresco contendo diferentes concentrações (0, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 μg / ml) de solução de CNPs dopada com Ce e incubado por 24 h. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e 10 μL de solução de CCK-8 foram adicionados a cada poço. Em seguida, as placas de 96 poços foram incubadas por mais 4 h a 37 ° C e 5% de CO ₂ para permitir o crescimento exponencial das células. Finalmente, a absorbância de cada poço foi detectada no comprimento de onda de emissão de 490 nm usando o leitor de microplacas Synergy HT Multi-Mode (Bio-Tek, Winooski, VT, EUA). As células (em DMEM) sem tratamento foram usadas como controle, e a viabilidade celular relativa (média ± erro padrão da média) foi calculada usando amostra de Abs / controle de Abs × 100%.

Modelo de peróxido de hidrogênio no ensaio de viabilidade celular in vitro

Como um tipo de oxigênio ativo oxidativo potente, peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ ) é fácil de atravessar a membrana celular e reage com íons de ferro intracelulares para formar radicais livres altamente reativos pela teoria de Fenton, levando a uma cadeia de mudanças. Ao mesmo tempo, variedades de estresse oxidativo celular induzido por H ₂ O ₂ estão diretamente envolvidos no processo de apoptose. Portanto, 30% H ₂ O ₂ foi escolhido para simular a apoptose de células neste estudo, que também pode ser usado para ser um IC ₅₀ modelo para investigar melhor o efeito protetor dos CNPs dopados com Ce no dano oxidativo. Com base na discussão acima, as células VSMC e 7721 foram inicialmente semeadas a uma densidade de 1,5 × 10 ⁴ células / poço nas placas de 96 poços. Depois que as células aderiram, elas continuaram a ser cultivadas por mais 24 horas. E a preparação fresca 30% H ₂ O ₂ foi adicionado a cada poço com diferentes concentrações (50, 100, 200, 400, 800 umol / ml) para estimular o crescimento das células. Após uma eclosão de 4 h e uma lavagem subsequente com PBS, 10 μL de solução CCK-8 foram adicionados a cada poço por 4 h a 37 ° C em 5% de CO ₂ incubadora _. O leitor de microplaca Synergy HT Multi-Mode (Bio-Tek, Winooski, VT, EUA) foi empregado para determinar o valor absorvente de cada poço a 490 nm. A porcentagem de atividade das células foi considerada como o índice do efeito de na viabilidade celular, que dependia da medição da taxa de sobrevivência celular em relação ao controle.

Indução de apoptose e ensaio de viabilidade celular in vitro

Da mesma forma, células VSMC e 7721 foram semeadas nas placas de 96 poços e cultivadas. No dia seguinte, as células foram pré-tratadas com diferentes concentrações de CNPs dopados com Ce (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 e 400 μg / ml) por cerca de 24 he expostas à preparação fresca 30% H ₂ O ₂ com a concentração adequada para cada poço. Por outro lado, deve ser definido um grupo em branco sem 30% H ₂ O ₂ e CNPs dopados com Ce e o grupo de controle foi apenas com H ₂ O ₂ soluções. Cada grupo foi estabelecido seis paralelos. Após tratamento por 4 horas e uma lavagem subsequente com PBS, o ensaio CCK-8 foi usado para medir as condições apoptóticas de células de cada poço a uma densidade óptica de 490 nm como descrito acima.

Ensaio de coloração vivo-morto e citometria de fluxo

Para avaliar o potencial do efeito antioxidante dos CNPs dopados com Ce, 7721 células foram cultivadas em placas de seis poços com 4,0 × 10 ⁴ células em 100 µl de meio por poço e permitiu o desenvolvimento por 24 horas. Em seguida, seis grupos foram definidos para serem de contraste simultâneo; incluía o controle, H ₂ O ₂ grupo, 50μg / mL CNPs dopados com Ce + H ₂ O ₂ , 100μg / mL CNPs dopados com Ce + H ₂ O ₂ , 200μg / mL CNPs dopados com Ce + H ₂ O ₂ , e CNPs dopados com Ce 400μg / mL + H ₂ O ₂ . Enquanto as células cresceram até 80% em cada grupo, o primeiro grupo foi exposto a uma condição de crescimento normal sem H ₂ O ₂ e CNPs dopados com Ce; o segundo grupo foi incubado apenas com o H ₂ selecionado O ₂ sem CNPs dopados com Ce por 4 h, ou seja, nenhum tratamento; o terceiro grupo ao sexto grupo continha diferentes concentrações de CNPs dopados com Ce (50, 100, 200 e 400μg / mL) e H ₂ indicado O ₂ incubando por 4 h, respectivamente. Depois disso, o tampão de trabalho FDA e PI foi usado para a coloração de células (Calcein AM / Ethidium Homodimer, Invitrogen). A fluorescência das células coradas foi observada em um microscópio de fluorescência; as células vivas apresentam coloração verde e as mortas apresentam coloração vermelha.

Além disso, o kit de apoptose de anexina V-FITC / iodeto de propídio (PI) foi usado para quantificar a taxa de apoptose celular por coloração de fluorescência dupla. Resumidamente, as células 7721 foram pré-cultivadas em placas de cultura de seis poços de acordo com as etapas acima durante 24 h, até o crescimento aderente das células 7721. Em seguida, as células com diferentes doses de medidas de tratamento foram colhidas e lavadas três vezes com PBS a 4 ° C em cada grupo. Notou-se que as células deveriam ser digeridas, coletadas e centrifugadas suavemente, seguidas de 2.000 rpm por 5 min. Depois disso, as células foram ressuspensas com 500 μl de tampão de ligação e ajustadas a uma concentração de 1 × 10 ⁶ células / ml. Em seguida, a suspensão de células foi levada para um tubo de fluxo com coloração de 5 μl de Anexina V-FITC e 5 μl de 20 μg / ml de solução de PI, respectivamente. Antes da mistura incubar em temperatura ambiente por 15 min, 500 μl de PBS devem ser adicionados ao tubo de reação. Por fim, os resultados experimentais foram detectados usando o método da Anexina-V em um sistema de citômetro de fluxo Beckman Coulter Epics XL MCL (BD Accuri C6), e a porcentagem de células apoptóticas foi esclarecida por análise de software (Flowjo 7.6.2).

Análise estatística

Todos os dados experimentais foram expressos como a média ± erro padrão da média. Para comparação dos diferentes grupos, foi aplicada a técnica estatística de ANOVA com o teste post hoc de diferença mínima significativa (LSD) para analisar os dados obtidos. A P valor inferior a 0,05 ( P <0,05) foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados e discussão

Preparação e caracterização de nanopartículas de óxido de cério

Neste estudo, as dispersões aquosas de CNPs dopados com Ce foram obtidas usando Ce (NO ₃ ) ₃ ^. 6H ₂ O e BSA como precursores pelo método sintético inspirado na biomineralização. Durante a preparação, o BSA usado como principal fonte de carbono pode integrar os íons metálicos às nanopartículas metálicas devido à sua estrutura espacial única e flexibilidade da cadeia molecular. Em outras palavras, as nanopartículas dopadas com metal preparadas são compostas principalmente de estrutura carbonácea e elemento de metal carregado, que pode ser diferente das nanopartículas de cério inorgânicas convencionais [25]. O exame morfológico foi caracterizado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), e os tamanhos de partículas resultantes foram analisados ​​pelo software ImagingJ. A Fig. 1a mostrou imagens TEM características dos CNPs dopados com Ce resultantes. Essas imagens refletiram que os CNPs dopados com Ce possuíam estrutura poligonal, dispersão uniforme e forma discreta sem agregação aparente. A análise estatística indicou que os CNPs dopados com Ce tinham uma distribuição de tamanho estreita com um diâmetro médio de 14,7 ± 0,8 nm (Fig. 1b), o que era consistente com as imagens TEM. Quando os CNPs dopados com Ce estiveram em água por alguns dias, pode-se verificar que não houve precipitação e ainda manteve a declaração de soluções homogêneas, indicando sua estabilidade a longo prazo em solução aquosa, o que poderia ser benéfico para as seguintes aplicações biomédicas .

a Imagens TEM para CNPs dopados com Ce. A inserção mostrou imagem TEM de alta resolução. b A distribuição de diâmetro de CNPs dopados com Ce

Ilustração esquemática do projeto de CNPs dopados com Ce

A estrutura química e a composição da superfície dos CNPs dopados com Ce

Os grupos funcionais de superfície e a composição dos CNPs dopados com Ce foram investigados usando o padrão de espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) e o espectro infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR). O XPS foi usado para caracterizar o estado de oxidação dos íons de cério na superfície das amostras. O espectro de XPS da pesquisa (Fig. 2a) mostrou três picos predominantes em 902,0, 285,0 e 531,8 eV, que indicavam a existência de elementos de cério, carbono e oxigênio de CNPs dopados com Ce. Os sinais de enxofre (S 2p) a 164,0 eV sugeriram que o BSA foi conjugado com sucesso aos CNPs dopados com Ce. A coexistência de Ce (III) e Ce (IV) no catalisador CNPs dopado com Ce pode ser evidenciada pelo espectro da Fig. 2b. O espectro de alta resolução do Ce3d (Fig. 2b) pode se dividir em Ce3d ₃ e Ce3d ₅ (resultante de uma divisão spin-órbita de 32 eV), exibiu a presença de picos indexados e fortes, localizados em 882,0, 884,0 e 902,0 eV, respectivamente. Os sinais Ce3d foram divididos principalmente em O ₂ , 3d _5/2 e 3d _3/2 , os picos entre 875 e 895 eV pertenciam ao Ce3d _3/2 nível, que quase coincidiu com o espectro do publicado anteriormente [26]. Além disso, o espectro XPS também implicou em 15,99% de Ce3d. Estas observações estão de acordo com os resultados da literatura para CeO ₂ nanopartículas [25]. O espectro de C1s conforme mostrado na Fig. 2c foi descrito por três picos principais em 285,0, 287,8 e 288,9 eV, que respectivamente implicavam que CeO ₂ nanopartículas foram funcionalizadas com os níveis de energia 1s, C =O, C − F e COOR de C. A presença do espectro de O1s conforme mostrado na Fig. 2d foi dominado por dois picos principais em 530,5 e 531,8 eV, que corresponderam ao ligação entre O ₂ ^- e Ce ³⁺ .

a Espectros XPS dos CNPs dopados com Ce. Espectro de pesquisa. b Espectro Ce3d. c Espectro C1s. d Espectro O1s

A análise de FTIR foi posteriormente realizada para verificar a formação de CNPs dopados com Ce no processo de reação. Conforme mostrado na Fig. 3A, para os CNPs dopados com Ce, um pico intenso e amplo apareceu em 3400 cm ⁻¹ , que foi causada pela vibração de alongamento de O – H e pode ser atribuída à vibração de curvatura da água absorvida. O pico característico em 1510 cm ⁻¹ poderia ser descrito como o alongamento anti-simétrico –O – C – O, enquanto o pico em 1450 cm ⁻¹ poderia ser atribuído à vibração de alongamento simétrico de –O – C – O, ambos demonstrando a presença de grupos nitrato. Além disso, uma banda de absorção em 451 cm ⁻¹ foi atribuído ao trecho assimétrico Ce – O, indicando a formação de CNPs dopados com Ce. Esses resultados mostraram que os grupos funcionais de CNPs dopados com Ce continham principalmente certos −OH e –COO ^- grupos.

Um espectro de FTIR de CNPs dopados com BSA e Ce. B Padrão de XRD dos CNPs dopados com Ce. C Espectros de absorção UV-Vis de CNPs dopados com Ce. D Espectro de absorção de UV-Vis de violeta de metila (MV) após vários tratamentos. a MV, b MV tratado com H ₂ O ₂ e CNPs dopados com Ce, c MV tratado com FeSO ₄ e H ₂ O ₂ , e d MV tratado com FeSO ₄ , H ₂ O ₂ , e soluções de CNP dopadas com Ce em um tempo de incubação de 5 min

De acordo com a análise de difração de raios X (XRD), a estrutura cristalina dos CNPs dopados com Ce foi investigada. Como mostrado na Fig. 3B, existem quatro picos de difração principais em 24,4 °, 30,3 °, 35,23 ° e 43,2 °. Um desses picos em 24,4 ° pode ser atribuído à estrutura carbonácea inorgânica produzida, que é semelhante aos pontos quânticos de carbono relatados e picos característicos de grafite [27,28,29]. Em comparação com a estrutura de cristal ordenada de grafite (002 planos, 2 θ =26,5 °), o pico de difração de CNPs dopados com Ce em torno de 24,4 ° com um deslocamento inferior torna-se fraco, o que pode ser atribuído à alta desordem de carbono e aumento no sp ² (C – C) espaçamento das camadas no processo de carbonização [30]. Os picos de difração em ângulos de 30,3 °, 35,23 ° e 47,42 ° correspondem principalmente aos planos (111), (200) e (220), respectivamente, das nanopartículas de céria convencionais. Além disso, outros picos em ângulos de 56,30 °, 69,00 °, 75,57 ° e 78,99 ° corresponderam a (311), (400), (331) e (402) do óxido de cério referenciado (JCPDS 2004 36-1253). O espaçamento correspondente \ (\ left (\ mathrm {Fm} 3 \ overline {\ mathrm {m}} \ right) \) foi calculado de acordo com a lei de Bragg (o comprimento de onda da lei Cu-Kα é 0,154 nm). Estes resultados podem confirmar preliminarmente os CNPs dopados com Ce com a estrutura cristalina híbrida.

Era bem sabido que Fe ²⁺ pode catalisar alternadamente a dismutação do peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ ) em outro radical hidroxila reativo de acordo com a reação de Fenton [31]. Como um reagente cromogênico, a solução de violeta de metila mostra-se principalmente roxa. Alvejado com –C =C–, o radical hidroxila pode reagir com o violeta de metila, resultando em MV em uma cor rasa, mesmo incolor, e sua absorbância máxima de UV-Vis em 582 nm diminui [32]. De acordo com nosso projeto, os CNPs dopados com Ce certamente podem eliminar o radical hidroxila e, finalmente, aumentar a absorbância do MV em 582 nm.

Para confirmar a capacidade subjacente de eliminação de radicais livres para CNPs dopados com Ce, o espectro de absorção de UV-Vis de MV foi empregado para fornecer alguns insights. Não houve absorbância significativa de 500 a 700 nm em solução aquosa de CNPs dopada com Ce na Fig. 3C. No entanto, pudemos observar a absorbância máxima do violeta de metila em cerca de 582 nm e a absorbância foi inibida sob H ₂ O ₂ tratamento (Fig. 3D). Ao adicionar CNPs dopados com Ce na solução de mistura, a absorbância foi obviamente recuperada, o que provou que os CNPs dopados com Ce tinham a capacidade de eliminar o radical hidroxila e proteger o MV de ser atacado nesta condição experimental. Esses resultados terão ainda aplicação biomédica no tratamento de doenças causadas por radicais livres.

Ensaio de citotoxicidade de nanopartículas de óxido de cério in vitro

Antes de aplicar CNPs dopados com Ce sintetizado para tratar doenças associadas ao estresse oxidativo, é essencial avaliar sua biocompatibilidade. Neste estudo, o efeito dos CNPs dopados com Ce na viabilidade celular foram avaliados através da incubação de células VSMC e 7721 com CNPs dopados com Ce usando testes de viabilidade celular do ensaio CCK-8. Pode ser visto que a viabilidade celular não mostrou mudanças significativas após diferentes concentrações de tratamento com CNPs dopados com Ce para um tempo de exposição de 24 h (Fig. 4a). Mesmo na dose mais alta de 400 μg / ml, a viabilidade celular em todos os grupos de tratamento foi de aproximadamente 90%, demonstrando que os CNPs dopados com Ce tiveram uma citotoxicidade muito leve nas células. Essas descobertas destacaram a cito-compatibilidade favorável dos CNPs dopados com Ce e os habilitaram para aplicações biomédicas.

a O efeito de várias concentrações de CNPs dopados com Ce na viabilidade celular de VSMC e células 7721 por CCK-8. As células foram pré-tratadas com CNPs dopadas com Ce em diferentes concentrações por 24 h e, em seguida, foram administradas por H ₂ O ₂ em diferentes dosagens. b Viabilidade celular de VSMC e c 7721 células cultivadas com diferentes concentrações de CNPs dopadas com Ce abaixo de 560 μM H ₂ O ₂ - estresse oxidativo induzido por ensaio CCK-8

Propriedades antioxidantes e atividade de eliminação de radicais livres de CNPs dopados com Ce in vitro

A propriedade da enzima mimética dos nanomateriais de óxido de cério é favorável às suas potenciais aplicações terapêuticas. Foi examinado se os CNPs dopados com Ce em solução protegem suficientemente VSMC e as células 7721 contra o radical livre. Para esses estudos, H ₂ O ₂ foi usado para induzir a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), que levam ao comprometimento ou morte das células. Em primeiro lugar, o IC ₅₀ O valor da viabilidade celular foi determinado para explorar o efeito protetor dos CNPs dopados com Ce. A viabilidade das células VSMC e 7721 exibiu o valor baixo após a adição de H ₂ O ₂ . Uma tendência de aumento da atividade apoptótica para células VSMC e 7721 foi observada com aumento de H ₂ O ₂ concentração em solução (Fig. 4b). Em outras palavras, a elevação de ROS era dependente da dose, o que também revelou a dose letal mediana (LD ₅₀ ) de células VSMC e 7721 foi de aproximadamente 549 e 556 umol / ml, respectivamente. Como resultado, o LD ₅₀ H ₂ O ₂ via estresse oxidativo foi de 560 μM, próximo aos resultados da literatura [33].

Em seguida, o efeito antioxidante dos CNPs dopados com Ce sob LD ₅₀ de H ₂ O ₂ foi testado usando um ensaio de kit-6 de contagem de células (CCK-8). Devido às suas propriedades eletrônicas únicas, os CNPs dopados com Ce têm uma tendência inerente de existir em estados de oxidação dupla (Ce ³⁺ e Ce ⁴⁺ ) e têm atividade antioxidante conferida por meio do comportamento de oxidação-redução. Quando existe ROS, Ce ⁴⁺ pode ser continuamente alternado para Ce ³⁺ junto com a atividade de eliminação de radicais livres persistentes [34, 35]. Como mostrado na Fig. 4c, estes resultados implicam que a viabilidade celular de ambas as células VSMC e 7721 foi gradualmente melhorada com o aumento da concentração de CNPs dopados com Ce sob o mesmo estresse oxidativo. Especialmente, a viabilidade celular foi recuperada em cerca de 88,0% na concentração de CNP dopado com Ce de 400 μg / ml. Consequentemente, os CNPs dopados com Ce exibiram um excelente efeito antioxidante de uma maneira dependente da dose por meio de uma capacidade eficiente de eliminação de radicais livres.

A coloração viva-morta e o ensaio de citometria de fluxo foram empregados para revelar ainda mais o efeito cito-antioxidante dos CNPs dopados com Ce. Conforme representado na Fig. 5, fluorescência verde intensa sem vermelho foi observada nas células 7721 tratadas com CNPs dopados com Ce único, mas uma grande quantidade de fluorescência vermelha pode ser vista no H ₂ O ₂ tratamento de 556 uM, que demonstrou H ₂ O ₂ poderia induzir apoptose celular dramaticamente. Mas H ₂ O ₂ A apoptose induzida foi gradualmente aliviada com o aumento das concentrações de CNP dopado com Ce. Em particular, apenas uma pequena quantidade de fluorescência vermelha pôde ser vista após o tratamento com CNP dopado com Ce de 400 μg / ml sob H ₂ O ₂ - estresse oxidativo induzido, que indica maior viabilidade celular. O ensaio de citometria de fluxo foi posteriormente realizado para investigar o efeito antioxidante dos CNPs dopados com Ce. No gráfico de dispersão da citometria de fluxo variável dupla, o sinal de emissão da Anexina-V-FITC foi plotado no x -eixo, enquanto o sinal de emissão de PI foi plotado no y -eixo. Várias regiões das células foram definidas como segue:Anexina V- / PI –– são consideradas células vivas, Anexina V + / PI –– representa células de apoptose precoce e Anexina V + / PI + –– representa células de apoptose / necrose tardia. Conforme exibido na Fig. 6, o grupo de controle exibiu uma fração pequena e normal de apoptose tardia celular de 1,45%, mas H ₂ O ₂ o tratamento apresentou uma taxa extremamente elevada de apoptose tardia celular de 46,4%. Como esperávamos, a proporção de células apoptóticas tratadas com diferentes concentrações de CNPs dopadas com Ce tem uma tendência decrescente gradual. Em comparação com 46,4% de apoptose celular tardia sob o H ₂ O ₂ tratamento, a porcentagem de apoptose diminuiu marcadamente para 24,2, 20,0, 15,1 e 11,2% após o tratamento com CNP dopado com Ce de 50, 100, 200 e 400 μg / ml. Com base nos resultados da coloração vivo-morto e citometria de fluxo, revelou que os CNPs dopados com Ce exerceram efeitos antioxidantes favoráveis ​​contra a apoptose induzida por estresse oxidativo de uma maneira dependente da dose.

Imagens fluorescentes de células 7721 incubadas com diferentes concentrações de CNPs dopadas com Ce sob H ₂ O ₂ - estresse oxidativo induzido por 24 h por coloração de mortos-vivos (barras de escala =50 μm)

Flow cytometry profiles of 7721 cells were examined to determine the percentages of early apoptosis and late apoptosis cells with different treatments

Conclusions

In summary, we reported a novel Ce-doped CNPs with the capability of scavenging free radicals. The preparation method is simple by using one-step synthesis in the bio-mineralization manner. Different from the former surface modification (such as PVP), the as-prepared Ce-doped CNPs exhibited the improvement in biocompatibility and dispersibility in aqueous solution. Furthermore, in vitro studies showed albumin-based bio-mineralization Ce-doped CNPs not only own superoxide dismutase feature but also alleviate the oxidative damage caused by H₂ O ₂ , which have a protective effect on cells in this periods of study. Furthermore, the concentration of Ce-doped CNPs plays important roles in the recovery of apoptotic cells. Herein, the novel Ce-doped CNPs have promising biomedical applications in diseases prevention and treatment of oxidative stress-mediated.

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