Red Spectral Shift in Sensitive Colorimetric Detection of Tuberculose by ESAT-6 Antigen-Antibody Complex:a New Strategy with Gold Nanoparticle

Resumo

A tuberculose (TB) é uma doença altamente contagiosa com risco de vida, causada pelo patógeno bacteriano Mycobacterium tuberculosis . ESAT-6, uma proteína alvo antigênica secretória precoce abundante por M . tuberculose , encontrado para desempenhar um papel vital na virulência. O desenvolvimento de um método amigável para a detecção de ESAT-6 na concentração mais baixa facilita o tratamento da TB em um estágio inicial e ajuda a controlar a propagação da doença. Aqui, uma nova abordagem de etapa única foi projetada e foi feita por pré-mistura de ESAT-6 e anticorpo antes de ser adicionado à nanopartícula de ouro (GNP) seguido pela agregação induzida por sal. Pudemos atingir o limite de detecção de 1,25 pM, mostrando a agregação do PNB e o desvio espectral para o vermelho. Além disso, uma maior especificidade foi demonstrada com a falta de bioincrustação eletrostática por ESAT-6 no GNP e reteve o GNP disperso na presença de proteína filtrada de cultura de 10 kDa de M. tuberculose . A concentração precisa de anticorpos necessária para este ensaio foi de 60 nM. O incremento na concentração de anticorpos de 75 nM diminui drasticamente a sensibilidade para ~ 680 vezes, devido ao efeito de aglomeração. Com este ensaio, atestamos a adequação do ensaio colorimétrico para detectar com eficiência a proteína de menor tamanho.

Histórico

A tuberculose (TB) é causada por Mycobacterium tuberculosis , uma das principais doenças causadoras de morte em humanos e, inicialmente, ataca o pulmão. Como consequência, ele se espalha por outras partes do corpo, como rins, coluna e cérebro, e se torna mais grave quando a imunidade diminui. Para salvar pessoas com ações preventivas, é obrigatório identificar e tratar a TB na fase latente. Nesta fase, o paciente foi infectado por M. tuberculose ; entretanto, o patógeno não está ativo. Existem vários métodos que têm sido usados para detectar TB em um estágio latente, o que inclui teste cutâneo de TB e teste de interferon-gama. Na maioria dos casos, o teste cutâneo de TB sozinho não é capaz de detectar a infecção TB ativa, e o paciente precisa ser confirmado por outros testes de apoio, como raio-X de tórax, citologia de escarro e cultura de escarro [1]. Mas esses testes exigem etapas laboratoriais mais difíceis e levam vários meses para serem concluídos; portanto, o desenvolvimento de um método mais fácil e eficiente para detectar TB em um estágio anterior é obrigatório.

O ensaio colorimétrico baseado em nanopartículas de ouro (GNP) mostra uma grande atenção na área de biossensores devido às suas características físicas e químicas únicas, como maior coeficiente de extinção nos comprimentos de onda visíveis e ressonância plasmônica de superfície alterável. A solução GNP monodispersa exibe altos coeficientes de extinção e mostra o espectro na região visível. Se os GNPs tiverem o espaço adequado entre eles, eles parecerão ser soluções de cor vermelha e se tornarão azuis quando forem agregados sob a condição disponível de íons divalentes [2]. Na presença dos íons apropriados, os espaços entre os GNPs serão preenchidos, atingirão o estágio de agregação e exibirão o deslocamento espectral em direção ao comprimento de onda visível denominado "deslocamento para o vermelho". Aproveitando a vantagem dessa mudança espectral, uma série de ensaios colorimétricos foram gerados para detectar as doenças, como HIV e influenza [3, 4]. Esses tipos de ensaios baseiam-se em sequências de oligonucleotídeos de fita simples, e o aptâmero tem sido amplamente utilizado como uma molécula adequada para detectar o alvo [5, 6]. Sequências de DNA ou RNA de fita simples podem se ligar na superfície do GNP por meio da coordenação entre os átomos de ouro e nitrogênio nas bases do DNA [7,8,9]. Os GNPs modificados com oligonucleotídeo são estáveis em condições salinas superiores. Quando o analito estiver disponível, o oligonucleotídeo será separado do ouro e será agregado na presença de íons divalentes, em seguida, exibirá a solução azul. Os ensaios de GNP demonstrados são mais baratos, consomem menos tempo para detecção, são mais fáceis de funcionalizar e apresentam a detecção visual com boa sensibilidade [10,11,12,13,14]. Devido a essas atitudes positivas, os ensaios colorimétricos baseados em GNP foram estendidos para a detecção de moléculas menores, incluindo DNA, RNA, proteína, célula inteira e íons metálicos. Vários aptâmeros estavam disponíveis para detectar esses analitos usando os ensaios colorimétricos baseados em GNP de aptâmero simplificado, mostrando os desvios espectrais para o vermelho [15,16,17,18,19].

Mesmo que os ensaios colorimétricos tenham sido bem documentados com o aptâmero, DNA ou RNA, eles também têm impactos negativos em alguns casos devido ao seu fraco desempenho com sequências mais longas e falha com a análise interativa da sonda e do alvo [20,21,22]. Isso pode ser devido às cargas mais altas nas biomoléculas que fazem uma interação mais forte com a superfície do GNP eletrostaticamente, tornando a molécula alvo incapaz de liberar a molécula da sonda fixada na superfície do GNP. Para superar esse obstáculo, aqui, introduzimos um ensaio colorimétrico baseado em anticorpo de etapa única para detectar a proteína ESAT-6. A proteína ESAT-6 é a proteína secretária precoce, identificada como o antígeno importante na tuberculose [23,24,25]. Diagnosticando a proteína ESAT-6 em um estágio anterior, é obrigatório tratar a doença e evitar sua propagação. A Figura 1a, b ilustra a estratégia projetada para detectar ESAT-6 por seu anticorpo usando ensaio de desvio espectral vermelho colorimétrico baseado em GNP. A seguir estão as etapas envolvidas neste método de detecção:(i) o anticorpo policlonal anti-ESAT-6 foi pré-misturado com o antígeno ESAT-6 / CFP-10, (ii) GNP foi adicionado a esta solução, (iii) NaCl foi adicionado, e (iv) detecção visual e análise de desvio espectral para o vermelho por espectroscopia de UV. Com essas etapas, realizamos a análise crítica para elucidar a interação baseada em carga entre o GNP e as proteínas complexadas e concluímos a adequação da pré-mistura anticorpo-antígeno para os ensaios colorimétricos. Para o experimento de controle, o filtrado de cultura proteína-10 (CFB-10) foi usado em vez de ESAT-6 (Fig. 1).

Métodos

Reagentes e biomoléculas

Alvo antigênico secretor precoce (ESAT-6) e proteína de filtrado de cultura de 10 kDa (CFP-10) foram adquiridos da Sino Biological Inc. (Pequim, China). O anti-ESAT-6 foi adquirido na Santa Cruz Biotechnology (EUA). A nanopartícula de ouro com diâmetro de 15 nm foi obtida na Sigma Aldrich (EUA). Água desionizada produzida pelo sistema de desionização RO (18,3 MΩ · cm SASTEC (M) Sdn. Bhd) foi aproveitada para todo o experimento.

Otimização de íons divalentes para agregar o PNB

Para a detecção de ESAT-6 no estudo atual, íons divalentes (NaCl) foram usados para visualizar a agregação do GNP. Para otimizar a condição adequada com NaCl, diferentes concentrações (concentrações finais de 50 a 800 mM) foram adicionadas ao volume constante (20 μl) de GNP [uma densidade óptica (D.O.)]. Após 15 min, as mudanças de cor foram fotografadas com uma câmera digital da SONY. Os desvios espectrais com essas mudanças foram monitorados pelo Nanofotômetro.

ESAT-6 Biofouling na superfície do GNP:validação da especificidade

Para validar a ligação não específica (bioincrustação) de ESAT-6 na superfície do GNP, diferentes concentrações (concentrações finais de 1,5 a 100 nM) foram adicionadas a 20 μl de GNP. Após 30 min, a concentração ideal de NaCl foi adicionada a cada tubo e, em seguida, as mudanças de cor e os desvios espectrais foram observados conforme seguido no experimento acima. Da mesma forma, a bioincrustação também foi testada com CFP-10.

Otimização da concentração obrigatória de anticorpos anti-ESAT-6 na superfície do GNP

Para otimizar a concentração necessária de anticorpo anti-ESAT-6 para avaliar os experimentos atuais, diferentes concentrações de anticorpo anti-ESAT-6 (concentrações finais de 30 a 500 nM) foram misturadas independentemente com 20 μl de GNP. Após 30 minutos de incubação, o volume ideal de NaCl foi adicionado a cada tubo, as fotografias foram tiradas e as alterações espectrais foram observadas após 15 minutos.

Detecção de ESAT-6 pelo deslocamento espectral do vermelho colorimétrico baseado em anticorpos

Para desenvolver a detecção colorimétrica de ESAT-6 por alterações espectrais de desvio para o vermelho colorimétricas baseadas em anticorpos, 1 μl de 1 μM ESAT-6 (o volume final será de 500 nM) foi inicialmente misturado com 1 μl de concentração ideal de anticorpo anti-ESAT-6 . Após 30 min de incubação, 20 μl de GNP foram adicionados a cada tubo e, em seguida, aguardou-se 30 min. Em seguida, a concentração ideal de NaCl foi adicionada e as mudanças espectrais foram medidas no comprimento de onda de 400 a 800 nm. Da mesma forma, as outras concentrações de ESAT-6 (0 a 500 nM) foram tituladas com a mesma concentração otimizada de anticorpo anti-ESAT-6. Para verificar o limite de detecção, ESAT-6 foi testado a partir do picomolar mais baixo (de 1,25 pM) até a ordem nanomolar (500 nM). As concentrações das demais moléculas (anticorpo anti-ESAT-6, GNP e NaCl) foram mantidas constantes.

Resultados e discussão

O ensaio colorimétrico baseado em anticorpos mostrando as mudanças espectrais como um desvio para o vermelho foi seguido aqui para detectar ESAT-6. A Figura 1a mostra a representação esquemática do ensaio colorimétrico baseado em anticorpo de etapa única; na presença de ESAT-6, espera-se que a mudança de cor na solução de GNP seja azul com desvio espectral vermelho ao perder a estabilidade do GNP sob uma alta concentração de um íon divalente, NaCl, enquanto que, na ausência de ESAT-6, O GNP é estável devido à fixação do anticorpo anti-ESAT-6 na superfície do GNP e leva à retenção de sua cor vermelha original, mesmo em uma alta concentração de NaCl. Esta estratégia foi confirmada usando o CFP-10 não específico contra o anticorpo anti-ESAT-6 e supostamente exibia uma solução de GNP de cor vermelha (Fig. 1b). Visto que CFB-10 também é a principal proteína causadora da tuberculose, aqui, nós a usamos como a proteína de controle [26]. Geralmente, para este tipo de ensaio baseado em GNP, o tamanho do GNP de 13 a 15 nm é adequado para atingir a maior sensibilidade [27], e aumentar o tamanho do GNP não é adequado para atingir o bom limite de detecção. É devido à razão de que o tamanho crescente do GNP precisa de uma quantidade maior de anticorpos para se ligar à superfície do GNP. Se uma quantidade maior de anticorpos se ligar à superfície, isso leva ao resultado falso negativo. Aqui, desejamos usar o GNP de 15 nm e atingimos a sensibilidade máxima para o nível sub-picomolar.

Otimização de íons divalentes para agregação controlada de PNB

Para essa otimização de detecção, usamos NaCl para a agregação do GNP. Quando rastreamos a concentração necessária de NaCl como mostrado na Fig. 2, diferentes concentrações de NaCl foram adicionadas ao GNP, a cor da solução começou a aparecer como azul, indicando a agregação com 100 mM de NaCl. E também pelo espectro, foi visto claramente que apenas com o GNP agregado (concentrações de NaCl de 100 a 800 mM), há um desvio para o vermelho no comprimento de onda ~ 600 nm, enquanto o GNP disperso (concentrações de NaCl de 0 a 50 mM) ainda mantém seu espectro em ~ 500 nm. No entanto, há uma alteração espectral de pico insignificante com 50 mM de NaCl. A partir desses resultados, concluiu-se que precisamos de pelo menos 100 mM de NaCl para a agregação do GNP, mas para obter a maior sensibilidade, usamos uma concentração maior (800 mM) de NaCl para experimentos posteriores. Anteriormente, o intervalo semelhante de NaCl para a agregação de GNP foi mostrado por Gopinath et al. [10].

Otimização de Anticorpo ESAT-6 para Dispersão de GNP

Após a otimização do NaCl, em seguida, determinamos a concentração adequada de anticorpo anti-ESAT-6 para a realização dos experimentos. Uma vez que a sensibilidade é altamente dependente da concentração de anticorpo, é necessário desejar a concentração adequada de anticorpo anti-ESAT-6 para induzir a dispersão de GNP. A noção por trás é, se a concentração mínima de anticorpo desejada, ele pode ser facilmente complexado com a adição do alvo e não há moléculas livres para serem anexadas ao GNP, ao passo que, se vários anticorpos estiverem disponíveis, quando tentamos detectar o baixa concentração de ESAT-6, apenas uma pequena quantidade de anticorpos são complexados. Em seguida, o anticorpo remanescente se liga à superfície do GNP e induz a estabilidade do GNP, o que causa menor sensibilidade. O IgG do anticorpo tem maior peso molecular (~ 150 kDa), fazendo com que os anticorpos livres se liguem facilmente na superfície do GNP por interação eletrostática ou ligação iônica / hidrogênio entre os grupos aniônicos terminados na superfície na superfície do GNP [28]. Devido ao maior peso molecular, o número de anticorpos é menor, e aqui foi balanceado com 6 kDa de peso molecular ESAT-6, que possui mais moléculas mesmo em uma concentração menor. Como mostrado na Fig. 3a, primeiro adicionamos a partir da concentração mais baixa de anticorpo anti-ESAT-6 (30 nM) e aumentamos até a concentração máxima (500 nM) para o GNP. Foi demonstrado que 30 nM de anticorpo anti-ESAT-6 com GNP está em transição de agregação mesmo com NaCl 800 mM, devido a não ter anticorpos suficientes disponíveis na superfície de GNP, mas a partir de 60 nM de anticorpo anti-ESAT-6, o A solução manteve sua cor vermelha devido ao número suficiente de anticorpos anti-ESAT-6 que se ligam à superfície do GNP. Até que a concentração máxima fosse testada (500 nM), a cor do GNP era mantida na cor vermelha com alta estabilidade. Depois de decidir a concentração adequada de 60 nM de anticorpo, para verificar a estabilidade do anticorpo anti-ESAT-6 e conjugados GNP, tentamos aumentar as concentrações de NaCl. Como mostrado na Fig. 3b, o conjugado de anticorpo GNP preparado (60 nM de anticorpo com GNP) é muito estável mesmo com a adição de 1 M de NaCl. O espectro na Fig. 3c também mostra o mesmo resultado da detecção visual; os conjugados de GNP de anticorpo anti-ESAT-6 preparados retêm seu pico em ~ 520 mesmo com uma alta concentração de NaCl e, ao mesmo tempo, apenas GNP leva a agregar com NaCl 800 mM com o pico máximo em ~ 500 nm.

Detecção ESAT-6 usando anticorpo pré-complexado por deslocamento espectral vermelho colorimétrico e validação de bioincrustação ESAT-6

Uma vez que o anticorpo de 60 nM mostra uma excelente estabilidade, inicialmente, tentamos detectar ESAT-6 complexado com 60 nM de anticorpo anti-ESAT-6. ESAT-6 é a proteína de menor peso molecular com o tamanho de 6 kDa e bem escolhida para o ensaio baseado em colorimetria. Antes de realizar o experimento de detecção, verificamos a bioincrustação de ESAT-6 na superfície do GNP; como existe a possibilidade de ligação do ESAT-6 com o GNP, pode resultar em falso positivo ou falso negativo. Como mostrado na Fig. 4, em ESAT-6 com a concentração até 100 nM, o GNP não era estável a 800 mM de NaCl, indicando que o ESAT-6 não se liga eletrostaticamente à superfície do GNP. Esta não incrustação também sugeriu que a composição de aminoácidos de ESAT-6 está desempenhando um papel importante neste ensaio. Após esta confirmação, detectamos ESAT-6 pré-complexado com 60 nM de anticorpo anti-ESAT-6. Diferentes concentrações de ESAT-6 foram complexadas com a concentração constante (60 nM) de anticorpo e depois adicionadas ao GNP. Finalmente, 800 mM de NaCl foram adicionados para avaliar a agregação com o desvio espectral para o vermelho. Como mostrado na Fig. 5a (inserção), a detecção de ESAT-6 de 0,5 nM a 500 nM confirmou uma mudança de cor clara com transições em comparação com o controle (com apenas 60 nM de anticorpo). A cor das soluções mudou de vermelho para azul mesmo em 0,5 nM e intensificou-se mais a 15 nM, e pode ser devido à saturação completa com ESAT-6. Parece que nenhum anticorpo permanece para se ligar ao GNP, mesmo a 0,5 nM. Com referência à representação gráfica da Fig. 5a, 15 a 500 nM de ESAT-6 mostra a saturação completa. É claramente provado a partir da Fig. 5b que o espectro do experimento de controle (sem proteína ESAT-6) exibe um bom perfil em ~ 500 nm, enquanto com ESAT-6 com 0,5 e 500 nM, os espectros foram desviados para o vermelho. A partir desses resultados, concluiu-se que podemos detectar a proteína ESAT-6 a partir de 0,5 nM e ainda descer para concentrações mais baixas devido ao óbvio aparecimento de cor azul.

Limite de detecção de ESAT-6 pelo Colorimetric Red Spectral Shift

Uma vez que 60 nM de anticorpo anti-ESAT-6 exibiu uma melhora aparente para a detecção de ESAT-6, para descobrir o limite de detecção, ajustamos o ESAT-6 ainda mais para o picomolar mais baixo (1,25 pM a 5000 pM ) Como mostrado na Fig. 6a, a partir de 1,25 pM de ESAT-6, há um início de cor azul devido à formação do complexo entre ESAT-6 e o anticorpo. A partir de 2,5 pM, a cor da solução que mudou para azul intensificou-se e reteve as alterações de cor com outras concentrações. No experimento de controle (sem ESAT-6), a cor da solução parecia ser vermelha, apoiando a especificidade do experimento atual (Fig. 6a). Este resultado também foi confirmado pelo espectro como mostrado na Fig. 6b. Com a solução de controle, não há mudança no espectro, mas de 1,25 a 5 nM de proteína ESAT-6, os espectros foram desviados para o vermelho para 600 nm. A 5 nM de ESAT-6, houve um deslocamento espectral completo observado com máximos de pico. Com base nesses resultados experimentais, podemos concluir que o limite de detecção de ESAT-6 é em torno do menor picomolar (1,25 pM) usando o pré-complexo do anticorpo ESAT-6.

Ajuste fino com especificidade

Uma vez que pudemos detectar ESAT-6 com 60 nM de anticorpo anti-ESAT-6, em seguida, tentamos a mesma detecção com uma concentração um pouco alta de anticorpo anti-ESAT-6 de 75 nM. Os resultados obtidos estão na Fig. 7a. Verificou-se que ocorreu uma ligeira mudança de cor usando 75 nM de anticorpo pré-complexado a 850 pM ESAT-6. Aumentamos a concentração de ESAT-6 para 100 nM e pudemos observar o progresso nas mudanças de cor para azul. Com esses experimentos, o limite de detecção foi observado como estando na faixa nanomolar usando 75 nM de anticorpo pré-complexado. Finalmente, para confirmar a especificidade da ligação de ESAT-6, também testamos o ensaio semelhante usando o pré-complexo de anti-ESAT-6 e proteína CFP-10 de M. tuberculose . Os resultados são vistos claramente que apenas ESAT-6 tem a especificidade e CFP-10 pode ser o controle apropriado (Fig. 7b). No geral, a partir dos resultados acima, percebeu-se que a otimização da concentração de anticorpos é obrigatória para melhorar a sensibilidade do ensaio colorimétrico.

Conclusões

A tuberculose (TB) é uma das principais doenças com risco de vida para humanos, e a identificação da TB em um estágio inicial permite prevenir a propagação e tratar a doença. Neste estudo, escolhemos um alvo antigênico secretor precoce (ESAT-6), uma das principais proteínas da TB. Introduzimos um ensaio de desvio espectral vermelho colorimétrico baseado em anticorpo de etapa única usando nanopartículas de ouro, e o limite de detecção foi de 1,25 pM. A especificidade deste ensaio foi elucidada usando a proteína controle (CFP-10), e não mostra a mudança de cor com a adição de GNP. Por outro lado, o ESAT-6 sozinho não está vinculado ao PNB. Com esta evidência, a presença de ESAT-6 pré-complexado e anticorpo anti-ESAT-6 foi demonstrada com a confiabilidade do ensaio de desvio espectral vermelho colorimétrico. Essa estratégia é simples e rápida para detectar tipos semelhantes de analito em uma única etapa. Além disso, este ensaio pode ser expandido com uma pequena molécula complexada com um anticorpo apropriado para ser adequado para detecção em ponto de atendimento. Esta metodologia definitivamente funcionará com proteínas e peptídeos de tamanho menor. Com proteínas de tamanho maior, dependendo das cargas de aminoácidos, pode haver uma variação.

Abreviações

CFP-10:: Proteína de filtrado de cultura de 10 kDa
DNA:: Ácido nucléico desoxirribose
ESAT-6:: Alvo antigênico secretor precoce de 6 kDa
GNP:: Nanopartícula de ouro
NaCl:: Cloreto de Sódio
O.D:: Uma densidade óptica
RNA:: Ácido nucleico ribose
TB:: Tuberculose
UV:: Ultravioleta

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