Nanomicelas de Ácido Esteárico-G-Quitosana Oligossacarídeo Carregadas com Emodina: Desenho, Caracterização e Atividade Antitumor

Resumo

O objetivo deste estudo foi preparar e caracterizar emodina-carregada em ácido esteárico-g-quitosana oligossacarídeo (CSO-SA/EMO) e avaliar sua atividade antitumoral in vitro. Neste estudo, ácido esteárico-g-quitosana oligossacarídeo foi usado como transportador e suas propriedades físico-químicas foram determinadas por diferentes métodos. Comportamento de captação celular foi examinado usando ácido esteárico-g-quitosana oligossacarídeo marcado com FITC. CSO-SA/EMO foi preparado usando ultrassom e diálise. Tamanho de partícula, potencial de superfície, eficiência de encapsulamento e comportamento de liberação de fármaco foram estudados in vitro. Os efeitos de CSO-SA/EMO em células de câncer gástrico foram investigados usando ensaio MTT e citometria de fluxo. Resultados mostraram que tamanho de partícula de CSO-SA/EMO foi maior e potencial foi menor que o de ácido esteárico-g-quitosana oligossacarídeo. A captação micelar de 12 h por células MGC803 e BGC823 foi suficiente, e as micelas foram capazes de se acumular abundantemente em sítios de lesão em camundongos, alcançando assim boa segmentação passiva EPR. Ensaios MTT e de parada no ciclo celular mostraram que CSO-SA/EMO aumentou significativamente a atividade antitumoral em direção a células MGC803 e BGC823 comparado com emodina livre. Volume de tumor, coloração hematoxilina e eosina e ensaio de marcação de extremidades de desoxinucleotídeo terminal mediado por transferase dUTP nick-end provaram que CSO-SA/EMO teve efeito antitumoral significativo em tecidos tumorais in vivo. Em conclusão, o método ultrassom-diálise forneceu um método simples e eficaz para preparar CSO-SA/EMO. A entrega de emodina usando sistema micelar melhorou seus efeitos antitumoriais efetivamente.

Introdução

Emodina (EMO) é um derivado natural de antraquinona extraído principalmente de ervas tradicionais chinesas como ruibarbo, polygonum cuspidatum e polygonum multiflorum. Medicina tradicional chinesa (MTC) é amplamente usada em pesquisa clínica devido à sua baixa toxicidade, poucos efeitos colaterais e baixo custo [1].

Estudos mostraram que EMO tem ampla atividade farmacológica, incluindo imunossupressão, anti-tosse, anti-hipertensivo, anti-inflamatório, antibacteriano e atividades anticancerígenas. EMO foi encontrado para inibir crescimento de células cancerígenas [2,3,4] e regular genes relacionados para controlar apoptose de células tumorais, tumorigênese, proliferação celular, invasão e metástase [5,6,7,8,9]. Estudos mostraram que EMO pode inibir diversas células cancerígenas, como células de adenocarcinoma colorretal humano, células de hepatocarcinoma, células de leucemia linfoide [10] e células de câncer de língua humano SCC-4 [11]. EMO pode inibir proliferação de células tumorais em cânceres gástrico, mamário e de próstata [7, 12]. No entanto, EMO não exibe efeitos citotóxicos em células normais como fibroblastos gengivais humanos normais [13], células epiteliais brônquicas humanas [14] e células mamárias humanas [15]. Estes mostram que EMO exibe citotoxicidade seletiva em direção a células tumorais comparado com células normais.

Quitosana, um polissacarídeo natural, é a forma desacetilada de quitina. Este polímero natural tem excelente solubilidade em água, biofuncionalidade, compatibilidade sanguínea e características de biodegradabilidade microbiana, e é conhecido por suas várias aplicações biomédicas. Degradamos quitosana de alto peso molecular (450 kDa) usando quitosanase sob condições ácidas para obter oligossacarídeo de quitosana de baixo peso molecular (CSO, 18 kDa). CSO pode penetrar fortemente membranas celulares [16] e ácido esteárico (SA) pode entrar no núcleo através da via de glicoproteína. CSO foi modificada hidrofobicamente com SA usando carbodiimida (EDC) como reagente de acoplamento para sintetizar ácido esteárico-g-quitosana oligossacarídeo anfifílico (CSO-SA).

Embora EMO tenha extensa atividade biológica, sua estrutura de antraquinona é pouco solúvel em água. Como fármacos terapêuticos são transportados através da corrente sanguínea, sua solubilidade afeta sua absorção e distribuição diretamente. Enxertos CSO-SA podem auto-montar em solução aquosa para formar nanomicelas que são hidrofóbicas por dentro e hidrofílicas por fora. Dispersamos as nanomicelas do estado agregado usando sonda de ultrassom. Como tanto EMO quanto CSO eram hidrofóbicos, EMO foi encapsulado no centro das micelas.

Vários fármacos modelo são aplicados a CSO-SA, o que requer peso molecular, estrutura e hidrofobicidade de fármacos modelo. Estudos existentes incluem curcumina [17], doxorrubicina [18], estearato de lamivudina [19] e oxaliplatina [20] que podem melhorar efeitos antitumoriais significativamente. Exploramos condições ótimas de carregamento de CSO-SA/EMO. CSO-SA/EMO cria novas formas de dosagem com maior solubilidade e eficiência de utilização. CSO-SA/EMO pode fornecer ideias para seleção de fármacos modelo ou transportadores, e aplicação clínica de micelas.

Materiais e Métodos Experimentais

Materiais Experimentais

Camundongos nu BALB/C+/nu machos foram obtidos do Centro de Animais Experimentais da Universidade de Zhejiang. Linhas de células de câncer gástrico de baixa diferenciação MGC803 e BGC823 foram compradas do banco de células ATCC. Meio de cultura RPMI-1640 e FBS foram obtidos da Hangzhou Holly Leaf Biotechnology Company. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, ácido trinitrobenzeno sulfônico e pireneno foram fornecidos pela Sigma Aldrich. Universidade de Zhejiang forneceu CSO-SA. Outros reagentes comprados eram de grau AR.

Determinação do CMC e Espectros ¹H NMR de CSO-SA

Neste relatório, concentração micelar crítica (CMC) de CSO-SA foi determinada por espectrofotometria de fluorescência usando pireneno como sonda fluorescente. Várias concentrações de solução de CSO-SA foram adicionadas a uma solução de pireneno em acetona após o que a acetona foi evaporada durante a noite. Os espectros de emissão e valores de pico de pireneno em soluções de CSO-SA de diferentes concentrações foram analisados por espectrofotometria de fluorescência. O primeiro pico (I₁ = 374 nm) e o terceiro pico (I₃ = 385 nm) do espectro foram registrados. Plotamos a concentração logarítmica (Log C) como abscissa e I₁/I₃ como ordenada e calculamos o CMC para as micelas poliméricas.

CSO e CSO-SA foram dissolvidos em D₂O a concentração de 10 mg/ml. Espectros ¹H NMR foram registrados, comparados e analisados para picos característicos de CSO e CSO-SA.

Grau de Substituição de Amina Detectado

O grau de substituição de amina (SD%) foi detectado usando o método de ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS).

Diferentes concentrações de soluções de CSO e CSO-SA foram preparadas após o que 4% NaHCO₃ e 0,1% TNBS foram adicionados sucessivamente. Após incubação a 37 °C por 2 h em banho-maria, 2 mol/L de ácido clorídrico foi adicionado. Absorbância foi medida a 344 nm por espectrofotometria ultravioleta-visível após 30 min de ultrassom. Uma curva padrão foi traçada e o SD% da amostra CSO-SA foi calculado.

Tamanho de Partícula e Potencial de CSO-SA

Uma solução de CSO-SA 1,0 mg/ml foi preparada e micelas foram dispersas completamente com sonda de disruptor de célula ultrassônica. O tamanho de partícula e potencial de CSO-SA foram determinados com analisador de tamanho de partícula e potencial de superfície.

Captação Celular de CSO-SA

Soluções de FITC e CSO-SA foram misturadas, agitadas durante a noite e transferidas para bolsa de diálise. FITC não reagido e etanol absoluto foram removidos por diálise com água desionizada por 24 h. Finalmente, solução de CSO-SA marcada com FITC (FITC-CSO-SA) com concentração de 1,0 mg/mL foi obtida.

Células MGC803 e BGC823 foram usadas como células alvo para examinar captação celular de CSO-SA. Baseado na taxa de proliferação celular, células foram semeadas em placas de 24 poços e cultivadas durante a noite até que se tornassem completamente aderentes. Oitenta μL de solução FITC-CSO-SA foi então adicionada em um ponto de tempo definido. Células foram incubadas com 10 μL de Hoechst 33342 (1 mg/mL) por 15 min para colorir núcleo celular. Captação de CSO-SA por FITC-CSO-SA foi detectada por microscopia confocal a laser.

Distribuição In Vivo de CSO-SA

A distribuição de CSO-SA in vivo foi determinada por coloração com corante fluorescente DiR. Solução CSO-SA/DiR foi preparada por diálise.

Camundongos nu machos de seis semanas foram usados como modelo experimental. Camundongos nu foram inoculados subcutaneamente com 1 × 10⁸/mL células MGC803. CSO-SA/DiR foi administrado via veia da cauda a volume de célula tumoral de aproximadamente 200 mm³. Os camundongos foram então anestesiados em pontos de tempo definidos. Distribuição temporal de CSO-SA/DiR in vivo foi registrada usando imageador de corpo vivo de pequeno animal (faixa de comprimento de onda, 580-700 nm, tempo de exposição 1000 ms).

Detecção de Concentração de EMO por HPLC

Concentração de EMO foi determinada por HPLC. EMO foi aplicado a coluna empacotada Eclipse XDB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) com coluna de proteção (4,6 × 10 mm, 5 μm). Temperatura da coluna foi definida a 30 °C, taxa de fluxo foi 1,0 mL/min, comprimento de onda de detecção foi 254 nm, e volume de injeção foi 20 μL. Fase móvel foi metanol/0,1% ácido fosfórico (85:15, v/v). Concentração de EMO foi plotada como abscissa e área de pico como ordenada. Curvas padrão de EMO foram traçadas para determinar faixa linear ótima. Todas as amostras injetadas em HPLC foram filtradas através de filtro orgânico de 0,45 μm para proteger a coluna.

Preparação de CSO-SA/EMO

Neste estudo, EMO foi encapsulado com sonda ultrassônica. Uma razão de formulação inicial de 10% (EMO: CSO-SA, p/p) foi usada como ponto de partida. A solução de EMO foi lentamente adicionada de maneira gota a gota à solução micelar em banho de gelo. A sonda ultrassônica foi então aplicada por 20 ciclos (400 W, trabalho 2 s, parada 3 s).

As micelas carregadas com fármaco foram transferidas para bolsa de diálise (MWCO, 3,5 kDa) e dialisadas contra água desionizada por 24 h para remover etanol do solvente. CSO-SA/EMO puro foi obtido por centrifugação do dialisado para remover EMO livre.

Propriedades de CSO-SA/EMO (Diâmetro de Partícula Potencial, TEM, EE%)

O tamanho de partícula e potencial de superfície de CSO-SA/EMO foram medidos com analisador de tamanho de partícula e potencial de superfície.

Uma solução de CSO-SA/EMO 0,1 mg/ml foi adicionada gota a gota sobre filme de carbono cobrindo fio de cobre, corada com 2% ácido fosfotungstico e seca. A morfologia e tamanho de partícula de CSO-SA/EMO foram observados por microscopia eletrônica de transmissão.

Eficiência de encapsulamento (EE%) e carregamento de fármaco (DL%) de CSO-SA/EMO foram detectados por extração com solvente orgânico e HPLC. A uma amostra de 200 μL de solução micelar CSO-SA/EMO, 1,8 mL de metanol foi adicionado para dispersar as micelas e extrair o fármaco. A concentração de EMO foi medida como C_EMO. Outros 400 μL de solução micelar CSO-SA/EMO foi colocado em tubo de centrífuga de ultrafiltração e centrifugado (12.000 rpm, 5 min) para obter o sobrenadante. EE% e DL% foram calculados de acordo com as seguintes fórmulas:

$$ \mathrm{EE}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times V/{M}_{\mathrm{EMO}}\times 100\% $$

$$ \mathrm{DL}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times \mathrm{V}/\left[\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times V+{M}_{\mathrm{CSO}-\mathrm{SA}}\right]\times 100\% $$

onde C_EMO é a concentração de EMO nas micelas, C é a concentração de EMO das micelas carregadas com fármaco após centrifugação de ultrafiltração, V é o volume de micela carregada com fármaco submetida a diálise, M_EMO é a quantidade de EMO administrada durante carregamento de fármaco, M_CSO-SA é a massa de CSO-SA.

Avaliação de Liberação de Fármaco In Vitro

Liberação de fármaco de CSO-SA/EMO foi investigada usando PBS (pH 7,2) como meio de liberação. Um mililitro de solução micelar carregada com fármaco foi colocado em bolsa de diálise de 3,5 kDa selada em ambas as extremidades então colocada em tubo contendo meio de liberação apropriado. A bolsa de diálise foi colocada em agitador termostático horizontal a 37 °C. Amostras foram coletadas em pontos de tempo definidos e substituídas com o mesmo volume de meio de liberação fresco. O conteúdo de EMO nas amostras foi determinado por HPLC e a quantidade cumulativa de EMO liberada foi calculada.

Citotoxicidade de CSO-SA/EMO

As taxas de sobrevivência de células de câncer gástrico tratadas com CSO-SA/EMO, CSO-SA e EMO foram detectadas por ensaio MTT. Células foram semeadas em placas de 96 poços a concentração de aproximadamente 10⁵/ml. CSO-SA/EMO, CSO-SA e EMO foram adicionados em diferentes concentrações. Após incubação por diferentes períodos de tempo, 20 μL de solução de trabalho MTT foi adicionada. Após 4 h de incubação, 200 μL de DMSO foi adicionado e a densidade óptica (OD) da solução a 570 nm foi medida por leitor de microplaca.

Efeito de CSO-SA/EMO no Ciclo Celular

Células das duas linhas celulares foram semeadas em placa de 6 poços a densidade de 10⁵/mL. Após 12 h de cultura, CSO-SA, CSO-SA/EMO e EMO foram adicionados e incubados por 24 h. As células foram então digeridas, coletadas e lavadas. 500 μL de solução de coloração PI foi então adicionada a cada amostra celular, o pellet celular foi lentamente ressuspenso e as células foram incubadas no escuro a 37 °C por 30 min. Fluorescência vermelha foi detectada por citômetro de fluxo a comprimento de onda de excitação de 488 nm. Conteúdo de DNA foi analisado pelo software FlowJo.

Efeitos Antitumorais de CSO-SA/EMO Avaliados por Análises In Vivo e Histológicas

Experimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes do Comitê de Cuidado e Uso de Animais, Universidade de Zhejiang. Células MGC803 (1 × 10⁶) foram injetadas subcutaneamente no flanco anterior direito de camundongos nu machos com 5 a 6 semanas de idade. Tumores foram permitidos crescer a diâmetro de aproximadamente 5 mm. Neste ponto, os camundongos foram aleatoriamente divididos em grupo controle, grupo injeção de EMO e grupo injeção de CSO-SA/EMO, com 3 animais em cada grupo. Todos os camundongos foram injetados intravenosamente com reagentes relevantes via veia da cauda uma vez ao dia por 2 semanas. Um paquímetro Vernier eletrônico foi usado para medir os diâmetros longo (a) e curto (b) do tumor (b). O volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula V = a × b²/2. O peso corporal de cada camundongo foi registrado após o que os tumores foram coletados para análise histológica. Taxa inibitória de tumor foi determinada nos tecidos tumorais após coloração hematoxilina e eosina (HE). Marcação terminal de desoxinucleotídeo transferase dUTP nick-end (TUNEL) foi realizada para detectar apoptose celular em tecido ileal terminal usando kit de detecção de morte celular in situ de acordo com instruções do fabricante.

Resultados e Discussão

CMC e Espectros ¹H NMR de CSO-SA

Polímeros anfifílicos auto-montaram-se em micelas em meio hidrofílico. CMC mais baixa resultou em maior formação de micelas. Isso foi benéfico para a manutenção da estrutura de micelas após administração intravenosa. Quando CSO-SA formou micelas, a sonda fluorescente pireneno pôde entrar facilmente no núcleo hidrofóbico das micelas aumentando intensidade de fluorescência do pireneno carregado que aumentou a intensidade do espectro de emissão. Neste ponto, I₃ aumentou significativamente mais rápido que I₁, assim, a razão de intensidade de fluorescência I₁/I₃ diminuiu abruptamente. Um ponto de quebra significativo pôde ser observado no gráfico de I₁/I₃ e valores Log C (Fig. 1). Cálculos de ponto de inflexão mostraram que CMC foi 179,02 μg/mL. Quanto menor o CMC, maior a capacidade de formar micelas e maior a resistência à diluição que melhorou a proteção da estrutura micelar após administração intravenosa.

Variação da razão de intensidade de fluorescência (I₁/I₃) versus concentração logarítmica de CSO-SA.

EDC foi usado como agente de acoplamento cruzado para reagir com grupo carboxila de SA e formar derivado intermediário ativo -OO-acil isoureia. Este pode reagir com grupo amina primário de CSO para formar ligação amida. A estrutura de CSO-SA foi determinada e confirmada baseada no espectro de ressonância magnética nuclear de próton. ¹H NMR (400 MHZ, D₂O) δ 1,06 (m, CH2), 1,02 (m, CH3) correspondem ao próton de metileno e próton de metila de SA respectivamente.

Graus de Substituição de Grupo Amino

O SD% de CSO-SA é a porcentagem de grupos amino substituídos por ácido esteárico na quitosana. TNBS reagiu com grupos amino livres na quitosana e formou derivados de trinitrobenzeno com absorção UV a 344 nm. A curva padrão do derivado de trinitrobenzeno de quitosana foi determinada por absorção UV a 344 nm. O SD% de CSO-SA foi calculado como 9,3 ± 8%. Isto confirmou que CSO e SA foram ligados com sucesso baseado em sua razão de enxerto.

Tamanho de Partícula e Potencial de CSO-SA, CSO-SA/EMO

A Tabela 1 mostra que a média-Z de CSO-SA foi 139,3 ± 2,2 nm. PDI foi 0,179 ± 0,03 indicando dispersão relativamente uniforme. Comparado com CSO-SA, a média-Z e PDI de CSO-SA/EMO aumentaram. Após carregar EMO, a carga positiva de superfície de CSO-SA/EMO foi maior que a de CSO-SA.

Captação Celular

FITC não afetou as propriedades físico-químicas de CSO-SA. Obtivemos FITC-CSO-SA por enxerto de fluoresceína FITC em CSO-SA. Após células serem coradas com Hoechst 33342, a captação de células FITC-CSO-SA foi observada usando microscopia confocal a laser. Verificamos que a captação de MGC803 aumentou gradualmente com o aumento do tempo e fluorescência FITC aumentou gradualmente. A captação micelar de BGC823 foi similar a MGC803 de maneira dependente de tempo. FITC-CSO-SA teve boa capacidade de penetração celular e foi distribuída uniformemente no citoplasma de células de câncer gástrico (Fig. 2).

Captação celular dependente de tempo in vitro de micelas CSO-SA em MGC803 (a) e BGC823 (b) células para 1, 4, 8, 12 h, respectivamente (azul, Hoechst 33342; verde, FITC; barra de escala = 50 μm).

Distribuição de CSO-SA In Vivo

Tecnologia de imagem no infravermelho próximo (NIR) é vantajosa para penetrar biomateriais e tecidos. Após CSO-SA/DiR ser injetado na veia da cauda de camundongos nu, distribuição de CSO-SA/DiR foi observada e registrada em diferentes tempos usando imageador de corpo vivo de pequeno animal. Como mostrado na Fig. 3, a distribuição de CSO-SA/DiR foi similar a outras micelas a 4 h após injeção na veia da cauda e foi distribuída principalmente no fígado, baço e tecidos tumorais. A distribuição de nanomicelas no tumor aumentou gradualmente em intensidade com o aumento do tempo. Isto indicou que enxerto CSO-SA teve boa capacidade de segmentação passiva principalmente devido ao efeito EPR de nanomicelas (Fig. 3).

Imagem de corpo inteiro de CSO-SA/DiR em diferentes tempos após injeção i.v.

Preparação de CSO-SA/EMO

Influência de Diferentes Ambientes de pH no Carregamento de Fármaco

Preparamos uma solução de CSO-SA e ajustamos o pH de CSO-SA para investigar o efeito do pH no carregamento de fármaco. Como mostrado na Fig. 4, CSO-SA teve boa capacidade de carregamento de fármaco e exibiu tendência parabólica na faixa de pH 6,4-6,8. O nível mais alto de carregamento de fármaco foi visto a pH 6,6 tornando este valor o pH ótimo para carregamento de fármaco (Fig. 4).

Efeitos de diferentes valores de pH de enxertos CSO-SA no carregamento de fármaco. Dados apresentados como médias ± DP (n = 3).

Eficiência de Encapsulamento, TEM e Carregamento de Fármaco

CSO-SA auto-monta-se em nanomicelas núcleo-casca. Moiedades hidrofóbicas formam espontaneamente estruturas de núcleo hidrofóbico para repelir meio hidrofílico. Esta estrutura fornece veículo chave para carregamento de fármaco porque EMO pode ser facilmente encapsulado no núcleo hidrofóbico devido à sua estrutura hidrofóbica. Investigamos o efeito de CSO-SA na capacidade de carregamento de EMO variando a dosagem de EMO. Como mostrado na Fig. 5, com aumento da dosagem de EMO, a quantidade de carregamento de fármaco aumenta. A taxa de carregamento de CSO-SA atingiu até 21,16% quando a razão foi 30% (Fig. 5).

Influência de diferentes razões de EMO e CSO-SA (5-30%) nos carregamentos de fármaco. Dados apresentados como médias ± DP (n = 3).

CSO-SA/EMO foi ampliado 30.000 vezes com microscópio eletrônico de transmissão. Forma e tamanho de nanomicelas foram observados e registrados.

Liberação de EMO de CSO-SA/EMO

A solução micelar carregada com fármaco foi adicionada a bolsa de diálise de 3,5 kDa com PBS (pH 7,2) sendo usado como meio de liberação. Cada vez que uma amostra foi removida foi substituída com o mesmo volume de meio de liberação fresco.

A concentração de EMO em diferentes pontos de tempo foi determinada por HPLC, após o que a porcentagem de liberação cumulativa foi calculada. Como mostrado na Fig. 6, CSO-SA/EMO exibiu efeito de liberação sustentada significativo comparado com EMO livre. Estes resultados mostram que a porcentagem de liberação de EMO livre foi 38,4% a 0,5 h enquanto a porcentagem de liberação de EMO de CSO-SA/EMO foi aproximadamente 6,6%. A 4 h, a porcentagem de liberação de EMO livre foi 83,7% e a porcentagem de liberação de CSO-SA/EMO foi aproximadamente 32,5%. Dentro de 72 h, a liberação de EMO livre atingiu 97,2% enquanto a liberação de EMO de CSO-SA/EMO foi 78,4%. EMO foi liberado de micelas carregadas com fármaco CSO-SA/EMO de duas maneiras principais: através de dissociação de EMO do núcleo micelar e por penetração do núcleo da micela no meio de liberação.

Perfil de liberação de EMO de CSO-SA/EMO sobre 72 h. Barras de erro no gráfico representam desvios padrão (n = 3).

Toxicidade de CSO-SA/EMO a Células de Câncer Gástrico

O ensaio MTT é um método padrão para detectar viabilidade celular. A citotoxicidade de EMO livre, CSO-SA e CSO-SA/EMO a células de câncer gástrico MGC803 e BGC823 foi medida usando ensaio MTT. Mostrou que EMO e CSO-SA/EMO poderiam inibir células MGC803 e BGC823 de maneira dependente de dose e tempo. No entanto, na mesma concentração, CSO-SA/EMO teve efeito inibitório maior em células MGC803 e BGC823 comparado à solução de EMO livre. Os valores de IC₅₀ (Tabela 2) de EMO e CSO-SA/EMO para células de câncer gástrico foram calculados. O IC₅₀ de CSO-SA/EMO foi significativamente menor que o de EMO em cada ponto de tempo (24 h, 48 h, 72 h). Os valores de IC₅₀ de CSO-SA mostraram que CSO-SA foi um transportador biológico seguro com pouca toxicidade biológica que confirmou que a citotoxicidade de CSO-SA/EMO foi causada por EMO (Fig. 7).

Viabilidade celular de MGC803 e BGC823 células de câncer gástrico tratadas com CSO-SA, EMO e CSO-SA/EMO por 24 h, 48 h e 72 h. Dados apresentados como médias ± DP (n = 3).

Tabela 2 e Fig. 7 mostraram a citotoxicidade do sistema de entrega de fármaco CSO-SA/EMO foi significativamente maior que a de EMO livre. No entanto, quando a liberação de CSO-SA/EMO e EMO livre em ambiente in vivo foi simulada, a liberação de EMO livre atingiu 38,4% a 0,5 h enquanto a liberação de CSO-SA/EMO foi apenas 6,6%. No geral, a concentração de EMO livre foi maior que a de CSO-SA/EMO em cada ponto de tempo.

Este fenômeno é facilmente explicado. Embora CSO-SA/EMO libere EMO relativamente lentamente, o efeito antitumoral de CSO-SA/EMO não desacelera ou declina. Muitos estudos mostraram que sistemas de entrega de nanofármacos podem melhorar atividade antitumoral de fármacos quimioterápicos [21].

Primeiro, embora EMO livre exiba um surto inicial de atividade, EMO não pode ser eficientemente captado pelas células enquanto CSO-SA acelerou grandemente a captação celular através de endocitose ou fagocitose.

Segundo, quando CSO-SA/EMO se aproxima de membranas celulares, a interação entre nanopartículas e membranas celulares pode afetar a estrutura e propriedades de nanomicelas assim como a função de macromoléculas biológicas como canais iônicos. Portanto, a fixação de CSO-SA/EMO às membranas celulares não resulta em simples adsorção física mas pode mudar o equilíbrio dinâmico da célula e assim promover ainda mais a citotoxicidade de CSO-SA/EMO.

Finalmente, EMO livre tem estrutura de antraquinona hidrofóbica resultando em má distribuição no sangue. O sistema de entrega de fármaco CSO-SA/EMO aumenta solubilidade de EMO e melhora dissolução levando a maior concentração molecular em células circundantes.

Detecção de Parada no Ciclo Celular por CCF

Análise de ciclo celular é um aspecto importante do tratamento clínico de tumores malignos. Aplicação de fármacos específicos de ciclo a células tumorais durante períodos sensíveis a fármacos mostrou ter grande eficácia. Embora análogos de brometo de etídio não possam penetrar células normais, eles podem colorir núcleos celulares penetrando membranas celulares danificadas. DNA de fita dupla incorporado com PI produz fluorescência vermelha e a intensidade de fluorescência é proporcional ao nível de DNA de fita dupla. Conteúdo de DNA foi determinado por citometria de fluxo (CCF) após coloração de DNA com PI. Distribuição do ciclo celular e apoptose foram analisadas baseadas na distribuição de conteúdo de DNA.

Estudos mostraram que EMO afeta distribuição do ciclo celular [11, 22]. Análise CCF mostrou que CSO-SA/EMO e EMO poderiam bloquear células MGC803 e BGC823 na fase G2/M do ciclo celular.

Células MGC803 foram expostas à mesma concentração (20 μM) de CSO-SA, EMO livre e solução CSO-SA/EMO por 24 h. A porcentagem de células MGC803 na fase G2/M foi encontrada como 8,95%, 15,29% e 23,12% respectivamente. Porcentagem do grupo controle foi 6,47%. As porcentagens de células BGC823 na fase G2/M tratadas com 20 μM CSO-SA, EMO livre ou CSO-SA/EMO sob as mesmas condições foram 14,25%, 16,79% e 35,71% respectivamente que foram valores mais altos que no grupo controle (13,66%). Estes dados mostraram que CSO-SA/EMO bloqueou a fase G2/M de células MGC803 e BGC823 mais eficientemente e significativamente que EMO livre na mesma concentração. CSO-SA não mostrou diferença dos controles (Fig. 8).

Distribuições do ciclo celular de células MGC803 e BGC823 tratadas com EMO e CSO-SA/EMO por 24 h. Teste t de Student foi calculado e dados apresentados como médias ± DP (n = 3), (*p < 0,05, ^**p < 0,005, ^***p < 0,001).

Efeito Antitumoral de CSO-SA/EMO In Vivo

Para estudar ainda mais o efeito antitumoral de CSO-SA/EMO, a taxa de inibição de tumor e níveis de apoptose celular foram avaliados in vivo. Os resultados mostraram que tanto CSO-SA/EMO quanto EMO tiveram efeito inibitório notável no crescimento de tumor (Fig. 9a). A taxa de inibição de tumor do grupo CSO-SA/EMO foi três vezes a do grupo EMO (Fig. 9d). O peso de camundongos em cada grupo não mudou significativamente (Fig. 9b). Isto mostrou que tanto CSO-SA/EMO quanto EMO foram relativamente seguros. Alterações morfológicas e apoptose em tecidos tumorais de cada grupo mostraram que CSO-SA/EMO teve efeitos antitumoriais significativos (Fig. 9e, f).

Efeito antitumoral de CSO-SA/EMO in vivo. a Forma do tumor em cada grupo. b Peso corporal de camundongo em cada grupo. c Volume de tumor em cada grupo. d Taxa de inibição de tumor. e Imagens representativas de tecido tumoral corado com TUNEL de cada grupo (barra de escala = 200 μm). f Imagens representativas de tecido tumoral corado com HE de cada grupo (barra de escala = 200 μm).

Conclusões

Neste estudo, detectamos estrutura, CMC, SD%, tamanho de partícula e potencial de CSO-SA com diferentes métodos. Resultados provam que CSO-SA anfifílico funcionou bem como transportador. Intensidade de fluorescência de células de câncer gástrico mostrou que CSO-SA foi captado rapidamente dentro de 12 h. Camundongos nu foram usados como modelo para estudar distribuição de CSO-SA dentro de 72 h. Com o tempo, distribuição de CSO-SA em lesão tornou-se mais concentrada exibindo bom efeito de segmentação passiva.

CSO-SA/EMO foi preparado com método ultrassom-diálise. CSO-SA teve forte capacidade de carregamento de fármaco. Quando pH do ambiente foi definido em 6,6, o nível de carregamento de fármaco atingiu 21,6% a razão de formulação 30%. Comparado com CSO-SA, CSO-SA/EMO teve maior tamanho de partícula e potencial zeta. A forma de CSO-SA/EMO pôde ser registrada diretamente usando TEM. A liberação de EMO de CSO-SA/EMO foi 78,4% dentro de 72 h, indicou processo suave e contínuo no corpo. Considerando efeito antitumoral de CSO-SA/EMO comparado com EMO livre, confirmamos com vários experimentos.

Toxicidade de CSO-SA a células de câncer gástrico foi detectada por ensaio MTT. Resultados mostraram que CSO-SA foi um transportador biológico seguro. Comparado com EMO livre, CSO-SA/EMO aumentou significativamente a atividade antitumoral contra células de câncer gástrico. Ciclo celular de MGC803 e BGC823 pôde ser parado na fase G2/M mais efetivamente por CSO-SA/EMO. Volume de tumor, coloração HE e ensaio TUNEL provaram efeito antitumoral mais significativo de CSO-SA/EMO que EMO livre.

Baseado nos resultados acima, CSO-SA é transportador biocompatível e seguro. CSO-SA/EMO neste estudo utiliza nova e eficaz formulação de dosagem para tratamento de câncer e exibe bom efeito de segmentação passiva in vivo.