Otimização de Lipossomas de Ácido Glicirretínico via Liofilização Monofásica: Pré-Formulaçăo, Desenho e Avaliaçăo In Vitro

Resumo

Neste estudo, lipossomas de ácido glicirretínico (AG) foram formulados com sucesso usando método de liofilização monofásica. Trabalho de pré-formulação examinou solubilidade de fosfatidilcolina de soja (PCS), colesterol e AG em co-solventes álcool tert-butílico/água (ATB/água). Investigamos como porcentagem de volume de ATB influencia taxa de sublimação, e caracterizamos AG liofilizado por DSC, XRD e FTIR. XRD indicou estado amorfo para AG, enquanto FTIR confirmou que nenhuma mudança química ocorreu. Testes de solubilidade revelaram aumento marcante na solubilidade aquosa de AG. Usando desenho Box-Behnken e seleção de liooprotetor, identificamos formulaçăo ótima — 508 mg PCS, 151 mg colesterol, 55% ATB, e razăo peso trealose/PCS 4:1. Nestes condiçőes, lipossomas reconstituídos exibiram eficięncia de encapsulamento de 74,87% e diâmetro médio de 191 nm. Estudos de liberaçăo in vitro mostraram liberaçăo sustentada em dois meios, e ensaios de captaçăo celular demonstraram captaçăo tempo-dependente por células Hep G2.

Contexto

Ácido glicirretínico (AG), triterpeno saponina extraído de raízes de Glycyrrhiza, exibe atividade antimicrobiana, antiviral e anticancerígena e é clinicamente usado para hepatite crônica e câncer de fígado. Segundo Sistema de Classificaçăo Biofarmacêutica, AG é fármaco classe II; sua baixa polaridade, alta hidrofobicidade e pobre solubilidade limitam biodisponibilidade oral e podem causar retençăo de sódio e perda de potássio dependentes de dose, levando a hipertensăo. Aumentar absorçăo e manter concentraçőes terapęuticas através de formulaçăo direcionada é portanto essencial.

Lipossomas săo amplamente reconhecidos por sua biocompatibilidade, capacidade de alvo a linfonodos e sítios tumorais via efeito de permeaçăo e retençăo aumentada, e versatilidade no transporte de fármacos hidrofóbicos e hidrofílicos. No entanto, suspensőes aquosas convencionais de lipossomas săo instáveis, propensas a vazamento, fusăo e hidrólise de fosfolipídios, o que prejudica armazenamento a longo prazo. Prolipossomas — pós fluidos secos que reconstituem em lipossomas upon hidrataçăo — oferecem soluçăo. Produçăo tradicional de prolipossomas por spray-drying ou freeze-drying tem desvantagens: spray-drying pode danificar fármacos termossensíveis, e freeze-drying é demorado e custoso devido ŕ remoçăo prolongada de água.

Inovaçăo recente, método de liofilizaçăo monofásica, dissolve lipídios, fármaco e liooprotetor solúvel em água em co-solvente álcool tert-butílico/água, então liofilizaçăo produz pó seco que espontaneamente forma lipossomas quando água é adicionada. Vantagens incluem sublimaçăo rápida, processamento em uma etapa adequado para produçăo em larga escala, baixo risco de solvente residual (ATB é classe 3), saída de pó estéril e compatibilidade com fármacos pouco solúveis em água ou instáveis.

Apesar destes benefícios, lacunas de conhecimento permanecem: impacto de concentraçăo ATB/água na taxa de sublimaçăo, mudancas de estado sólido do fármaco pós-liofilizaçăo, e processo de montagem por hidrataçăo do pó. Este estudo usa AG como modelo para abordar estas questőes, otimizando variáveis de formulaçăo e processo via desenho Box-Behnken, avaliando efeitos de liooprotetor, e avaliando liberaçăo in vitro e captaçăo celular.

Métodos / Experimental

Materiais

Ácido glicirretínico (≥ 98% pureza) obtido da Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. Fosfatidilcolina de soja (Lipoid S100) e colesterol obtidos da Lipoid GmbH e J&K Scientific Ltd., respectivamente. FITC-PEG-DSPE (PM 2000) da Shanghai Ponsure Biotech, Inc. Álcool tert-butílico (≥ 98%) e todos outros reagentes comprados da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Água deionizada produzida por sistema Milli-Q.

Estudos de Solubilidade

Soluçőes saturadas de AG, PCS e colesterol preparadas em misturas ATB/água a temperaturas de 25 °C a 45 °C. Solubilidade de AG quantificada por HPLC usando coluna C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm) e fase móvel metanol/água (90:10 v/v) a 1,0 ml min⁻¹, detectando a 250 nm. Solubilidade de PCS e colesterol estimada via método turbidimétrico, monitorando absorbância a 655 nm.

Preparaçăo de Soluçăo Monofásica para Liofilizaçăo

AG, PCS e colesterol dissolvidos em ATB a 45 °C; liooprotetor selecionado (manitol, lactose, sacarose ou trealose) dissolvido em água a 45 °C. Duas soluçőes misturadas para produzir soluçăo monofásica isotrópica (60 ml). Após filtraçăo (0,22 µm), alíquotas de 2,0 ml colocadas em frascos de liofilizaçăo de 10 ml, pré-congelados a -40 °C por 12 h, e liofilizados a -50 °C por 24 h (pressăo câmara 1-20 Pa).

Tamanho de Partícula e Eficięncia de Encapsulamento

Lipossomas reconstituídos preparados dispersando 5 mg de pó prolipossoma em 5 ml água purificada, vortex por 1 min, repetindo após 15 min. Tamanho medido por espalhamento dinâmico de luz (Nano ZS90, Malvern). Eficięncia de encapsulamento (EE) determinada por ultrafiltraçăo-centrifugaçăo: 1 ml de dispersăo filtrado através de filtro 50 kDa MWCO, filtrado quantificado por HPLC, EE calculado via EE = (1 - W_livre/W_total) × 100%.

Taxa de Sublimaçăo e Pressăo de Vapor

Misturas ATB/água de porcentagens de volume ATB variadas (10-90%) pré-congeladas e liofilizadas; tempo até sublimaçăo completa registrado para calcular taxa (µl min⁻¹). Pressăo de vapor medida usando ebuliômetro estático e equaçăo de Antoine.

Caracterizaçăo Físico-Química

DSC (HSC-1, 25-350 °C, 10 °C min⁻¹, atmosfera N₂) avaliou transiçőes térmicas. XRD (D8 Focus, Cu-Kα, 5°-60°, 5° min⁻¹) avaliou cristalinidade. FTIR (Nicolet 6700, 4000-400 cm⁻¹, resoluçăo 4 cm⁻¹) verificou integridade química.

Estabilidade

Pós prolipossomas armazenados a 25 °C, nitrogęnio, no escuro. Após 6 meses, EE e tamanho de partícula de lipossomas reconstituídos reavaliados.

Liberaçăo In Vitro

Liberaçăo estudada por diálise (MWCO 8000-14000 Da) em PBS (pH 7,4) ou salina 0,1% Tween 80 a 37 °C, agitaçăo 300 rpm. Amostras retiradas até 12 h, substituídas com meio fresco, AG quantificado por HPLC.

Captaçăo Celular

Lipossomas de AG marcados com FITC incubados com células HepG2 (1 × 10⁴ células mL⁻¹) por 0,5, 1, 2 e 4 h. Após lavagem e quenching com azul de tripano, células lisadas com Triton X-100. Fluorescęncia (excitaçăo 495 nm, emissăo 520 nm) medida e normalizada a conteúdo proteico (ensaio BCA).

Resultados e Discussăo

Solubilidade e Sublimaçăo

Solubilidade de AG em ATB/água aumentou progressivamente com porcentagem de volume ATB e temperatura; solubilidade excedeu 0,5 mg mL⁻¹ quando ATB > 40%. PCS e colesterol requereram volumes decrescentes de ATB conforme temperatura aumentou acima de 35 °C, confirmando efeito favorável de dissoluçăo do ATB.

Taxa de sublimaçăo aumentou de 4 µl min⁻¹ a 10% ATB para >10 µl min⁻¹ acima de 60% ATB, atribuída a maior pressăo de vapor saturado e cristais de gelo em agulha mais finos observados em microscopia óptica.

Mudanças Físico-Químicas Pós-Liofilizaçăo

DSC mostrou deslocamento do pico de fusăo de AG para temperaturas menores conforme conteúdo de ATB diminuiu, enquanto XRD confirmou perda completa de picos cristalinos, indicando estado amorfo. Espectros FTIR permaneceram inalterados, provando estabilidade química. Amorfozaçăo aumentou solubilidade aquosa de 6,36 µg mL⁻¹ (bruto) para 19-64 µg mL⁻¹ dependendo de razăo ATB.

Triagem de Fator Único

PCS ótimo (480 mg), colesterol (120 mg) e ATB (50%) identificados baseados na maior pontuaçăo combinada de EE e diâmetro médio.

Otimizaçăo Box-Behnken

Usando PCS, colesterol e ATB como variáveis independentes, modelo previu condiçőes ótimas: 508 mg PCS, 151 mg colesterol, 55% ATB, resultando EE = 68,55% e diâmetro médio = 220 nm. Gráficos de interaçăo confirmaram efeitos sinérgicos.

Seleçăo de Liooprotetor

Trealose superou lactose, sacarose e manitol. Razăo trealose/PCS 4:1 maximizou EE (74,87%) e minimizou tamanho de partícula (191 nm), com proteçăo superior durante ciclos freeze-thaw.

Microscopia Eletrônica de Transmissăo

Imagens mostraram hidrataçăo inicial com fragmentos de AG e lipídios dispersos, evoluindo para lipossomas esféricos uniformes ~200 nm com envelope bicamada e fármaco aprisionado.

Estabilidade

Após 6 meses a 25 °C, EE permaneceu 72,82% e diâmetro 198 nm, indicando robusta estabilidade física.

Liberaçăo In Vitro

Ambos meios PBS e salina exibiram liberaçăo sustentada: 65,25% e 69,46% de AG liberado em 12 h, com fase inicial rápida seguida por platô, confirmando comportamento de liberaçăo sustentada.

Captaçăo Celular

Captaçăo HepG2 aumentou de 1.480 ng mL⁻¹ proteína a 30 min para 2.030 ng mL⁻¹ a 240 min, com microscopia de fluorescęncia corroborando internalizaçăo tempo-dependente.

Conclusőes

Este trabalho demonstra que método de liofilizaçăo monofásica, acoplado a desenho Box-Behnken e liooprotetor trealose, produz lipossomas carregados com AG com alta eficięncia de encapsulamento (74,87%), pequeno tamanho de partícula (191 nm) e liberaçăo sustentada por 12 h. O método produz pó seco estável adequado para produçăo em larga escala e oferece plataforma promissora para entrega de terapęuticos hidrofóbicos.