Nanopartículas de Quitosana-BSA Carregadas com Curcumina Aumentam Clearance de Amiloide-β42 e Modulam Polarização de Macrófagos na Doença de Alzheimer

Resumo

Doença de Alzheimer (DA) permanece o principal distúrbio neurodegenerativo entre idosos, mas terapias eficazes são limitadas pela barreira hematoencefálica (BHE), clearance pobre de amiloide-β (Aβ) e neuroinflamação crônica. Projetamos nanopartículas (NPs) de quitosana (QS)-albumina sérica bovina (BSA) para entregar curcumina — um polifenol potente anti-inflamatório e anti-amiloideogênico — diretamente ao cérebro. NPs de QS-BSA carregadas com curcumina atingiram 95,4% de eficiência de encapsulamento, diâmetro médio de 143,5 nm e carga superficial negativa de -10,8 mV, garantindo estabilidade e permeabilidade favorável à BHE. Modelos in vitro de BHE mostraram 60,2% de penetração de NPs após 3 h, marcadamente maior que curcumina livre (29,8%). Estudos de captação celular revelaram níveis intracelulares aumentados de curcumina em macrófagos RAW 264.7, que por sua vez aumentaram fagocitose de Aβ42. Mecanicamente, NPs suprimiram eixo TLR4-MAPK/NF-κB, regularam negativamente citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6) e deslocaram macrófagos de fenótipo neurotóxico M1 para fenótipo protetor M2. Estes achados demonstram que NPs de QS-BSA carregadas com curcumina potencializam clearance de Aβ42 enquanto modulam neuroinflamação, oferecendo plataforma promissora de nanomedicina para terapia de DA.

Introdução

DA é caracterizada por declínio cognitivo progressivo e depósito característico de fibrilas extracelulares de Aβ42. Enquanto Aβ42 monomérico é fisiologicamente benigno, agregados oligoméricos são altamente neurotóxicos e impulsionam progressão da doença. Alvo agregação de Aβ42 e promover seu clearance são portanto centrais para estratégias terapêuticas. Células microgliais, macrófagos residentes do cérebro, reconhecem Aβ via receptores toll-like (TLRs) e fagocitam o peptídeo. No entanto, ativação crônica polariza microglia para fenótipo pró-inflamatório M1, exacerbando lesão neuronal. Promover mudança para fenótipo anti-inflamatório M2 emergiu como abordagem viável de modificação da doença.

Curcumina, derivada de açafrão (Curcuma longa), exibe propriedades anti-amiloideogênicas, anti-oxidativas e quelantes de metal. Pode modular polarização de macrófagos inibindo cascata de sinalização TLR4-MAPK/NF-κB. Infelizmente, baixa solubilidade, metabolismo rápido e permeabilidade limitada à BHE de curcumina limitam sua utilidade clínica.

Portadores nanoparticulados podem superar estas barreiras. QS é polissacarídeo catiônico, biocompatível, capaz de formar complexos estáveis com proteínas aniônicas como BSA. BSA é abundante no plasma, não imunogênica e confere características de liberação sustentada a nanopartículas. Combinando QS e BSA, fabricamos NPs carregadas com curcumina otimizadas para travessia da BHE e entrega direcionada a microglia.

Materiais

QS (desacetilação 80%, ~400 kDa) foi obtida da Haixin Biological Product Co., Ltd. BSA (Sigma-Aldrich), curcumina (Dalian Meilun Biotechnology) e Aβ42 marcado com FITC (Chinese Peptide Co.) foram comprados comercialmente. Linhagens celulares RAW 264.7 (monócito-macrófago de camundongo) e hCMEC/D3 (endotelial microvascular cerebral humano) foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% soro fetal bovino e antibióticos. LPS (1 µg/ml) foi usado para polarizar células RAW 264.7 ao fenótipo M1, mimetizando ativação microglial em DA.

Preparação de NPs de QS-BSA Carregadas com Curcumina

QS foi dissolvida em ácido acético 0,1% (0,5 mg/ml). Curcumina (0,05 mg/ml em 100 µl DMSO) foi misturada na solução de QS sob agitação magnética à temperatura ambiente. Solução de BSA (1,0 mg/ml) foi então adicionada gota a gota, produzindo suspensão opalescente que condensou em nanopartículas sólidas via interação eletrostática. Tamanho de partícula, potencial zeta e morfologia foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz e MET. Liberação in vitro foi avaliada em tampão fosfato salino (pH 7,4) a 37 °C, e eficiência de encapsulamento (EE) calculada como EE% = (W_total - W_livre)/W_total × 100% onde W_total é quantidade inicial de curcumina e W_livre o sobrenadante.

Avaliação de Apoptose Celular por MTT

NPs de QS-BSA em branco (0-2,0 mg/ml) foram incubadas com RAW 264.7 (M1) e hCMEC/D3 por 24 h para avaliar citotoxicidade via ensaio MTT.

Estudos de Penetração Usando Modelo In Vitro de BHE

Monocamada de células hCMEC/D3 (TEER > 300 Ω) foi cultivada em inserts Transwell. Curcumina livre ou NPs carregadas com curcumina (curcumina equivalente 100 µg/ml) foram adicionadas à câmara superior. Após 3 h incubação a 37 °C, intensidade de fluorescência de curcumina (excitação 425 nm, emissão 530 nm) na câmara inferior foi medida. Razão de fluorescência relativa (RFR%) quantificou eficiência de penetração. Inibidores endocíticos (clorpromazina, genisteína, citocalasina D, azida de sódio) foram aplicados para elucidar mecanismos de transporte.

Captação Celular de NPs de QS-BSA Carregadas com Curcumina

Microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) avaliou distribuição intracelular de curcumina em RAW 264.7 (M1) após exposição a curcumina livre ou NPs carregadas via sistema Transwell. Fluorescência verde de curcumina foi monitorada em intervalos de 6, 12 e 24 h.

Detecção de Fagocitose de Aβ42 Induzida por Curcumina Livre e NPs de QS-BSA Carregadas com Curcumina

Células RAW 264.7 (M1) pré-tratadas com curcumina livre ou NPs carregadas foram incubadas com Aβ42 marcado com FITC por 3 h. Fagocitose foi quantificada por fluorescência CLSM e citometria de fluxo.

Ensaio Western Blot

Níveis de expressão de TNF-α, IL-6, TLR4 e estados de fosforilação de ERK, JNK, p38, IκBα e NF-κB foram examinados por Western blot para elucidar impacto de NPs carregadas com curcumina no eixo TLR4-MAPK/NF-κB.

Resultados

Caracterização de NPs de QS-BSA Carregadas com Curcumina

Espalhamento dinâmico de luz revelou diâmetro médio de 143,5 nm, potencial zeta de -10,8 mV e índice de polidispersibilidade de 0,021. Imagens de MET confirmaram partículas esféricas, monodispersas (Figura 1). Eficiência de encapsulamento atingiu 95,4%. Perfil de liberação mostrou explosão inicial de 11,3% em 3 h, seguida de liberação sustentada por 48 h, indicando proteção efetiva de curcumina durante circulação.

Penetração Através de Modelo In Vitro de BHE

Penetração de curcumina livre foi 12,3% (1 h), 20,3% (2 h) e 29,8% (3 h). NPs carregadas com curcumina atingiram 37,7%, 45,6% e 60,2% de penetração nos mesmos pontos temporais, respectivamente (Figura 2). Experimentos de inibição de endocitose demonstraram que NPs dependiam de vias mediadas por caveolae e macropinocitose dependentes de energia, enquanto curcumina livre entrava nas células principalmente por difusão passiva.

Avaliação de Citotoxicidade

Ensaios MTT confirmaram que NPs de QS-BSA em branco foram não citotóxicas a RAW 264.7 (M1) e hCMEC/D3 em concentrações até 2,0 mg/ml (Figura 3).

Captação Celular

Imagem CLSM mostrou acumulação tempo-dependente de curcumina dentro de células RAW 264.7 (M1). NPs carregadas com curcumina produziram fluorescência intracelular marcadamente maior que curcumina livre, indicando entrega aprimorada (Figura 4).

Fagocitose Aumentada de Aβ42

Co-localização de curcumina (vermelho) e FITC-Aβ42 (verde) demonstrou que NPs carregadas com curcumina aumentaram presença intracelular de Aβ42 em células RAW 264.7 (M1), evidenciada por maior densidade de fluorescência verde (Figura 5). Isso sugere que níveis intracelulares elevados de curcumina aumentam capacidade fagocítica microglial.

Análise Western Blot

Comparado a controles não tratados, células RAW 264.7 (M1) polarizadas por LPS exibiram expressão elevada de TNF-α, IL-6 e TLR4, e aumento de fosforilação de ERK, JNK, p38 e NF-κB. NPs carregadas com curcumina reduziram marcadamente estes marcadores pró-inflamatórios e eventos de sinalização, ressaltando sua capacidade de inibir polarização M1 (Figura 6).

Discussão

Nossos resultados confirmam que nanopartículas de QS-BSA aumentam significativamente entrega de curcumina através da BHE, principalmente via vias mediadas por caveolae e macropinocitose. A penetração cerebral aprimorada traduz-se em concentrações intracelulares maiores de curcumina, que por sua vez aumentam fagocitose microglial de Aβ42 e reduzem carga patológica de placas amiloides.

O efeito anti-inflamatório de NPs carregadas com curcumina é evidente através de supressão da cascata TLR4-MAPK/NF-κB e regulação negativa de TNF-α, IL-6 e TLR4. Esta modulação de citocinas re-polariza macrófagos de fenótipo neurotóxico M1 para estado anti-inflamatório M2, estratégia terapêutica cada vez mais reconhecida para modificação da doença em DA.

Coletivamente, estes achados posicionam NPs de QS-BSA carregadas com curcumina como plataforma de nanomedicina multifacetada que simultaneamente aborda entrega de fármaco, clearance de amiloide e neuroinflamação — obstáculos-chave no tratamento de DA.

Conclusão

Nanopartículas de QS-BSA carregadas com curcumina penetram efetivamente a BHE, aumentam acumulação intracelular de curcumina e promovem fagocitose de Aβ42 por microglia. Também mitigam neuroinflamação inibindo via TLR4-MAPK/NF-κB e favorecendo polarização de macrófagos M2. Estes atributos coletivamente ressaltam promessa terapêutica desta nanoplataforma para doença de Alzheimer.