Detecção Colorimétrica Ultra-Sensível de TB Usando Complexos Antígeno-Anticorpo ESAT-6 e Nanopartículas de Ouro

Resumo

Tuberculose (TB) permanece uma das principais causas de mortalidade mundial, impulsionada pelo fator de virulência ESAT-6, um alvo antigênico secretado precocemente de Mycobacterium tuberculosis. Detecção rápida, de baixa concentração, de ESAT-6 é essencial para intervenção precoce e contenção da doença. Apresentamos um ensaio colorimétrico baseado em anticorpo, em etapa única, que emprega nanopartículas de ouro (GNPs) de 15 nm e mecanismo de agregação induzida por sal para atingir limite de detecção de 1,25 pM. O método explora o deslocamento espectral para o vermelho de GNPs dispersas quando o complexo ESAT-6/anticorpo está presente, enquanto mantém estabilidade na presença de proteínas não específicas como proteína de filtrado de cultura de 10 kDa (CFP-10). A concentração ótima de anticorpo foi determinada em 60 nM; exceder este limiar causou perda de sensibilidade de 680 vezes devido a impedimento estérico. Este ensaio demonstra alta especificidade, biofouling mínimo e oferece leitura visual rápida adequada para diagnóstico ponto-de-cuidado de TB.

Contexto

TB é causada por Mycobacterium tuberculosis e representa grave ameaça à saúde global. Infecção latente precoce pode progredir para doença ativa uma vez que a imunidade do hospedeiro enfraquece, enfatizando necessidade de diagnósticos sensíveis e rápidos no estágio latente. Testes convencionais — tuberculina cutânea, ensaios de liberação de interferon-γ, radiografia torácica, citologia de escarro e cultura — são trabalhosos, caros e frequentemente atrasados por meses. Assim, estratégia de detecção simples, acessível e rápida é urgentemente necessária.

Sensores colorimétricos baseados em nanopartículas de ouro (GNPs) emergiram como ferramentas poderosas para diagnóstico de doenças devido à sua forte ressonância de plasmon de superfície e propriedades ópticas ajustáveis. GNPs monodispersos de 15 nm exibem matiz vermelho característico que muda para azul upon agregação desencadeada por íons divalentes, como NaCl. Esta mudança de cor, impulsionada por deslocamento espectral para o vermelho, forma base de muitos ensaios de detecção rápida para vírus, bactérias e moléculas pequenas. No entanto, desempenho de ensaios baseados em DNA ou aptâmeros-GNPs pode ser limitado por interações eletrostáticas e incompatibilidades sonda-alvo, especialmente com sequências de ácido nucleico mais longas.

Para superar estes desafios, desenvolvemos um ensaio colorimétrico baseado em anticorpo, em etapa única, que alvo a proteína ESAT-6 de 6 kDa. Pré-complexando ESAT-6 com seu anticorpo policlonal específico antes da exposição a GNPs, prevenimos ligação não específica e permitimos plataforma de detecção visual altamente sensível. A Figura 1 ilustra fluxo de trabalho do ensaio e controles de especificidade usando CFP-10.

Métodos

Reagentes e Biomoléculas

ESAT-6 e CFP-10 de 10 kDa foram comprados da Sino Biological Inc. (Pequim, China). Anticorpo policlonal anti-ESAT-6 foi obtido da Santa Cruz Biotechnology (EUA). GNPs de 15 nm com capa de citrato foram adquiridos da Sigma Aldrich (EUA). Todos reagentes foram usados sem purificação adicional.

Otimização de Íons Divalentes para Agregação de GNPs

Para identificar concentração ótima de NaCl para induzir agregação de GNPs, uma faixa de NaCl (50-800 mM) foi adicionada a volume fixo de GNPs (1 O.D.). Após 15 min, mudança de cor foi registrada e espectro de absorbância (400-800 nm) medido usando Nanofotômetro.

Avaliação de Biofouling de ESAT-6 em Superfície de GNPs

Para avaliar adsorção não específica de ESAT-6 em GNPs, concentrações variadas (1,5-100 nM) foram incubadas com GNPs seguidas de adição de NaCl ótimo. Mudanças colorimétricas e espectrais foram observadas. CFP-10 foi usado para confirmar especificidade.

Otimização de Concentração de Anticorpo Anti-ESAT-6 em Superfície de GNPs

Concentrações de anticorpo anti-ESAT-6 (30-500 nM) foram misturadas com GNPs, incubadas por 30 min, e desafiadas com NaCl crescente para identificar nível de anticorpo que maximiza estabilidade de dispersão.

Detecção de ESAT-6 via Deslocamento Espectral Vermelho Colorimétrico Baseado em Anticorpo

1 µL de 1 µM ESAT-6 (final 500 nM) foi misturado com 1 µL da concentração ótima de anticorpo. Após 30 min, 20 µL GNPs foram adicionados e incubados por mais 30 min. NaCl foi então adicionado a concentração final de 800 mM, e espectro de absorbância (400-800 nm) registrado. Diluição serial de ESAT-6 (0-500 nM) foi usada para determinar limite de detecção, abrangendo faixas picomolar a nanomolar.

Resultados e Discussão

O ensaio aproveita o deslocamento espectral para o vermelho que ocorre quando GNPs agregam na presença do complexo ESAT-6/anticorpo. Na ausência de ESAT-6, o anticorpo reveste superfície de GNP, preservando matiz vermelho mesmo após adição de NaCl, enquanto presença de ESAT-6 desencadeia agregação e deslocamento para azul.

Otimização de NaCl

GNPs permaneceram vermelhos em concentrações de NaCl abaixo de 100 mM, mas começaram a agregar a 100 mM, produzindo deslocamento espectral para o vermelho centrado em ~600 nm. Para sensibilidade máxima, 800 mM NaCl foi selecionado para garantir agregação completa na ausência de cobertura por anticorpo.

Otimização de Concentração de Anticorpo

A 30 nM anticorpo, GNPs ainda agregaram mesmo com 800 mM NaCl, indicando cobertura superficial insuficiente. A partir de 60 nM, GNPs mantiveram cor vermelha sob mesmo desafio de sal, demonstrando dispersão efetiva. Concentrações acima de 60 nM não trouxeram benefício adicional e arriscaram aglomeração de anticorpo.

Detecção de ESAT-6 e Validação de Biofouling

ESAT-6 (até 100 nM) não ligou a GNPs, prevenindo falsos positivos/negativos. Quando pré-complexado com 60 nM anticorpo, o ensaio exibiu mudança de cor clara de vermelho para azul a tão baixo quanto 0,5 nM ESAT-6, com saturação completa observada entre 15-500 nM. Espectros confirmaram deslocamento para o vermelho em direção a 600 nm em concentrações acima de 1,25 pM.

Limite de Detecção

Titulando ESAT-6 de 1,25 pM a 5 nM, o ensaio manteve mudança de cor azul clara e deslocamento espectral para ~600 nm. Limite de detecção (LOD) foi estabelecido em 1,25 pM, superando muitos diagnósticos colorimétricos de TB existentes.

Confirmação de Especificidade

Usando 75 nM anticorpo, LOD aumentou para faixa nanomolar, confirmando papel crítico da concentração de anticorpo. CFP-10, apesar de ser antígeno de TB, não desencadeou agregação, validando especificidade do ensaio.

Conclusões

Este estudo demonstra ensaio colorimétrico rápido, em etapa única, baseado em nanopartículas de ouro que atinge limite de detecção de 1,25 pM para antígeno de TB ESAT-6. A alta especificidade do método, confirmada por controles CFP-10, e sua dependência de anticorpo/antígeno pré-complexado reduzem biofouling e aumentam sensibilidade. A simplicidade do ensaio, leitura visual e requisitos mínimos de equipamento o tornam forte candidato para triagem ponto-de-cuidado de TB, especialmente em ambientes com recursos limitados. Trabalhos futuros explorarão extensão desta plataforma a outros biomarcadores de pequenas proteínas e integração em dispositivos diagnósticos portáteis.