Co-Entrega Direcionada de 5-Fluorouracil e LY294002 via Nanopartículas Lipídicas PEGiladas Aumenta Eficácia Antitumor em Carcinoma Escamoso Esofágico

Resumo

Projetamos uma nanolipossoma PEGilada co-encapsulando agente quimioterápico 5-fluorouracil (5-FU) e inibidor de autofagia LY294002 (LY) para tratar carcinoma escamoso esofágico (CEE). Caracterizações físico-químicas e biológicas abrangentes demonstraram carregamento dual de fármacos bem-sucedido e perfil de liberação controlada, com LY liberado ligeiramente mais rápido que 5-FU. Lipossomas exibiram captação mediada por receptor, confirmada por microscopia confocal e FACS, e entregaram concentrações intracelulares maiores de ambos agentes. In vitro, a nanolipossoma (FLNP) induziu maior citotoxicidade e apoptose (~48%) que cada fármaco sozinho ou sua combinação livre, conforme evidenciado por MTT, anexina V/PI e coloração Hoechst. Western blotting revelou regulação positiva de caspase-3 e PARP e regulação negativa de Bcl-2, confirmando indução de apoptose. Em modelo xenoenxerto, FLNP atingiu inibição superior de crescimento tumoral, reduzindo volume tumoral a ~500 mm³ versus ~1.400 mm³ em controles (p < 0,0001). Estes achados apoiam promessa de co-entrega programada de inibição de autofagia e quimioterapia via único nanocarreador para superar multirresistência a fármacos em CEE.

Contexto

Carcinoma escamoso esofágico (CEE) permanece grande ônus de saúde no Leste Asiático, com taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas ~25%. Embora cirurgia seja pilar do tratamento, quimioterapia adjuvante pode melhorar significativamente desfechos. No entanto, monoterapia frequentemente falha devido a heterogeneidade tumoral e resistência intrínseca. Regimes de combinação que alvo vias celulares distintas são portanto essenciais para eficácia sinérgica.

Autofagia, processo de degradação lisossomal, é frequentemente upregulada em células cancerígenas sob estresse e pode protegê-las de agentes quimioterápicos. Inibição de autofagia mostrou sensibilizar células tumorais a fármacos citotóxicos, superando assim multirresistência a fármacos (MDR). LY294002 (LY) é inibidor de PI3K bem estudado que bloqueia autofagia efetivamente. 5-Fluorouracil (5-FU), análogo fluorado de pirimidina, é amplamente usado em cânceres de células escamosas; sua citotoxicidade surge de incorporação em RNA e inibição de timidilato sintase. Ambos 5-FU e LY sofrem de baixa solubilidade aquosa e clearance sistêmico rápido, limitando sua janela terapêutica.

Nanocarreadores, particularmente lipossomas PEGilados, emergiram como veículos clinicamente validados para entrega de fármacos, oferecendo solubilidade aumentada, circulação prolongada e acúmulo tumoral passivo via efeito de permeação e retenção aumentada (EPR). Encapsulando tanto 5-FU quanto LY em única lipossoma PEGilada, hipotetizamos que liberação precoce de LY irá perturbar vias de sobrevivência autofágica, tornando células tumorais mais suscetíveis a 5-FU e produzindo resposta antitumor sinérgica.

Métodos

Materiais

5-FU (Sigma-Aldrich, China) e LY294002 (Beijing Huafeng United Technology Corporation, China) foram usados como recebidos. Lipídios — fosfatidilcolina de ovo (EPC), DSPE-PEG2000 e colesterol — foram obtidos da Avanti Polar Lipids, China.

Preparação de Nanolipossomas Carregadas com Dois Fármacos

Fosfolipídios e colesterol foram dissolvidos em mistura metanol-clorofórmio (razão molar 10:4:1, 10 mg total). 5-FU e LY (1,5 mg cada) foram adicionados, e solvente evaporado a 60 °C sob pressão reduzida para formar filme fino. Hidratação com tampão fosfato salino (PBS) por 1 h seguida de extrusão através de membrana de policarbonato de 200 nm resultou em FLNP. Fármaco não encapsulado foi quantificado por HPLC. Carregamento de fármaco (DL) e eficiência de encapsulamento (EE) calculados como: DL (%) = (Peso fármaco encapsulado / Peso lipossoma) × 100; EE (%) = (Peso fármaco encapsulado / Peso fármaco inicial) × 100.

Análise de Tamanho de Partícula

Espalhamento dinâmico de luz (DLS) usando Malvern Zetasizer Nano ZS mediu tamanho de partícula e índice de polidispersibilidade (PDI) a 25 °C.

Análise de Morfologia

Microscopia eletrônica de transmissão (MET, Hitachi H-7600) e microscopia de força atômica (AFM) caracterizaram morfologia.

Estudo de Liberação In Vitro

Liberação de fármaco de FLNP avaliada em PBS (pH 7,4) a 37 °C usando membrana de diálise (PM ≈ 3.500). Amostras retiradas em intervalos predeterminados e analisadas por HPLC (autosampler Hitachi L-2200, detector UV-Vis L-2420; coluna Inertsil C18, 150 × 4,6 mm, 5 µm). Calibração linear variou 0,025-2 µg/mL (r² ≈ 0,9995).

Cultura Celular

Linhagem celular humana de CEE EC 9706 mantida em RPMI 1640 suplementado com 10% SFB, 100 U/mL penicilina e 100 µg/mL estreptomicina em incubadora umidificada 5% CO₂.

Análise de Captação Celular

FLNP carregadas com rodamina B fluorescente incubadas com células EC 9706 (10 µg/mL) por 2 h. Microscopia confocal de varredura a laser (CLSM, Nikon TE2000-E) visualizou distribuição intracelular. Citometria de fluxo (BD FACSCALibur) quantificou captação em 1 h e 2 h.

Ensaio de Citotoxicidade

Ensaios de viabilidade MTT realizados em 1 × 10⁴ células/poço (placa 96 poços). Células tratadas com 5-FU livre, LY, 5-FU + LY, ou FLNP por 24 h. Absorbância a 570 nm medida usando leitor Synergy HTX.

Ensaio de Apoptose

Coloração Anexin-V/PI (BD Biosciences) seguida de citometria de fluxo quantificou apoptose precoce e tardia após 24 h tratamento (1 µg fármaco equivalente).

Ensaio Hoechst 33342

Coloração Hoechst 33342 (1 µg/mL) de células fixadas visualizou condensação nuclear sob microscópio de fluorescência.

Western Blotting

Extratos proteicos separados por SDS-PAGE e transferidos para membranas PVDF. Blots sondados para caspase-3 clivada, PARP, Bcl-2 e p53 (AbClon). Detecção usada ECL e processamento Kodak M35-A.

Inibição de Crescimento Tumoral In Vivo

Camundongos nude atímicos fêmeas (6 semanas) receberam injeções subcutâneas de 1 × 10⁶ células OE-19 (100 µL). Quando tumores atingiram ~80 mm³ (dia 10), camundongos (n = 6 por grupo) receberam 5 mg/kg FLNP, combinações de fármacos livres, ou controles via injeção intraperitoneal três vezes em 10 dias. Volume tumoral (V = ½ × comprimento × largura²) medido com paquímetro por 20 dias.

Análise Estatística

Dados expressos como média ± DP. Significância avaliada por teste t ou ANOVA (p < 0,05).

Resultados e Discussão

Co-entrega de 5-FU e LY dentro de lipossomas PEGilados atingiu efeito antitumor sinérgico que superou eficácia de cada agente sozinho ou sua combinação livre. Esta sinergia é atribuída à liberação sequencial de LY, que prejudica autofagia e sensibiliza células a dano de DNA induzido por 5-FU.

Preparação e Caracterização de Nanolipossomas Carregadas com 5-FU e LY

Lipossomas em branco exibiram diâmetro médio ~110 nm (PDI ≈ 0,15). Carregamento dual de fármacos aumentou tamanho para ~150 nm (PDI ≈ 0,18), dimensão que favorece acúmulo tumoral mediado por EPR. Carga superficial foi +25 mV, conferindo estabilidade coloidal e minimizando adsorção não específica de proteínas.

Carregamento de Fármaco e Liberação In Vitro

Eficiências de encapsulamento foram 92,5% para 5-FU e 86% para LY, com capacidade de carregamento ~16% p/p. Perfis de liberação em PBS (pH 7,4) revelaram padrão bifásico: ~30% 5-FU e ~40% LY liberados em 24 h, seguido por liberação gradual a ~60% 5-FU e ~75% LY a 90 h (Fig. 3). Liberação mais rápida de LY promove inibição precoce de autofagia, preparando células para citotoxicidade subsequente de 5-FU.

Estudo de Internalização Celular

CLSM revelou fluorescência vermelha intensa no citoplasma perinuclear após 2 h, indicativa de endocitose mediada por receptor. Citometria de fluxo confirmou captação tempo-dependente, com aumento marcado entre 1 h e 2 h (Fig. 4).

Efeito Anticancer In Vitro

Ensaios MTT demonstraram citotoxicidade dose-dependente para todas formulações. FLNP atingiu IC₅₀ de 0,58 µg/mL, marcadamente menor que 5-FU livre (2,68 µg/mL), LY (5,98 µg/mL) e combinação livre (1,54 µg/mL). Eficácia aprimorada atribuída a entrega de fármaco melhorada e liberação sequencial (Fig. 5).

Avaliação de Apoptose

Coloração Anexin-V/PI revelou 48% apoptose em células tratadas com FLNP, comparado a 20% para 5-FU sozinho e 30% para combinação livre (Fig. 6). Coloração Hoechst corroborou condensação nuclear em células tratadas com FLNP.

Análise Western Blot

FLNP aumentou marcadamente caspase-3 clivada e PARP enquanto reduziu expressão de Bcl-2 e p53, confirmando ativação da via apoptótica intrínseca (Fig. 7).

Análise de Inibição de Crescimento Tumoral In Vivo

FLNP suprimiu consistentemente progressão tumoral por 20 dias, atingindo redução >60% no volume tumoral final relativo a grupos de fármacos livres. Resultado terapêutico aprimorado atribuído a acúmulo tumoral seletivo (EPR) e liberação sustentada de fármaco.

Conclusões

Nossa plataforma lipossomal PEGilada co-entrega 5-FU e LY com sucesso, atingindo liberação controlada e sequencial que amplifica citotoxicidade e apoptose em CEE. FLNP superou combinações de fármacos livres in vitro e in vivo, ressaltando potencial de inibição de autofagia para superar quimiorresistência. Estudos futuros expandirão esta estratégia para outras malignidades de células escamosas e avaliarão modelos xenoenxerto ortotópicos e derivados de pacientes.