Síntese e estudo in vitro de uma sonda de modo duplo que direciona a integrina αvβ3

Resumo

Os tumores malignos constituem uma doença grave que ameaça a vida humana, e o diagnóstico precoce e a previsão de metástases são essenciais para a escolha do plano de tratamento e o momento do tratamento. Integrina α _v β ₃ , que tem recebido ampla atenção como um marcador molecular da neovasculatura tumoral, é um alvo importante para monitorar a tumorigênese e a progressão na pesquisa de imagem molecular. Este estudo relata uma sonda molecular de ressonância magnética (MR) / fluorescência de modo duplo, cRGD-Gd-Cy5.5, que tem como alvo a integrina α _v β ₃ receptor e usa lipossomas como transportador. A nanossonda obtida tinha tamanho de 60,08 ± 0,45 nm, boa dispersão em água, distribuição uniforme de tamanhos, estabilidade desejável e alta relaxividade. Sua taxa de relaxamento r1 foi de 10,515 mM ⁻¹ s ⁻¹ , muito superior ao de outros quelatos de Gd em uso clínico. A sonda não mostrou citotoxicidade nas concentrações testadas in vitro, e sua capacidade de atingir células A549 e células SUNE-1-5-8F foi avaliada preliminarmente por meio de imagens de fluorescência in vitro e imagens de RM. Os resultados demonstraram que a nanossonda cRGD-Gd-Cy5.5 tinha boas características, mostrando estabilidade e biossegurança desejáveis, uma alta taxa de relaxamento T1 e forte direcionamento e ligação a tumores com alta expressão de integrina α _v β ₃ . Portanto, cRGD-Gd-Cy5.5 é um agente promissor para o monitoramento visual de metástases tumorais.

Histórico

A infiltração de tumor maligno e metástases à distância constituem a principal causa de falha do tratamento. O processo de metástase do tumor maligno requer a destruição da matriz extracelular (MEC) e da neovasculatura do tumor [1]. Portanto, o monitoramento não invasivo in vitro de marcadores moleculares relacionados à neovascularização tumoral é especialmente crucial na previsão de metástases tumorais e no diagnóstico precoce. Integrina α _v β ₃ , um marcador molecular amplamente estudado da neovasculatura tumoral, tem recebido grande atenção. Esta integrina está intimamente associada à adesão, proliferação e diferenciação de células endoteliais vasculares durante a neovascularização tumoral [2].

O progresso na imagem molecular permitiu o monitoramento não invasivo do crescimento do tumor em nível molecular. Os estudos de imagem molecular das moléculas alvo de interesse devem ter dois elementos básicos:(1) componentes de direcionamento adequados e (2) componentes de sinal que podem ser detectados por técnicas de imagem. Integrina α _v β ₃ , que reconhece e se liga especificamente à sequência arginina-glicina-aspartato (Arg-Gly-Asp, RGD) nas proteínas ECM, é ativada por meio de alterações conformacionais. Assim, a sequência RGD tem sido amplamente utilizada na síntese de traçadores direcionados a tumores como um importante componente de direcionamento [3]. A ressonância magnética (RM) tornou-se uma das mais poderosas ferramentas de diagnóstico por imagem molecular para monitorar tumores devido à sua radiação não ionizante, alta resolução do tecido mole e profundidade de penetração não limitante [4, 5]. A análise estatística indicou que aproximadamente 50% dos exames de RM requerem o uso de agentes de contraste para melhorar a qualidade das imagens [6, 7]. A imagem de fluorescência no infravermelho próximo é um tipo de imagem óptica, e o comprimento de onda da luz no infravermelho próximo, que é a primeira luz não visível descoberta, varia de 700 a 900 nm. As técnicas de imagem de fluorescência no infravermelho próximo permitem aos cirurgiões visualizar, delinear e ressecar tumores durante as cirurgias [8, 9]. No entanto, com as mudanças no espectro da doença humana, a imagem molecular de modo único falha em atender aos requisitos de diagnóstico de precisão por causa de suas altas taxas de falso-positivo e falso-negativo. Assim, técnicas de imagem molecular baseadas na integração de múltiplos modos serão uma nova tendência no desenvolvimento da imagem molecular [10].

Neste estudo, preparamos uma sonda molecular de modo duplo cRGD-Gd-Cy5.5 que pode ser usada na imagem histológica e funcional de tumores (Esquema 1). Comparado com as sondas moleculares com Fe ₃ O ₄ como unidade de sinal [11, 12], cRGD-Gd-Cy5.5 foi excelente com (a) alto paramagnetismo (sete elétrons desemparelhados em torno de Gd ^{3 +} ); (b) capacidade de se ligar ao transportador para formar um agente quelante estável, como Magnevist amplamente utilizado na clínica; (c) alta resolução espacial e maior definição de imagem do que agentes de contraste negativos [13, 14]. Selecionamos lipossomas como a molécula transportadora que liga o agente de contraste MR ao agente de contraste de fluorescência. Os fosfolipídios comuns têm duas longas cadeias de hidrocarbonetos hidrofóbicos e um grupo hidrofílico em suas estruturas moleculares. Quando adicionadas à água ou solução tampão, quantidades apropriadas de moléculas de fosfolipídios assumem arranjos em direções específicas, com seus grupos hidrofílicos voltados para a fase aquosa em ambos os lados e as cadeias de hidrocarbonetos hidrofóbicos voltadas uma para a outra para formar a bicamada em lipossomas. Peptídeos cíclicos direcionados a RGD e moléculas fluorescentes Cy5.5 foram conjugados à superfície do lipossoma através de um fosfolipídeo de polietilenoglicol (PEG) introduzido com grupos amino e, finalmente, os íons Gd foram encapsulados nos lipossomas para alcançar a construção da sonda molecular multimodal direcionada com características desejáveis ​​em termos de estrutura, composição, tamanho, forma, estabilidade e relaxividade MR. Sua citocompatibilidade foi avaliada por meio de ensaio de citotoxicidade e observação da morfologia celular. Finalmente, o potencial de cRGD-Gd-Cy5.5 para imagens de RM ponderadas em T1 e imagens de fluorescência de células cancerosas in vitro foi avaliado.

A rota sintética dos lipossomas dopados com Gd, seguida pela conjugação RGD e Cy5.5 para bioaplicações, para detecção altamente sensível de integrina α _v β ₃

Resultados

Caracterização da nanossonda cRGD-Gd-Cy5.5

A solução cRGD-Gd-Cy5.5 era um líquido claro rosa pálido, sem precipitação óbvia após repousar por um tempo, indicando boa dispersão. A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) revelou a aparência do complexo lipossomal cRGD-Gd-Cy5.5 como uma forma esférica de tamanho uniforme, sem agregação de grânulos ou dano após coloração negativa com fosfotungstato de sódio a 2%, como mostrado na Fig. 1a. A distribuição do tamanho de partícula foi consistente, variando de 50 a 80 nm, com tamanho médio de partícula de 60,08 ± 0,45 nm. O tamanho de partícula hidratado do complexo lipossomal cRGD-Gd-Cy5.5 medido por meio de dispersão de luz dinâmica (DLS) foi de 124,2 ± 0,215 nm (Fig. 1b). Conforme mostrado na figura, as nanopartículas exibiram uma distribuição de tamanho estreita em água e boa dispersão. O potencial zeta de superfície foi de 39,5 ± 1,65 mV, mostrando uma carga superficial positiva, que é consistente com a presença de grupos amino na superfície (Fig. 1c).

Dados de caracterização da nanossonda CRGD-GD-CY5.5. a Imagens TEM de baixa ampliação de cRGD-Gd-Cy5.5. b O tamanho de partícula foi detectado por análise de tamanho e o tamanho médio da sonda foi de 124,2 nm. c O potencial zeta é de cerca de 39,5 mV, a superfície aparente é eletropositiva

O ensaio de microplaca multifuncional mostrou que os lipossomas em branco não têm região de absorção de UV e os lipossomas acoplados com Cy5.5 fluorescente em luz de excitação de 600 nm têm pico de absorção óbvio em 685 nm (Fig. 1a), consistente com o comprimento de onda de emissão de Cy5.5 fluorescente . Moléculas fluorescentes mostraram que Cy5.5 foi acoplado com sucesso. Os resultados do sistema de imagem de fluorescência de pequenos animais mostraram que sob a luz de excitação de 600 nm, o Cy5.5 fluorescente conjugado com lipossoma tinha fluorescência vermelha óbvia, enquanto o lipossoma em branco não tinha sinal de fluorescência (Fig. 2b).

Propriedades de fluorescência da nanossonda cRGD-Gd-Cy5.5. a O lipossoma marcado com fluorescência Cy5.5 foi detectado por analisador de enzima multifuncional, e havia um pico de emissão visível em 670 nm em luz de excitação de 600 nm. b Sob luz de excitação de 600 nm, o Cy5.5 fluorescente acoplado a lipossoma (esquerda) tem uma luminescência óbvia, enquanto o lipossoma em branco (direita) não tem imagem de fluorescência

Relaxometria MR da nanossonda cRGD-Gd-Cy5.5

A taxa de relaxamento r1 é um parâmetro importante para avaliar o desempenho de imagem dos agentes de contraste T1 MR. Portanto, medimos o tempo de relaxamento T1 da sonda cRGD-Gd-Cy5.5 com diferentes concentrações de Gd. Conforme mostrado na Fig. 3b, a taxa de relaxamento r1 de cRGD-Gd-Cy5.5 foi de 10,515 mM ⁻¹ s ⁻¹ após o ajuste linear, muito maior do que o produto clínico Magnevist (4,56 mM ⁻¹ s ⁻¹ ) A elevada taxa de relaxamento r1 de cRGD-Gd-Cy5.5 pode ser o resultado da estrutura espacial especial dos lipossomas transportadores e do efeito de amplificação do sinal biológico dos lipossomas. Conforme a concentração de Gd aumentou, cRGD-Gd-Cy5.5 aumentou a intensidade do sinal MR (Fig. 3a). Esses resultados demonstraram que o cRGD-Gd-Cy5.5 sintético atende às necessidades de alto contraste de imagem em imagens de RM.

As propriedades de relaxamento de nanossondas cRGD-Gd-Cy5.5. a T1 - imagens ponderadas (Siemens, Verio, 3.0T, MOLLI, sequência:TR =5,8 ms, TE =3,66 ms, TI =16–3200 ms) dessas partículas em diferentes concentrações (Gd). b As curvas de ajuste da concentração de Gd e do tempo de relaxamento; o valor r1 de cRGD-Gd-Cy5.5 era 10,515 mM ⁻¹ s ⁻¹

Estudo de citotoxicidade da nanossonda cRGD-Gd-Cy5.5

A citotoxicidade in vitro de cRGD-Gd-Cy5.5 foi avaliada por meio do ensaio CCK-8, em comparação com a viabilidade das células do grupo não tratado (100%). Todas as células apresentaram viabilidade celular superior a 70% dentro da faixa de concentrações testadas de Gd (50-400 μM) (Fig. 4), indicando que esta sonda molecular tem boa compatibilidade celular. Notavelmente, a viabilidade celular ainda era superior a 70%, mesmo após 24 h de incubação com 400 μM de Gd, uma concentração substancialmente maior do que as dosagens usadas in vitro e in vivo.

Teste de citotoxicidade. Viabilidade celular de adenocarcinoma de pulmão humano (A549), linha celular de carcinoma nasofaríngeo (SUNE-1-5-8F), célula endotelial da veia umbilical humana (HUVEC) e linha celular normal de mama (MCF10A) incubada com diferentes concentrações de cRGD-Gd- Cy5.5 por 24 h

Coloração por imunofluorescência e ensaio de citometria de fluxo de integrina αvβ3

Os resultados da imunofluorescência mostraram que a expressão da integrina αvβ3 nas células A549 e 5-8F estava localizada na membrana celular e no citoplasma. A integrina das células A549 estava localizada principalmente na membrana celular e a intensidade de fluorescência na superfície das células A549 era maior do que a das células SUNE-1-5-8F. A intensidade de fluorescência das células MCF-10A foi extremamente fraca, demonstrando que quase nenhuma integrina αvβ3 foi expressa na superfície das células epiteliais mamárias (Fig. 5a). Os resultados da citometria de fluxo são mostrados na Fig. 5c. Os níveis de expressão de integrina αvβ3 são classificados da seguinte forma:A549 (89,07%)> SUNE-1-5-8F (63,84%)> MCF-10A (1,56%), indicando que os níveis de αvβ3 em células cancerosas foram significativamente maiores do que aqueles em mamários normais células da glândula.

Imagens de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) de células A549, SUNE-1-5-8F e MCF-10A. a Imagens de imunofluorescência celular da integrina αvβ3. Linha celular A549 e SUNE-1-5-8F expressa na membrana celular, células MCF-10A quase nenhuma expressão de integrina α _v β ₃ . b Células A549, SUNE-1-5-8F e MCF10A incubadas com cRGD-Gd-Cy5.5 a 200 μg mL ⁻¹ concentração a 37 ° C durante 1 h. A quantidade de sondas ligadas às células está de acordo com os resultados da imunofluorescência celular. c Ensaio de citometria de fluxo para detectar as expressões de integrina αvβ3 nas células A549, SUNE-1-5-8F e MCF-10A

Captação celular de cRGD-Gd-Cy5.5

Com base nos resultados da coloração de imunofluorescência, células A549 e 5-8F incubadas com cRGD-Gd-Cy5.5 foram usadas como os grupos experimentais, enquanto as células MCF-10A incubadas com cRGD-Gd-Cy5.5 foram utilizadas como o grupo de controle. Após a incubação com cRGD-Gd-Cy5.5, os sinais de fluorescência vermelha foram observados na membrana de ambas as células A549 e 5-8F, com a intensidade do sinal nas células A549 maior do que nas células SUNE-1-5-8F (Fig. 5b). Este resultado é consistente com a expressão da integrina αvβ3 detectada por coloração por imunofluorescência. Quase nenhum sinal de fluorescência vermelha foi encontrado na membrana das células MCF-10A no grupo de controle.

Imagem de RM e fluorescência in vitro

Com base em sua alta taxa de relaxamento r1 e boa compatibilidade celular, cRGD-Gd-Cy5.5 foi usado como um agente de contraste positivo para imagens de RM de células cancerosas in vitro. Como mostrado na Fig. 6a, b, a cor das imagens de MR ponderadas em T1 tornou-se gradualmente mais brilhante, indicando que a intensidade do sinal de MR de células A549 tratadas com cRGD-Gd-Cy5.5 aumentou com concentrações de Gd mais altas. A diferença no tempo de relaxamento T1 entre os dois grupos foi estatisticamente significativa, conforme indicado pelo t teste para duas amostras independentes ( p <0,05). Estes dados sugerem que cRGD-Gd-Cy5.5 sintético tem potencial para uso como um agente de contraste positivo em imagens de RM in vitro de células cancerosas. Da mesma forma, um sistema de fluorescência de pequeno animal mostrou um aumento correspondente na intensidade de fluorescência à medida que a concentração da sonda aumentava (Fig. 6c). A partir do sinal de imagem e dos dados específicos, o efeito de imagem do grupo alvo (cRGD-Gd-Cy5.5) foi melhor do que o do grupo não direcionado (Gd-Cy5.5).

Ressonância magnética celular e imagens de fluorescência. a As células foram incubadas com células A549 por 2 h de acordo com as concentrações de Gd:0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04 e 0,08 (mM). O Gd-Cy5.5 foi usado como grupo controle. b Tempo de relaxamento T1 da imagem de ressonância magnética correspondente. c Imagens do sistema de imagem ao vivo de pequenos animais

RM In Vivo e Imagem de Fluorescência

As imagens de ressonância magnética adquiridas antes da injeção de agentes de contraste não mostraram diferenças de sinal significativas entre os tumores e outros órgãos / tecidos periféricos. Em 5 min após a injeção com CRGD-Gd-Cy5.5, a intensidade do sinal nos locais do tumor começou a ser reforçada, mas a hiperintensidade estável foi mantida desde 6 h após a injeção. No grupo de teste, a intensificação do parênquima tumoral foi observada desde 30 min, e o reforço foi aumentado em 2 h (Fig. 7a). No grupo com receptor bloqueado, entretanto, apenas reforço suave foi encontrado nas margens dos tumores, e o grau de reforço foi enfraquecido em 2 he já desapareceu (Fig. 7a). Nas imagens de fluorescência, a intensidade de fluorescência no grupo-alvo aumentou gradualmente desde o 30º minuto, mas ainda era alta na sexta hora (Fig. 7b), indicando que a circulação sanguínea foi estendida e CRGD-Gd-Cy5.5 concentrado de forma eficiente em tumores. No grupo com receptor bloqueado, nenhuma concentração de sonda específica foi observada em qualquer um dos pontos de tempo testados. Fluorescência de alta intensidade no rim bilateral foi observada na sexta hora (Fig. 7b). Deduzimos que a via metabólica de CRGD-Gd-Cy5.5 pode ser a depuração através do sistema renal.

RM e imagens de fluorescência de modelos de tumor de xenoenxerto subcutâneo de carcinoma nasofaríngeo de camundongos nus. a Camundongos nus foram anestesiados e fotografados com um scanner de ressonância magnética 3.0-T na pré-injeção e 0,5, 2 e 6 horas após a injeção. b Camundongos nus foram anestesiados e fotografados com sistema de imagem de fluorescência em 0,5, 2 e 6 h pós-injeção

Discussão

A integrina αvβ3 é altamente expressa não apenas nas células endoteliais da neovasculatura tumoral, mas também na superfície de uma variedade de células tumorais, como melanoma maligno, glioma maligno, câncer de próstata, câncer de pulmão e células de câncer de mama [15], enquanto αvβ3 não é expresso ou expresso em níveis baixos em células epiteliais regulares e células endoteliais vasculares maduras. Com base nas propriedades acima, integrina αvβ3 tornou-se um alvo ideal para monitoramento in vivo de metástases tumorais [16]. No entanto, os métodos atuais de medição dos níveis de expressão de integrina αvβ3 ainda têm problemas de não invasividade, repetibilidade e oportunidade de imagem, que ainda precisam ser resolvidos. Tendo em vista as questões objetivas acima, uma sonda molecular de modo duplo foi sintetizada neste estudo para monitoramento dinâmico em tempo real da expressão da integrina αvβ3, que indiretamente atingiu o objetivo de prever e monitorar metástases tumorais.

Os agentes de contraste podem ser divididos em dois tipos de acordo com o mecanismo de imagem de RM:compostos Gd (agente de contraste T1-positivo) e nanopartículas de óxido de ferro paramagnético (agente de contraste T2-negativo). Em comparação com outros agentes de contraste, os compostos de Gd têm vantagens incomparáveis ​​na prática clínica [17]. O íon Gd, que é um material superparamagnético, fornece um sinal de alta intensidade em imagens ponderadas em T1. Gd também pode se ligar a uma variedade de substâncias para formar complexos estáveis ​​com uma alta resolução espacial e uma alta relação sinal-ruído. No entanto, cada tipo de agente de contraste tem suas próprias limitações (a saber, o curto tempo de circulação sanguínea dos agentes de contraste T1 e os artefatos de susceptibilidade magnética dos agentes de contraste T2) [18,19,20,21]. Os compostos Gd tradicionais têm as seguintes limitações. (1) Os quelatos Gd tradicionais não têm efeito de direcionamento. (2) A intensidade do sinal dos agentes de contraste quelato de Gd é menor do que a das partículas superparamagnéticas de óxido de ferro ultra-pequenas (USPIOs) na mesma concentração. Para resolver os problemas acima, os íons Gd são ligados a estruturas macromoleculares (como lipossomas, moléculas dendríticas e dextrano) para aumentar o efeito de relaxamento T1 [22], e o complexo é então ligado ao ligante de alvos tumorais para preparar sondas moleculares e obter imagens direcionadas ao tumor [23]. Neste estudo, os lipossomas foram selecionados como a molécula transportadora que liga os agentes de contraste MR aos agentes de contraste fluorescentes. A estrutura espacial especial dos lipossomas tem um efeito de amplificação do sinal biológico e melhora efetivamente a concentração de íons Gd nos tecidos locais, aumentando assim a intensidade do sinal MR. Zhou et al. [24] empregaram nanopartículas de silsesquioxano oligomérico poliédrico ligado a β-ciclodextrina (POSS) como o transportador para acoplar RGD a compostos Gd para obter com sucesso uma sonda molecular, cRGD-POSS-βCD- (DOTA-Gd), com uma taxa de relaxamento T1 de 9,50 mM ⁻¹ S ⁻¹ . O complexo lipossoma-cRGD-Gd-Cy5 obtido neste estudo foi encontrado para ter uma taxa de relaxamento T1 de 10,515 mM ⁻¹ S ⁻¹ , que é mais do que o dobro da taxa de relaxamento T1 do agente Gd atualmente em uso clínico (Magnevist), e este complexo também exibiu excelentes propriedades de imagem por RM.

A nanossonda preparada por nosso grupo tem tamanho uniforme, aparência regular e boa dispersibilidade. O potencial zeta reflete a estabilidade da sonda molecular, e um valor positivo ou negativo mais alto do potencial zeta está associado a um sistema mais estável e menor possibilidade de agregação. Em geral, as moléculas com potenciais zeta superiores a + 30 mV ou inferiores a -30 mV são consideradas como tendo boa estabilidade. O potencial zeta na superfície da partícula da sonda obtido neste estudo foi de + 39,5 ± 1,65 mV, que é ligeiramente inferior a + 30 mV. No entanto, nenhuma agregação foi observada sob TEM.

Os agentes de Gd são os agentes de contraste de RM mais amplamente usados ​​na prática clínica atual e sua biossegurança não pode ser ignorada. Guo et al. [25] descobriram que um complexo Gd acoplado ao ácido hialurônico dendrítico era uma micropartícula muito segura e eficaz como agente de contraste de MR, com alta sensibilidade e baixa presença residual no corpo humano. Através do estudo da citotoxicidade in vitro da sonda molecular construída, esta sonda molecular demonstrou possuir baixa citotoxicidade e alta biossegurança tanto para células tumorais quanto não tumorais (células epiteliais e células endoteliais vasculares). Acreditamos que os lipossomas têm boa biocompatibilidade e a baixa biotoxicidade pode ser um benefício do lipossoma que encapsula os íons Gd.

Com base em estudos anteriores [26,27,28], nosso grupo selecionou a linha celular de adenocarcinoma de pulmão A549 com alta expressão de integrina αvβ3 para uso no grupo experimental, com a adição inovadora da célula de carcinoma nasofaríngeo SUNE-1-5-8F linha nas experiências de direcionamento de células in vitro; células epiteliais mamárias com quase nenhuma expressão de integrina αvβ3 foram incluídas como o grupo de controle negativo. A sonda molecular se ligou bem à membrana celular das células de adenocarcinoma pulmonar A549 e as células de carcinoma nasofaríngeo SUNE-1-5-8F, mas não se ligou a células MCF-10A, indicando que a sonda tem uma excelente capacidade de direcionamento molecular, que foi confirmada pelos resultados do ensaio de imunofluorescência. Os resultados de imagem de RM confirmaram ainda a propriedade de direcionamento da sonda molecular cRGD-Gd-Cy5.5 lipossomal em MR, com sinais de maior intensidade do que a do agente de contraste não direcionado (Gd-Cy5.5) em células tumorais. Os experimentos in vivo confirmam que as sondas podem se manter estáveis ​​no soro e visar persistentemente os locais do tumor por 6 h, pelo menos. Os resultados dos estudos in vitro garantem estudos subsequentes in vivo da sonda molecular em um modelo metastático de carcinoma nasofaríngeo em camundongos nus.

Conclusões

Em resumo, o método de preparação para a sonda de modo duplo cRGD-Gd-Cy5.5 visando integrina αvβ3 é viável, e esta sonda tem estabilidade e biossegurança desejáveis ​​e uma alta taxa de relaxamento T1. A sonda mostrou um forte efeito de direcionamento para as células com alta expressão de integrina αvβ3, que estabeleceu uma base sólida para monitoramento dinâmico não invasivo, eficiente e em tempo real de metástases tumorais em nível anatômico e nível metabólico molecular via RM / imagem molecular de fluorescência na Vivo.

Métodos

Síntese de cRGD-Gd-Cy5.5

A 20 mL de clorofórmio, 70 mg de lecitina, 20 mg de colesterol e 210 mg de DSPE-PEG2000-NH foram adicionados, e a mistura foi colocada em um limpador ultrassônico para dissolver completamente as substâncias (conforme indicado por uma solução transparente sem substâncias granulares). A solução foi então colocada em um frasco em forma de pêra para evaporação rotativa em banho-maria a 60 ° C até que um filme tipo favo de mel (sem resíduo líquido) fosse formado. O hexa-hidrato de tricloreto de Gd (10 mg) foi pesado com precisão e dissolvido em tampão carbonato a pH 8,5 para obter uma solução límpida, que foi então misturada com o filme semelhante a um favo de mel acima para hidratação a 50 ° C durante 1 h; essa etapa foi seguida de dispersão e refinamento por meio de uma sonda ultrassônica em um processador ultrassônico de líquidos (VCX 750, Sonics, EUA). Finalmente, a mistura foi coletada e passada por um filtro de 0,22 μm e submetida à ultrafiltração com um tubo de ultrafiltração de 10 kD para remover o tricloreto de Gd livre e obter lipossomas contendo tricloreto de Gd, que foram então armazenados a 4 ° C.

O péptido cíclico RGD foi então acoplado à molécula Cy5.5 fluorescente. O peptídeo cíclico RGD (5 mg) foi dissolvido em 1 mL de tampão de ácido clorídrico diluído a pH 5,0 e 1 mg de cloridrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e 0,5 mg de N -hidroxissuccinimida (NHS) foram adicionados e então ativados em temperatura ambiente por 30 min em um oscilador em temperatura constante. A molécula de peptídeo cíclico RGD ativada foi então misturada com 100 μg da molécula fluorescente Cy5.5 e do lipossoma, e o pH foi medido como 8,4 usando papel de teste de pH de precisão. A mistura foi então incubada à temperatura ambiente num agitador durante 4 h; este passo foi seguido pela remoção do péptido cíclico RGD não reagido e da molécula Cy5.5 fluorescente através da utilização de um tubo de ultrafiltração de 10 kD.

Caracterização de Nanopartículas

O tamanho de partícula das nanopartículas foi determinado por TEM (GEOL Tóquio, Japão). Uma pequena quantidade de complexo lipossoma-cRGD-Gd-Cy5.5 foi adicionada a água ultrapura (pH =6,0) para diluição em uma solução de 1 mg / mL. Uma gota da amostra foi colocada em uma grade de cobre revestida usando uma pipeta de transferência estéril, e fosfotungstato de sódio a 2% foi adicionado gota a gota após alguns minutos para restabelecimento. O excesso de solução de coloração negativa foi aspirado após 1–2 min. A grade de cobre foi então seca e colocada sob um microscópio eletrônico de transmissão de 80 kV para observação. Aproximadamente 40 a 50 nanopartículas foram selecionadas aleatoriamente para observar sua morfologia e tamanho de partícula, e imagens em escala de 50 nm e 100 nm foram salvas. O tamanho da partícula foi medido usando o software NanoMeasure, e a média foi calculada a partir de três medições repetidas.

Um analisador de tamanho de partícula (Malvern, Reino Unido) foi usado para medir o tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta das nanopartículas. Uma gota da solução do complexo lipossoma-cRGD-Gd-Cy5.5 foi diluída com água ultrapura e, em seguida, transferida para um tubo Eppendorf, que foi colocado em um limpador ultrassônico por 5 min para dispersar as partículas uniformemente. As partículas dispersas foram avaliadas por DLS no analisador de tamanho de nanopartículas para determinar o tamanho de partícula e o potencial zeta.

As propriedades ópticas do complexo lipossomal cRGD-Gd-Cy5.5 foram caracterizadas por meio de um leitor de microplacas multifuncional (BioTek, EUA). Dois microlitros de cada solução de lipossoma e lipossoma-cRGD-Gd-Cy5.5 foram adicionados a 998 μL de tampão de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e bem misturados antes de serem adicionados a uma cubeta de quartzo; a absorção ultravioleta em 400–800 nm foi então obtida por meio de um leitor de microplaca multifuncional. A solução do complexo lipossoma-cRGD-Gd-Cy5.5 (1,5 mL) foi transferida para um tubo Eppendorf e a mesma quantidade de solução de lipossoma vazia foi usada como um controle em branco. A imagem de fluorescência foi realizada usando um sistema de imagem de fluorescência de pequenos animais.

A modificação de grupos amino de superfície em lipossomas foi confirmada usando espectroscopia FT-IR (Nicolet-5700, EUA). O espectro de absorção de UV-vis foi obtido (UV 2550, Shimadzu, Japão); uma concentração de 0,1 mg / mL de cRGD-Gd-Cy5.5 lipossomal foi usada para a medição.

Medição da taxa de relaxamento

A amostra de sonda de fluorescência lipossomal carregada com Gd modificada com cRGD foi diluída com água desionizada para obter as seguintes concentrações de Gd:0,18, 0,1275, 0,085, 0,0425 e 0,017 mM. Cinco mililitros de cada amostra diluída foram colocados em um frasco com tampa de rosca, e os frascos foram fixados em um suporte de tubos multifuncional de acordo com a ordem de concentração. A amostra de sonda fluorescente lipossomal carregada com Gd modificada com cRGD foi submetida a varredura MR através das bobinas de cabeça e pescoço para obter imagens ponderadas em T1 para as diferentes concentrações da sonda. A sequência de varredura usada para as imagens ponderadas em T1 foi uma sequência de recuperação de inversão de look-locker modificada (MOLLI), onde os parâmetros foram definidos da seguinte forma:tempo de repetição (TR) =5,8 ms, tempo de eco (TE) =3,66 ms, inversão tempo de recuperação (TI) =16–3200 ms e espessura de varredura =5 mm. Depois que a digitalização foi concluída, um mapa pseudo-colorido foi obtido. Um ² de 0,3 cm área de interesse foi delineada na imagem de cada amostra no mapa, e o valor T1 correspondente foi lido.

Cultura de células e ensaio de citotoxicidade

Células de adenocarcinoma de pulmão humano A549, células de carcinoma nasofaríngeo humano SUNE-1-5-8F, células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) e células epiteliais de mama humana MCF-10A foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) . As células foram cultivadas em meio 1640 completo (Euroclone-Lonza) contendo 10% de soro fetal bovino (Euroclone-Lonza), 100 unidades / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina e 2 mM de glutamina sob 5% de CO ₂ a 37 ° C.

O método CCK-8 foi usado para examinar a citotoxicidade da sonda molecular para diferentes células, incluindo células epiteliais normais e células tumorais. Células A549, células 5-8F, HUVECs e células MCF-10A foram semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 5 × 10 ³ células / poço e cultivadas durante a noite. As células aderentes foram então incubadas com 100 μL de meio 1640 fresco contendo cRGD-Gd-Cy5.5 de várias concentrações de Gd (0, 50, 100, 200 e 400 μM) por 24 h. Subsequently, the cells were washed three times with PBS and then incubated with 100 μL of Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) containing no fetal bovine serum (FBS). After 10% Cell Counting Kit-8 reagent (Dojindo, Japan) was added to each well, the sample was incubated for 10 h. The absorbance at 450 nm of each well was then measured using an ELISA microplate reader (Multiskan MK3, Thermo Scientific, Logan, UT). Cells treated with PBS only were employed as the control group. For each sample, five parallel wells were analyzed to obtain the mean and standard deviation.

Immunofluorescence Staining and Flow Cytometry Assay of Integrin αvβ3

A total of 20,000 A549, 5-8F, and MCF-10A cells each were seeded in confocal plates (Thermo Scientific) and cultured for approximately 24 h when the cells successfully grew on the slides. The cells were washed three times with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde (Boster) at room temperature for 30 min, and then washed three times (10 min each) in PBS. The cells were then incubated in 3% bovine serum albumin (PBST) for 30 min to block non-specific antibody binding and washed three times with PBS. The fixed cells were incubated with anti-integrin αvβ3 monoclonal antibody (1:500; Abcam, Cambridge, UK) at 4 °C overnight and then incubated with anti-mouse fluorescent secondary antibody (1:500) (Abcam) for 1 h. 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:1000; Sigma) was used to stain the nucleus. A laser confocal scanning microscope (Nikon A1, Tokyo, Japan) was used to detect the green fluorescence signal from integrin αvβ3 and the DAPI signal from nuclei.

The integrin αvβ3 expression levels in different cell lines were quantified using flow cytometry. In brief, three types of cells were collected:A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A, which were washed in PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA). After being sealed with the PBS containing 5% BSA, the cells were cultivated in VNR-1 antibody (Abcam, Cambridge, MA, USA) at density 2 μg/1 × 10 ⁶ and 4 °C for 30 min. The secondary antibody was DyLight 488 goat anti-mouse IgG (H+L) (ab96879), diluted 1/500, and at 22 °C for 30 min. Quantitative assays were conducted on a flow cytometer (Gallios, Beckman Coulter, USA) at excitation wavelength 488 nm and emission wavelength 530 nm. Each time, at least 1 × 10 ⁵ cells (n  = 3) were collected.

Binding Assay of the Molecular Probe to Integrin αvβ3

A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A cells were inoculated into confocal plates. The cells were incubated at 37 °C for 1 h with the molecular probe of the same Gd concentration after the cells reached the logarithmic growth phase. The cells were then washed three times in PBS and placed under a laser confocal scanning microscope for observation.

In Vitro MR Imaging and Fluorescence Imaging of Tumor Cells

To verify the tumor cell-targeting ability of the cRGD-modified Gd-loaded liposomal fluorescent probe, the probe was incubated with A549 cells and then examined using MR imaging and a small animal fluorescence imaging system. A549 cells were seeded in six-well plates with 2 mL of 1640 medium containing 10% FBS and 1% penicillin–streptomycin in each well and then incubated at 37 °C and 5% CO₂ . In the experimental groups, cRGD-Gd-Cy5.5 was incubated with A549 cells for 2 h with Gd concentrations of 0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, and 0.08 mM. The cells of the control groups were incubated with the non-targeted gadolinium contrast agent (Gd-Cy5.5) for 2 h at the same Gd concentrations as the experimental groups. The cells were then washed with PBS, trypsinized, centrifuged, and finally placed in glass tubes containing 1 mL of PBS (with 0.5% agarose) for MR imaging. Specific imaging parameters were described above. A small animal live imaging system (IVIS Lumina XRMS Series III, MA, USA) was used for fluorescence imaging of the A549 cells.

In Vivo MR and Fluorescence Imaging

To validate whether CRGD-Gd-Cy5.5 had tumor targetability in vivo in animals, we conducted animal experiments following the Guide for Care and Use of Laboratory Animals, released by the Animals Ethics Committee of Laboratory Animal Center, Guangxi Medical University. We successfully established a Balb/c nude mice nasopharyngeal carcinoma subcutaneous xenografting tumor model for magnetic resonance/fluorescent scanning. A 3.0-T MRI scanner containing 40-mm-diameter mouse volume coils (Discovery 750, GE, Germany) was used for T1-weighted imaging, operated at field of view = 80 × 80 mm, repetition time = 742 ms, echo time = 69 ms, and layer thickness = 2.0 mm. The nude mice were divided into two groups (n  = 3), including a test group and a receptor-blocked group. All mice were injected via tail vein with CRGD-Gd-Cy5.5 (0.05 mmol Gd/kg). Each mouse was scanned at four time points:before injection, 30 min, 2 h, and 6 h after injection. In the receptor-blocked group, 1 h before injection with CRGD-Gd-Cy5.5, each mouse was injected via the tail vein with free CRGD polypeptide (10 mg) and was MRI-scanned at the same four time points. The fluorescent images were photographed by a fluorescence imaging system (Bruker, USA). The grouping, drug injection, and scanning time points were all the same as described above. During the imaging, the mice (n  = 3) were anesthetized using a gas mixture of oxygen and isoflurane. The nude mice were kept at heart rate 60–120/min and respiratory rate at 20–40/min. Finally, direct visual comparison of tumor images was conducted by two experienced radiologists.

Abreviações

DLS:

Espalhamento de luz dinâmico

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle medium

ECM:

Matriz extracelular

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride

FBS:

Containing no fetal bovine serum

HUVECs:

Human umbilical vein endothelial cells

MOLLI:

Modified look-locker inversion

MR:

Magnetic resonance

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

PEG:

Polietileno glicol

RGD:

Arginina-glicina-aspartato

TE:

Echo time

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

TI:

Inversion recovery time

TR:

Repetition time

USPIOs:

Iron oxide particles

Adsorção de metais de transição em fosforeno preto:um estudo de primeiros princípios Avaliação da atividade do citocromo P450 3A4 inibido por nanopartículas de ouro e dos mecanismos moleculares subjacentes à sua toxicidade celular na linha celular C3A do carcinoma hepatocelular hu…