Preparação de lipossomas de ácido glicirretínico usando método de solução monofásica de liofilização:pré-formulação, otimização e avaliação in vitro

Resumo

Neste estudo, lipossomas de ácido glicirretínico (GA) foram preparados com sucesso usando o método de solução de monofase de liofilização. Os estudos de pré-formulação compreenderam a avaliação da solubilidade de fosfatidilcolina de soja (SPC), colesterol e GA em co-solvente de álcool terc-butílico (TBA) / água. As influências da porcentagem de volume de TBA na taxa de sublimação foram investigadas. O GA após a liofilização usando co-solvente TBA / água com diferentes percentuais de volume foi caracterizado físico-quimicamente por DSC, XRD e FTIR. Os padrões de XRD de GA mostram natureza amorfa aparente. Os resultados da espectroscopia FTIR mostram que não ocorreram alterações estruturais químicas. Estudos de solubilidade mostram que a solubilidade aquosa de GA é aumentada. A formulação ótima e as variáveis ​​de processamento de 508 mg de SPC, 151 mg de colesterol, porcentagem de volume de 55% de TBA, relação em peso de 4:1 trealose / SPC foram obtidas após investigação por meio do projeto Box-Benhnken e experimento de seleção de lioprotetor. Sob condições ótimas, foram obtidos eficiência de encapsulação satisfatória (74,87%) e diâmetro médio (191 nm) de lipossomas reconstituídos. O estudo de liberação de fármaco in vitro mostrou que os lipossomas reconstituídos têm propriedades de liberação sustentada em dois tipos de meio de liberação. Além disso, o estudo de captação de células in vitro revelou que o processo de captação de lipossomas carregados com fármaco pelas células Hep G2 é dependente do tempo.

Histórico

O ácido glicirretínico (GA), um tipo de saponina triterpênica, é extraído principalmente das raízes da medicina tradicional chinesa glycyrrhiza [1]. Estudos demonstraram que o GA tem efeitos antimicrobianos, antivirais e anticâncer óbvios e é comumente usado para tratamentos clínicos de hepatite crônica e câncer de fígado [2,3,4]. De acordo com o Sistema de Classificação Biofarmacêutica, o GA é um medicamento do tipo II. Devido à baixa polaridade, alta hidrofobicidade e baixa solubilidade das moléculas de GA, sua biodisponibilidade oral é relativamente baixa [5]. Além disso, o GA pode causar retenção de sódio e perda de potássio [6], que estão associadas à hipertensão, enquanto os efeitos adversos do GA parecem ser dose-dependentes. Portanto, o uso de estratégias de formulação apropriadas para aumentar a absorção e manter a concentração efetiva de GA melhorará significativamente sua biodisponibilidade e segurança.

A superioridade dos lipossomas como carreadores de drogas foi amplamente reconhecida [7,8,9]. Suas vantagens funcionais são demonstradas principalmente através dos seguintes aspectos:(1) os lipossomas apresentam boa biocompatibilidade e segurança; (2) os lipossomas aumentam a distribuição direcionada do fármaco aos nódulos linfáticos e reduzem os efeitos inibidores ou danos que os fármacos anticancerígenos têm nas células e tecidos normais; (3) lipossomas transportadores de droga de tamanho apropriado têm efeitos de permeabilidade e retenção aumentados em locais de tumores sólidos, infecção e inflamação onde a permeabilidade dos vasos sanguíneos capilares é aumentada, demonstrando a capacidade de direcionamento passivo; (4) os lipossomas podem transportar drogas hidrofóbicas e solúveis em água; e (5) a superfície do lipossoma pode ser modificada e ligada a grupos funcionais. Como resultado dessas características vantajosas, muitos medicamentos de lipossoma foram aprovados.

Os produtos obtidos por métodos convencionais de preparação de lipossomas são suspensões aquosas de lipossomas. No entanto, as suspensões aquosas de lipossomas são relativamente instáveis ​​e podem vazar, fundir e sofrer hidrólise de fosfolipídios durante o armazenamento, resultando em capacidade limitada de armazenamento de longo prazo [10]. Atualmente, a forma efetiva de solucionar esses problemas é o preparo de prolipossomos [11]. O prolipossoma é um pó com boa fluidez, feito de componentes e excipientes desidratados de lipossomas. Os lipossomas podem ser reconstruídos dispersando o prolipossoma em água antes da aplicação. A secagem por spray e a liofilização são os dois métodos mais comuns para a preparação de prolipossomos [12], mas têm várias limitações de aplicação. Por exemplo, a secagem por spray não é adequada para medicamentos termossensíveis e muitas vezes pode levar a problemas como aderência à parede devido à baixa eficiência térmica do equipamento. Os rearranjos estruturais das bicamadas lipossomais podem ocorrer durante o processo de spray-drying [13]. O método de liofilização comumente usado é um sistema de suspensão em água, mas a água leva muito tempo para ser liofilizada, portanto, esse método é muito caro e demorado.

Um novo método de preparação de prolipossomos (método de solução de monofase de liofilização) foi desenvolvido nos últimos anos [14, 15]. Este método envolve a dissolução de lipídios, fármaco e lioprotetores solúveis em água em sistemas de co-solvente de álcool terc-butílico (TBA) / água, em seguida, obtenção de prolipossomas por liofilização, após adição de água, formando uma suspensão de lipossoma homogênea. Este método tem várias vantagens:(1) a adição de TBA pode melhorar significativamente a taxa de sublimação do gelo, resultando em uma liofilização rápida e completa que é economicamente favorável. Ao mesmo tempo, a sublimação rápida é benéfica para prevenir o colapso dos caroços [16]. (2) A técnica de solução monofásica de liofilização é um processo de uma etapa, que é um método altamente eficaz para a preparação de lipossomas em grande escala. (3) Embora não listado nas Diretrizes da ICH para solventes residuais, o TBA provavelmente se enquadra na categoria de um solvente de baixa toxicidade classe 3 com base em sua semelhança com LD ₅₀ dados de toxicidade para outros solventes da classe 3 [17]. (4) O pó estéril pode ser obtido por este método. (5) É adequado para medicamentos com baixa solubilidade em água ou baixa estabilidade em água [18].

Houve alguns relatórios sobre o uso do sistema de liofilização TBA / água para a preparação de lipossomas. No entanto, a pesquisa sobre este sistema é inadequada e muitas questões ainda permanecem. Por exemplo, a variação na taxa de sublimação de sistemas de TBA / água com diferentes concentrações, mudanças na propriedade de estado sólido do fármaco específico após a liofilização por sistemas de TBA / água com diferentes concentrações e o processo de hidratação e montagem do pó liofilizado são ainda não está claro. Por outro lado, a solubilidade de um determinado fármaco hidrofóbico em co-solvente TBA / água com diferentes proporções e temperaturas é muito específica. A informação acima é crítica para a formulação e desenho tecnológico de lipossomas carreadores de fármacos. Portanto, no presente estudo, usamos o GA como fármaco modelo para realizar a investigação da pré-formulação conforme descrito acima. Além disso, usando o diâmetro médio e a eficiência de aprisionamento como as medidas de avaliação primárias, otimizamos a formulação e as variáveis ​​de processamento de lipossomas GA preparados pelo método de solução monofásica de liofilização usando o projeto Box-Benhnken. Os efeitos dos tipos de protetores de liofilização sobre a qualidade dos lipossomas foram avaliados, assim como a liberação in vitro de lipossomas e sua captação por células de hepatoma.

Métodos / Experimental

Materiais

O ácido glicirretínico (> 98% puro) foi obtido da Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. (Dalian, China). A fosfatidilcolina de soja (Lipoid S100) foi adquirida à Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemanha). O colesterol foi adquirido na J&K Scientific Ltd. (Pequim, China). O composto de referência de GA foi adquirido no National Institutes for Food and Drug Control (Pequim, China). FITC-PEG-DSPE (peso molecular 2000) foi adquirido de Shanghai Ponsure Biotech, Inc. (Shanghai, China). Álcool tert-butílico (> 98%) e todos os outros reagentes, se não especificado de outra forma, foram adquiridos na Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Pequim, China). Água desionizada foi preparada por um sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA).

Estudo de solubilidade de GA, SPC e colesterol em TBA / sistema de co-solvente de água

As soluções saturadas de TBA-água (30 ml) de GA com diferentes percentuais de volume de TBA foram preparadas pela agitação de um excesso de droga no veículo correspondente a 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C e 45 ° C por 72 h. Após centrifugação (15 min a 3000 rpm), o sobrenadante foi passado por filtros microporosos de 0,45 μm. A solubilidade de saturação de GA foi medida por HPLC após diluição adequada. Três repetições foram realizadas em cada co-solvente TBA / água. A análise de HPLC foi realizada em um sistema de HPLC LabAlliance (modelo Series III) (Lab Alliance, Tianjin, China) equipado com uma bomba quaternária, um amostrador automático e um compartimento de coluna, acoplado a um detector de UV. A separação foi realizada em uma coluna C18 (4,6 mm × 250 mm; 5 μm; Dikma Technologies, Pequim, China); metanol e água (90:10 V / V ) foram usados ​​como fase móvel a uma taxa de fluxo de 1,0 ml / min. Os analitos foram detectados por detector de UV a 250 nm.

A solubilidade da fosfatidilcolina de soja (SPC) (ou colesterol) no sistema de co-solvente TBA / água foi estimada usando o método turbidimétrico [19, 20]. Resumidamente, 10 mg de SPC (ou colesterol) foram dissolvidos em TBA a 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C e 45 ° C para obter uma solução límpida; a temperatura foi mantida durante todo o experimento. Uma quantidade crescente de água purificada na mesma temperatura foi adicionada à solução de TBA de SPC (ou colesterol) a 25 ° C até a turbidez ocorrer pela primeira vez e o valor de volume de água crítico foi registrado. A turbidez pode ser identificada detectando o valor de absorção a 655 nm (> 0,04) contra a solução em branco (água purificada) em um espectrofotômetro UV-Vis modelo T6 (Purkinje General Instrument Co., Ltd., Pequim).

Preparação de lipossomas usando o método de solução monofásica de liofilização

GA, SPC e colesterol foram dissolvidos em TBA a 45 ° C, e lioprotetor solúvel em água, como manitol, lactose, sacarose e trealose, foi dissolvido em água a 45 ° C. Em seguida, essas duas soluções foram misturadas em proporções apropriadas para obter uma terceira solução monofásica isotrópica límpida (volume total 60 ml). Depois que a solução monofásica foi esterilizada por filtração através de poros de 0,22 μm, ela foi colocada em frascos de liofilização de 10 ml com um volume de enchimento de 2,0 ml. Após pré-congelamento por 12 h a -40 ° C, a liofilização foi realizada a uma temperatura de prateleira de -50 ° C por 24 h com uma pressão de câmara de 1–20 Pa em um liofilizador (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., China).

Medição do tamanho da partícula e eficiência de encapsulamento de lipossomas

A suspensão de lipossomas foi preparada adicionando 5 mg de pó de prolipossomas a 5 ml de água purificada e subsequente agitação em vórtice durante 1 min duas vezes com um intervalo de 15 min para hidratação completa. A análise do tamanho dos lipossomas foi caracterizada pelo uso de analisador de tamanho de partícula a laser (Nano ZS90 Malvern Instruments, UK).

A eficiência de encapsulação de GA em lipossomas foi determinada pela técnica de ultrafiltração-centrifugação. Resumidamente, pipete 1 ml de dispersão lipossomal (500 μg de prolipossomas em 5 ml de água purificada) em um frasco volumétrico de 10 ml, seguido pela adição de 5 ml de água purificada, 2 ml de acetona e dilua para 10 ml com água purificada. Transferir 0,5 ml desta suspensão para a câmara superior do filtro de centrifugação (Amicon Ultra-0,5, Millipore, Cdduounty Cork, Irlanda) com peso molecular de corte de 50 kDa, que foi centrifugado a 10.000 rpm por 30 min a 15 ° C usando uma ultracentrífuga (CP70MX, Hitachi Koki Co., Ltd., Japão). Em seguida, 20 μl de ultrafiltrado foram injetados no sistema de HPLC em um comprimento de onda de absorção de UV de 250 nm, e o conteúdo de GA foi denominado conteúdo de droga livre. A eficiência de encapsulamento (EE) foi calculada de acordo com as seguintes equações
$$ \ mathrm {EE} \ left (\% \ right) =\ frac {W _ {\ mathrm {total}} - {W} _ {\ mathrm {free}}} {W _ {\ mathrm {total}}} \ vezes 100 $$ (1)
onde W _grátis é a quantidade de droga gratuita e W _total é a quantidade total do medicamento.

Determinação da taxa de sublimação de misturas de TBA / água

Um mililitro de misturas de TBA / água de diferentes porcentagens de volume de TBA (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% e 90%) foram colocados em frascos de liofilização de 10 ml , respectivamente. As misturas de TBA / água foram pré-congeladas a -40 ° C por 12 h e então liofilizadas por liofilizador (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., China) a -50 ° C. O tempo foi registrado quando as misturas de TBA / água desaparecem completamente dos frascos de liofilização, e a taxa de sublimação foi calculada dividindo o volume (μl) pelo tempo (min).

Determinação da pressão de vapor saturada de misturas de TBA / água

Os detalhes do aparato experimental e o procedimento de operação foram descritos em outro lugar [21, 22]. As pressões de vapor do sistema TBA / água (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% e 90%) foram medidas por um método estático. O aparelho era composto de um ebuliômetro de trabalho preenchido com a mistura TBA / água, um ebuliômetro de referência preenchido com água pura, um recipiente tampão, dois condensadores, duas medições de temperatura e um sistema de controle de pressão. A pressão de equilíbrio do sistema foi determinada pela temperatura de ebulição da água pura no ebuliômetro de referência em termos da relação temperatura-pressão representada pela equação de Antoine [23].

Determinação da solubilidade de GA

A solubilidade em água de GA livre foi determinada pela adição de excesso de GA (10 mg) a 10 ml de água pura sob agitação magnética (300 rpm) em um banho de água termostaticamente controlado (DF-101S, Henan Yuhua instrument Co., Ltd., China) a 25 ° C até o equilíbrio ser alcançado (48 h). As amostras foram filtradas através de um filtro de membrana de 0,45 μm, adequadamente diluídas com metanol e analisadas por HPLC [24]. As experiências foram realizadas em triplicado.

Observação da morfologia da superfície de misturas de água / TBA pré-congeladas

Cinco mililitros de misturas de água / terc-butanol foram vertidos em uma placa de Petri de 90 mm, em seguida, foram congelados na armadilha de frio (-40 ° C); as amostras congeladas foram observadas usando um microscópio óptico XSP-4C (Shanghai Changfang Optical Instrument Co. Ltd., Shanghai, China).

Microscopia Eletrônica de Transmissão

O aparecimento de lipossomas foi observado por microscopia eletrônica de transmissão Hitachi HT7700 (TEM) (Hitachi, Japão) a uma voltagem de aceleração de 100 kV. A suspensão de lipossomas foi obtida adicionando 5 mg de pó de prolipossomas a 5 ml de água purificada à temperatura ambiente, misturada por vórtice durante 10 s e depois deixada em repouso durante 30 s. Uma gota foi retirada com uma micropipeta e então colocada em uma grade de cobre revestida com carbono. O excesso da suspensão foi removido borrando a grade com um papel de filtro. Coloração negativa usando uma solução de ácido fosfotúngstico a 1% ( w / w , pH 7,1) foi feita diretamente no depósito. O excesso foi removido com papel de filtro e o depósito foi deixado secar antes da análise.

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

Os espectros de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) das amostras foram obtidos em um espectrofotômetro Nicolet 6700 FTIR (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Cada amostra e cada brometo de potássio foram misturados em um almofariz de ágata e compactados em um disco fino. O intervalo de varredura foi de 4000–400 cm ⁻¹ e a resolução era de 4 cm ⁻¹ .

Calorimetria diferencial de varredura

As medições de calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram realizadas em um calorímetro de varredura HSC-1 DSC (Hengjiu Instrument, Ltd., Pequim, China). Amostras de 15 mg foram colocadas em recipientes de alumínio e seladas na prensa de recipientes de amostra. As sondas foram aquecidas de 25 a 350 ° C a uma taxa de 10 ° C / min sob atmosfera de nitrogênio.

Difração de raios-X

As propriedades estruturais das amostras foram obtidas utilizando o difratômetro de raios X D8 Focus (Bruker, Alemanha) com radiação Cu-Kα. As medições foram realizadas com tensão de 40 kV e 40 mA. As amostras foram varridas de 5 ° a 60 °, e a taxa de varredura foi de 5 ° / min.

Estabilidade do Prolipossoma GA

Os pós de prolipossomas de GA foram transferidos para uma garrafa de vidro, cheia de nitrogênio, selada e armazenada ao abrigo da luz em temperatura ambiente. O teste de estabilidade foi realizado durante 6 meses usando a eficiência de aprisionamento e o tamanho de partícula dos lipossomas reconstituídos como os índices.

Liberação de droga in vitro

A liberação de GA dos lipossomas foi observada usando o método de diálise a 37 ± 0,5 ° C. Após reconstituir os lipossomas em PBS (pH 7,4) ou solução salina normal para fazer 0,5 mg / ml de GA, uma alíquota de cada dispersão lipossomal (5 ml) foi colocada em um saco de diálise (peso molecular limite de 8000-14.000 Da) e foi hermeticamente selado. Em seguida, o tubo foi imerso em 150 ml de meio de liberação, PBS (pH 7,4) ou solução salina normal contendo 0,1% ( v / v ) Tween 80 para manter a condição de dissipador [25, 26]. Enquanto se agitava o meio de liberação usando o agitador magnético a 300 rpm, amostras (1,5 ml) foram retiradas em intervalos de tempo predeterminados do meio de liberação por 12 h, que foi recarregado com o mesmo volume de meio fresco. A concentração de GA foi determinada por HPLC após diluição apropriada com metanol.

Captação celular in vitro

Os lipossomas de fluorescência foram preparados pelo método de solução de monofase de liofilização. Resumidamente, uma mistura de 30 mg de GA, 254 mg de SPC, 75,5 mg de colesterol e 21,2 mg de FITC-PEG-DSPE foram dissolvidos em TBA. Além disso, 1016 mg de trealose foram dissolvidos em água. Em seguida, essas duas soluções foram misturadas para obter uma solução monofásica límpida (volume total 30 ml). Depois que a solução monofásica foi esterilizada por filtração através de poros de 0,22 μm, ela foi preenchida em frascos de liofilização de 10 ml com um volume de enchimento de 2,0 ml, então liofilizada por 24 h e adicionada água para reconstituir os lipossomas até o uso.

As células HepG2 (Wanleibio, Co., Ltd., Shenyang, China) foram cultivadas em DMEM com FBS a 10% (soro fetal bovino). As células foram semeadas até 90% de confluência em placas de 6 poços, e as células foram cultivadas em uma incubadora umidificada a 37,0 ° C com 5,0% de CO ₂ . Após incubação de 24 horas, 200 μl de suspensão de FITC-GA-lipossomas foram adicionados a 1 ml da suspensão de células HepG2 (1 × 10 ⁴ células por poço). Após a incubação por 0,5 h, 1 h, 2 h e 4 h, as células foram lavadas três vezes com PBS de pH 7,4 e a fluorescência extracelular foi extinta com 0,4% ( w / v ) Solução de azul tripano. As células foram lisadas com 1% ( w / v ) Triton X100. A intensidade de fluorescência do lisado celular com excitação de 495 nm e emissão de 520 nm foi medida usando um espectrofotômetro de fluorescência RF5301 (Shimadzu, Tóquio, Japão). Os valores de fluorescência relativa foram convertidos em concentrações de fosfolipídios com base em uma curva padrão de concentração de fosfolipídios versus intensidade de fluorescência FITC medida no tampão de lise celular. A concentração de proteína foi determinada usando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EUA). A captação foi expressa como a quantidade de fosfolipídios versus proteína celular por miligramas [27].

Resultados e discussão

Estudo de pré-formulação

Estudo de solubilidade

Uma vez que os lipossomas são preparados usando o método de solução de monofase de liofilização, um estudo de solubilidade foi realizado para garantir que o fármaco e o material transportador pudessem se dissolver na solução de TBA / água antes da liofilização.

A Figura 1 mostra as mudanças na solubilidade saturada de GA no sistema de co-solvente TBA / água com diferentes percentuais de volume. Dentro de 25 ° C a 45 ° C, a solubilidade saturada de GA aumentou continuamente com o aumento da porcentagem de volume de TBA de 10 a 60%, e a solubilidade saturada de GA foi> 0,5 mg / ml quando a porcentagem de volume de TBA foi> 40%. Por outro lado, a solubilidade saturada do GA aumentou com o aumento da temperatura da solução TBA / água, quando mantida na mesma porcentagem de volume. A diferença na solubilidade sob diferentes temperaturas tornou-se cada vez mais aparente quando a porcentagem de volume de TBA atingiu 30%. A solubilidade de fosfolipídios de soja e colesterol no sistema de co-solvente TBA / água é mostrada no gráfico de colunas empilhadas (Fig. 2). A Figura 2a, b representa o volume da mistura de TBA / água necessária para que uma unidade (1 mg) de fosfolipídios e colesterol alcance a solubilidade saturada sob diferentes temperaturas, respectivamente. A área cinza representa o volume de água e a área preta representa o volume de TBA. À medida que a temperatura aumentou gradualmente de 25 para 45 ° C, o volume total de co-solvente TBA / água e a porcentagem de volume de TBA (rótulos nas colunas) necessária para dissolver 1 mg de fosfolipídeo diminuiu gradualmente (Fig. 2a). À medida que a temperatura aumentou além de 35 ° C, o volume de TBA necessário reduziu significativamente e ficou abaixo de 0,15 ml. Da mesma forma, à medida que a temperatura aumentou gradualmente de 25 para 45 ° C, houve uma redução no volume de TBA necessário para dissolver 1 mg de colesterol, enquanto a porcentagem de volume de TBA mostrou uma tendência de diminuição gradual. Os resultados acima demonstraram que a temperatura e a porcentagem de volume de TBA afetam muito a solubilidade de fosfolipídios, colesterol e GA.

Solubilidade saturada de GA em co-solvente de TBA / água com porcentagem de volume diferente (média ± DP, n =3)

Solubilidade de SPC ( a ) e colesterol ( b ) em cossolvente TBA / água com porcentagem de volume diferente

Comparação da taxa de sublimação do sistema de cossolvente de água / TBA com porcentagem de volume diferente

A taxa de sublimação afeta diretamente a eficiência da produção do pó liofilizado. Uma taxa de sublimação mais rápida é mais econômica e pode evitar o colapso de materiais [16]. Neste estudo, examinamos as taxas de sublimação de diferentes concentrações de sistemas TBA / água. Como mostrado na Fig. 3, a taxa de sublimação do solvente misto aumentou gradualmente à medida que a porcentagem de volume de TBA aumentou de 10 para 90%. Além disso, a taxa de sublimação atingiu acima de 10 μl / min, pois a porcentagem de volume excedeu 60%.

Taxa de sublimação de co-solvente TBA / água com porcentagem de volume diferente (média ± DP, n =3)

A fim de identificar a razão para a diferença na taxa de sublimação de TBA com diferentes percentuais de volume, examinamos primeiro a morfologia da superfície das amostras congeladas. A Figura 4 contém as imagens microscópicas ópticas da solução de TBA / água com 40% a 80% de porcentagem de volume (TBA com <30% de porcentagem de volume não pôde ser examinado porque derreteu rapidamente sob o microscópio óptico). Comparado com o TBA com porcentagem de volume de 40%, o TBA com volume> 50% tem estruturas em forma de agulha claras e dispersas. Especulamos que à medida que a porcentagem de volume de TBA aumenta, o diâmetro dos cristais em forma de agulha torna-se menor, resultando em um aumento na área de superfície específica e, portanto, um aumento na taxa de sublimação.

Morfologia da superfície do cossolvente TBA / água de diferentes percentuais de volume de TBA por microscópio óptico (ampliação × 100). a 40%. b 50%. c 60%. d 70%. e 80%

Além disso, também medimos a pressão de vapor saturado do sistema de co-solvente TBA / água com diferentes percentuais de volume a 25 ° C. A Figura 5 é um gráfico de barras das mudanças na pressão de vapor saturado do sistema de co-solvente TBA / água com diferentes percentuais de volume de TBA. Conforme mostrado na figura, a pressão de vapor saturado do solvente misto tende a aumentar gradualmente à medida que a porcentagem de volume de TBA aumenta. Como a temperatura está positivamente correlacionada com a pressão de vapor saturado, de acordo com a equação de Antoine (Eq. 2), podemos deduzir que a pressão de vapor saturado do sistema de co-solvente sob temperatura de liofilização (-50 ° C) aumentará conforme a porcentagem de volume de TBA aumenta, e esta pode ser uma das razões para o aumento gradual da taxa de sublimação.
$$ {\ log} _ {10} p =A- \ frac {B} {T} $$ (2)
onde p é a pressão de vapor, T é a temperatura, A e B são constantes específicas do componente.

Pressão de vapor saturado de TBA / co-solvente de água com porcentagem de volume diferente (média ± SD, n =3)

Efeito da liofilização nas propriedades físicas e químicas do GA no sistema de cossolvente TBA / água com porcentagem de volume diferente

A fim de investigar o efeito da liofilização nas propriedades físico-químicas do GA no sistema de co-solvente TBA / água, o seguinte experimento foi realizado. Dez miligramas de GA foram dissolvidos em 8 ml de TBA / co-solvente de água de diferentes percentagens de volume de TBA (40%, 50%, 60%, 70% e 80%). Depois que a solução monofásica foi esterilizada por filtração através de poros de 0,22 μm, ela foi colocada em frascos de liofilização de 10 ml com um volume de enchimento de 2,0 ml. A liofilização foi realizada a -50 ° C durante 24 h por liofilizador.

Os espectros de DSC do pó liofilizado após dissolução de GA no sistema de co-solvente TBA / água com porcentagem de volume de TBA diferente são mostrados na Fig. 6a. A curva DSC do fármaco bruto mostra um pico endotérmico óbvio a 301 ° C, que é o ponto de fusão do GA. A liofilização em sistema de co-solvente TBA / água com porcentagem de volume de TBA diferente causou um deslocamento para a frente do pico de fusão GA. A magnitude da mudança do pico de fusão aumentou conforme a porcentagem de volume de TBA diminuiu.

DSC ( a ), XRD ( b ), e FTIR ( c ) de GA após liofilização em co-solvente TBA / água com diferentes percentuais de volume; (a) GA, (b) 40% TBA, ( c ) 50% TBA, (d) 60% TBA, (e) 70% TBA, e (f) 80% TBA

Pesquisas anteriores já mostraram que a concentração de TBA pode afetar profundamente a formação de uma mistura complexa de fases cristalinas, amorfas ou metaestáveis ​​[28]. Em alguns casos, o uso de TBA pode resultar em redução da cristalinidade, e outro caso é o oposto [29].

Os espectros de difração de raios-X (XRD) do pó liofilizado após dissolução de GA em sistema de co-solvente de TBA / água com porcentagem de volume de TBA diferente são mostrados na Fig. 6b. O espectro de XRD do fármaco bruto mostra vários picos de difração de cristal distintos entre 5 ° e 20 °. A liofilização em sistema de co-solvente TBA / água com diferentes percentuais de volume de TBA causou o desaparecimento dos picos de difração de 5 ° a 20 ° nos espectros de XRD das amostras. Isso indicava que o cristal original da droga havia se tornado amorfo.

Os espectros de FTIR do pó liofilizado após dissolução de GA no sistema de co-solvente de TBA / água com diferentes percentuais de volume de TBA são mostrados na Fig. 6c. A forma do espectro de FTIR do fármaco bruto é consistente com aqueles do pó liofilizado no sistema de co-solvente TBA / água com porcentagem de volume de TBA diferente dentro de 4000–400 cm ⁻¹ alcance. Não houve surgimento de picos característicos para novos grupos funcionais, demonstrando que a estrutura química do GA permaneceu a mesma após a liofilização em TBA com diferentes percentuais de volume.

A mudança de uma forma cristalina para uma forma amorfa pode alterar a solubilidade do fármaco, afetando assim o encapsulamento do prolipossoma durante a reconstrução hidratada. Neste estudo, medimos a solubilidade aquosa do pó de GA liofilizado a 25 ° C. Descobrimos que a solubilidade saturada do GA liofilizado em água diminuiu gradualmente de 64,10 para 19,27 μg / ml conforme a porcentagem de volume de TBA aumentou de 40 para 80%. No entanto, ainda era significativamente maior do que a solubilidade em água do fármaco bruto (6,36 μg / ml), indicando que a mudança de uma estrutura cristalina para uma amorfa durante a liofilização afeta a solubilidade do fármaco bruto (Fig. 7).

Solubilidade aquosa de liofilização de GA em co-solvente de TBA / água com porcentagem de volume diferente (média ± DP, n =3)

Experiência de fator único

Existem muitos fatores que podem influenciar a qualidade dos lipossomas. É bem conhecido que as relações fosfolipídio / fármaco têm efeito na qualidade do encapsulamento do fármaco [30]. Quantidades moderadas de colesterol podem aumentar o arranjo ordenado da membrana lipídica e a estabilidade. No entanto, alto teor de colesterol no lipossoma pode diminuir a flexibilidade da membrana e, assim, impedir a penetração do fármaco na bicamada lipídica [31]. In this study, we selected three factors that impact on liposome quality and performed a single-factor study to determine the appropriate values for subsequent optimization tests, including quantity of SPC, quantity of cholesterol, and volume percentage of TBA in the co-solvent. The quality of liposomes was evaluated in terms of encapsulation efficiency and mean diameter. Each experiment was performed in triplicate with all other parameters set to constant value, GA 60 mg, pre-freeze temperature − 40 °C, pre-freeze time 12 h. In this study, we compared the results via a scoring system, giving equal weight to both encapsulation rate and mean diameter. Scoring was conducted as follows:
$$ \mathrm{Score}=\frac{\mathrm{EE}}{\mathrm{MEE}}\times 50\%-\frac{\mathrm{MD}}{\mathrm{MMD}}\times 50\% $$ (3)
where EE is encapsulation efficiency, MEE is maximum encapsulation efficiency of the group, MD is mean diameter, and MMD is maximum mean diameter of the group.

The experimental design and result are shown in Table 1. As can be seen in the table, within the range tested in this experiment, the highest score can be obtained separately when the amount of SPC is 480 mg (drug-SPC ratio of 1:8, w / w ), the amount of cholesterol is120 mg (cholesterol-SPC ratio of 1:4, w / w ), and volume percentage of TBA in the co-solvent is 50%. Therefore, these parameters were chosen as the center level of response surface optimization design, respectively.

Parameter Optimization by Box-Benhnken Design

To further study the interactions between the various factors, parameter optimization was performed by Box-Benhnken design. Based on the results of single-factor experiments, we investigated and optimized the interactions between the parameters, including quantity of SPC (X ₁ ), quantity of cholesterol (X ₂ ), volume percentage of TBA (X ₃ ) by Box-Benhnken design (BBD). Encapsulation efficiency (Y ₁ ) and mean diameter (Y ₂ ) were selected as responses. Optimization process was undertaken with desirability function to optimize the two responses simultaneously. We suppose that Y ₁ e Y ₂ have the same weightiness (importance). Y ₁ had to be maximized, while Y ₂ had to be minimized. The desirable ranges are from 0 to 1 (least to most desirable). Experimental design and results are shown in Table 2. To find the most important effects and interactions, analysis of variance (ANOVA) was calculated by statistical software, Design Expert trial version 8.03 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA). Two quadratic models were selected as suitable statistical model for optimization for two responses encapsulation efficiency and mean diameter. The results of ANOVA relating encapsulation efficiency as response were shown in Table 3, indicating that the model was significant for all factors investigated with F value of 12.81 (P <0,05). In this case, X ₁ , X ₂ , X ₁ X ₂ , X ₁ X ₁ , X ₂ X ₂ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that the influences of the factors (X ₁ e X ₂ ) on encapsulation efficiency were not simply linear. The interaction terms were notably significant, indicating good interactions between the factors. On the contrary, the ANOVA results relating mean diameter as response (Table 3) indicated that the model was not significant for all factors investigated with F value of 1.9 (P  > 0.05). In this case, X ₃ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that volume percentage of TBA have significant influence on mean diameter, while quantity of SPC (X ₁ ) and quantity of cholesterol (X ₂ ) do not have a significant effect (P  > 0.05). Moreover, there were no significant interactions between the three variables.

In order to provide a better visualization of the effect of the independent variables on the two responses and desirability value, three-dimensional profiles of multiple non-linear regression models are depicted in Fig. 8. Figure 8a–f presented the interaction of X ₁ , X ₂ e X ₃ under encapsulation efficiency and mean diameter as response respectively. The three-dimensional profiles demonstrated how three pairs of parameters affect the encapsulation efficiency and mean diameter of reconstituted liposomes. For encapsulation efficiency, all the three surfaces are upper convex (Fig. 8a–c), with a maximum point in the center of the experimental domain, which demonstrated that there are good interactions between the three variables. For mean diameter, the shape of Fig. 8d is similar to flat surface, indicating that X ₁ e X ₂ have less effect on mean diameter. The surface contours of Fig. 8e, f both showed a slope; the mean diameter was decreased by increasing the volume percentage of TBA, indicating that factor X ₃ had an obvious effect on mean diameter but there was no obvious interaction between X ₃ and the other two factors.

Three dimensional plots of the effect of X X (a ), X X (b ) and X X (c ) on encapsulation efficiency and the effect of X X (d), X X (e) and X X (f) on mean diameter

Based on the quadratic model, the optimal conditions for liposomes preparation calculated by software were as follows:508 mg phospholipid quantity, 151 mg cholesterol quantity, and 55% volume percentage of TBA. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were found to be 68.55% and 220 nm, respectively.

Selection of the Type and Dosage of Lyoprotectant

Competition for liquid water between the growing ice crystals and the hydrophilic substances (including the hydrophilic portion of the lipid membrane) during freezing leads to adhesion of ice crystals to the phospholipid groups. This can result in damage to the lipid membrane. Lipid membrane fusion following rehydration causes an increase in particle size and leakage of encapsulated drug. Lyoprotectant can reduce liposomal damage during the freeze-thaw process [32]. In this study, we investigated the effect of various types (lactose, sucrose, trehalose, mannitol) and dosage (lyoprotectant to SPC ratio was 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, and 6:1 w / w ) of lyoprotectant on scores of reconstituted liposome. Single-factor experiments were performed while maintaining all other variables constant:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, pre-freeze temperature of − 40 °C, pre-freeze time of 12 h. Experimental results are shown in Fig. 9. The encapsulation efficiency increases firstly and then decreases by decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio from 1:2 to 1:6, wherein lactose, sucrose, and mannitol are respectively used as lyoprotectant. However, the encapsulation efficiency of the trehalose group increases constantly with decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio (Fig. 9a). In terms of the mean diameter (Fig. 9b), it was found that the mean diameter was greater than 218 nm for lactose, sucrose, and mannitol group in the range from 1:2 to1:6. Nevertheless, the mean diameter of trehalose group can be reduced to less than 190 nm when lyoprotectant/SPC weight ratio is more than 4:1; obviously, the protective effect of trehalose is better than other lyoprotectants tested. Trehalose has a good protection ability for membrane, perhaps because of the formation of hydrogen bonds with the polar head groups of lipids, and disruption of the tetrahedral hydrogen bond network of water [33]. According to scores (Fig. 9c), the highest score (0.24) was obtained when trehalose/SPC weight ratio is 4:1 and 6:1. Finally, we choose trehalose and 4:1 (trehalose/SPC weight ratio) for following experiments from the perspective of cost and increasing drug loading.

The effect of mass ratio between cryoprotectant and SPC on encapsulation efficiency (a ), mean diameter (b ) and scores (c ) of reconstituted liposomes (mean  ±  SD, n =3)

Through the above Box-Benhnken design and lyoprotectant screening experiment, the experimental conditions were determinated:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, weight ratio of trehalose to SPC was 4:1. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were 74.87% and 191 nm, respectively.

Transmission Electron Microscopy

In this study, TEM of liposomes suspension was taken at the same time point (same hydration time). We have observed different states in the sample, which could explain the self-assembly behavior of the liposomes. Figure 10a shows the initial state of hydration; it can be seen that a large amount of GA (black dots) is wrapped in dispersed phospholipids (translucent material), and spontaneous aggregation of the phospholipid fragments occurs. Figure 10b shows the morphology of fully assembled liposomes (average diameter of about 200 nm), which were nearly spherical with a phospholipid bilayer structure (the light-gray portion). Moreover, the drug particles (dark gray dots) were entrapped in the lipid bilayer.

Transmission electron micrographs of reconstituted liposomes, (a ) initial state of hydration of proliposomes, (b ) fully assembled liposomes

Stability of GA Proliposome

After 6 months, the proliposome powders have a good mobility and an unaltered appearance. The liposome suspension formed automatically when in contact with purified water. The entrapment efficiency and particle size of the reconstituted liposome were 72.82% and 198 nm. There is no significant difference from the data of the reconstituted liposome 6 months before. Therefore, the GA proliposome could be considered stable at 25 °C for over 6 months.

In Vitro Drug Release Studies

Evaluation of in vitro drug release from encapsulated liposome was done by dialysis method. The in vitro release profiles of GA from GA-loaded liposomes at 37 °C in PBS (pH 7.4) and physiological saline solution are shown in Fig. 11. The release profile of both group showed a fast release (the larger slope) within 1 h, then curve slope becomes smaller after 1 h, the release rate begins to slow down. The drug-release curve shapes of physiological saline solution group are similar to PBS group. The in vitro release of GA from the GA-loaded liposomes was 65.25 ± 4.82% and 69.46 ± 4.32% from PBS and physiological saline solution in 12 h. No significant difference (P  = 0.088, paired t test, SPSS software17.0) was found for the release of GA at different release medium over the entire study period, which demonstrated that the reconstituted liposomes have both sustained-release performance in two kinds of release medium.

In vitro dissolution profiles of GA from GA-loaded liposomes in a PBS and b physiological saline solution (mean ± SD, n  = 3)

In Vitro Cell Uptake

Figure 12a showed that the uptake process of GA-liposomes by Hep G2 cells is time-dependent under the experimental concentrations. After incubation for 30 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) by Hep G2 cells were 1480 ng. In the range from 30 to 240 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) were gradually increased from 1480 to 2030 ng. Figure 12b–e showed fluorescence microscopy images of Hep G2 cells at 30, 60, 120, and 240 min after ingestion of drug-loaded liposomes, and it is observed that the fluorescence intensity is also gradually increased over time. This result indicates that the reconstituted liposomes prepared by monophase solution method can be effectively uptaken by the hepatoma cells.

In vitro cellular uptake of GA-loaded liposomes by Hep G2 cells. a The uptake amount versus incubation time. b - e Fluorescence microscopy images at 30, 60, 120, and 240 min

Conclusions

In the present work, preformulation investigation, formulation design along with in vitro characterization of GA-loaded liposomes by lyophilization monophase solution method have been done. After carrying out a preformulation study, we found that solubility of GA, cholesterol, and SPC in TBA/water co-solvent was substantially increased when temperature was over 40 °C. Sublimation rate of co-solvent gradually increased with increasing TBA volume percentage, which perhaps relate to surface morphology of the frozen co-solvent and saturated vapor pressure. After lyophilization using TBA/water co-solvent system, GA became amorphous structure; moreover, water solubility increased. This may have an effect on proliposome encapsulation during hydrated reconstruction. After optimization by Box-Benhnken design and screening of lyoprotectant, the optimum conditions (508 mg SPC, 151 mg cholesterol, 55% volume percentage of TBA, 4:1 trehalose/SPC weight ratio) for lyophilization monophase solution process were achieved. Under the optimum conditions, satisfactory encapsulation efficiency (74.87%) and mean diameter (191 nm) of reconstituted liposomes were obtained. The reconstituted liposomes resulted in initial assemble and final spherical shape, as confirmed by TEM analysis. The in vitro release profile of the produced GA-loaded liposome was investigated in the two media and it both showed prolonged release during 12 h. Cellular uptake studies showed that the uptake process of reconstituted liposomes by Hep G2 cells is time-dependent.

Abreviações

BBD:

Box-Benhnken design

DSC:

Calorimetria de varrimento diferencial

EE:

Encapsulation efficiency

FTIR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

GA:

Glycyrrhetinic acid

MD:

Mean diameter

SPC:

Soybean phosphatidylcholine

TBA:

Tert-butyl alcohol

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

XRD:

Difração de raios X

Inibidor de autofagia (LY294002) e 5-fluorouracil (5-FU) Nanolipossoma baseado em combinação para eficácia aprimorada contra carcinoma de células escamosas de esôfago Nanoencapsulação de óleo:desenvolvimento, aplicação e incorporação no mercado de alimentos