Preparação e avaliação de novas nanomicelas de oligossacarídeo de ácido esteárico carregadas com emodina

Resumo

O objetivo deste estudo foi preparar e caracterizar o oligossacarídeo ácido esteárico-g-quitosana carregado com emodina (CSO-SA / EMO) e avaliar sua atividade antitumoral in vitro. Neste estudo, o oligossacarídeo ácido esteárico-g-quitosana foi utilizado como carreador e suas propriedades físico-químicas foram determinadas por diferentes métodos. O comportamento de absorção celular foi examinado usando oligossacarídeo ácido esteárico-g-quitosana marcado com FITC. CSO-SA / EMO foi preparado usando ultra-som e diálise. Tamanho de partícula, potencial de superfície, eficiência de aprisionamento e comportamento de liberação do fármaco foram estudados in vitro. Os efeitos de CSO-SA / EMO em células de câncer gástrico foram investigados usando ensaio de MTT e citometria de fluxo. Os resultados mostraram que o tamanho de partícula CSO-SA / EMO era maior e o potencial era menor do que o oligossacarídeo ácido esteárico-g-quitosana. A captação micelar de 12 h pelas células MGC803 e BGC823 foi suficiente, e as micelas foram capazes de se acumular abundantemente em locais de lesão em camundongos, alcançando assim um bom direcionamento EPR passivo. Os ensaios de MTT e de parada do ciclo celular mostraram atividade antitumoral intensificada por CSO-SA / EMO significativamente em relação às células MGC803 e BGC823 em comparação com a de emodine livre. O volume do tumor, coloração com hematoxilina e eosina, e desoxinucleotídeo transferase dUTP nick-end ensaio de marcação provou que CSO-SA / EMO teve um efeito antitumoral significativo em tecidos tumorais in vivo. Em conclusão, o método de ultrassom-diálise proporcionou um método simples e eficaz para a preparação de CSO-SA / EMO. A entrega de emodine usando um sistema de micela melhorou seus efeitos antitumorais de forma eficaz.

Introdução

Emodin (EMO) é um derivado natural da antraquinona extraído principalmente de ervas tradicionais chinesas, como ruibarbo, cuspidatum e multiflorum. A medicina tradicional chinesa (TCM) é amplamente utilizada na pesquisa clínica devido à sua baixa toxicidade, poucos efeitos colaterais e baixo custo [1].

Estudos demonstraram que a EMO tem ampla atividade farmacológica, incluindo imunossupressão, anti-coqueluche, anti-hipertensiva, antiinflamatória, antibacteriana e atividades anticâncer. EMO foi encontrado para inibir o crescimento de células cancerosas [2,3,4] e para regular genes relacionados para controlar a apoptose de células tumorais, tumorigênese, proliferação celular, invasão e metástase [5,6,7,8,9]. Estudos demonstraram que a EMO pode inibir diversas células cancerosas, como células de adenocarcinoma colorretal humano, células de hepatocarcinoma, células de leucemia linfoide [10] e câncer de língua humana SCC-4 [11]. EMO pode inibir a proliferação de células tumorais em câncer gástrico, de mama e de próstata [7, 12]. No entanto, EMO não exibe efeitos citotóxicos em células normais, como fibroblastos gengivais humanos normais [13], células epiteliais brônquicas humanas [14] e células mamárias humanas [15]. Estes mostram que EMO exibe citotoxicidade seletiva para células tumorais em comparação com células normais.

A quitosana, um polissacarídeo natural, é a forma desacetilada da quitina. Este polímero natural tem excelentes características de solubilidade em água, bio-funcionalidade, compatibilidade com sangue e degradabilidade microbiana, e é conhecido por suas várias aplicações biomédicas. Nós degradamos a quitosana de alto peso molecular (450 kDa) usando quitosanase sob condições ácidas para obter o oligossacarídeo de quitosana de baixo peso molecular (CSO, 18 kDa). O CSO pode penetrar fortemente nas membranas celulares [16] e o ácido esteárico (SA) pode entrar no núcleo através da via da glicoproteína. CSO foi hidrofobicamente modificado com SA usando carbodiimida (EDC) como um reagente de acoplamento para sintetizar o oligossacarídeo ácido esteárico anfipático-g-quitosana (CSO-SA).

Embora EMO tenha ampla atividade biológica, sua estrutura de antraquinona é pouco solúvel em água. Como as drogas terapêuticas são transportadas pela corrente sanguínea, sua solubilidade afeta sua absorção e distribuição diretamente. Os enxertos CSO-SA podem se automontar em uma solução aquosa para formar nanomicelas que são hidrofóbicas por dentro e hidrofílicas por fora. Nós dispersamos as nanomicelas do estado recolhido usando uma sonda de ultrassom. Como o EMO e o CSO eram hidrofóbicos, o EMO foi encapsulado no centro das micelas.

Vários medicamentos modelo são aplicados ao CSO-SA, o que requer peso molecular, estrutura e hidrofobicidade dos medicamentos modelo. Os estudos existentes incluem curcumina [17], doxorrubicina [18], estearato de lamivudina [19] e oxaliplatina [20] que podem melhorar os efeitos antitumorais significativamente. Exploramos as condições ideais de carregamento de CSO-SA / EMO. CSO-SA / EMO cria novas formas farmacêuticas com maior solubilidade e eficiência de utilização. CSO-SA / EMO pode fornecer ideias para a seleção de medicamentos ou portadores modelo e aplicação clínica de micelas.

Materiais e métodos experimentais

Materiais Experimentais

Ratinhos nus machos BALB / C + / nu foram obtidos no Zhejiang University Experimental Animal Center. As linhas de células de câncer gástrico de baixa diferenciação MGC803 e BGC823 foram adquiridas do banco de células ATCC. O meio de cultura RPMI-1640 e FBS foram obtidos de Hangzhou Holly Leaf Biotechnology Company. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, ácido trinitrobenzenossulfônico e pireno foram fornecidos por Sigma Aldrich. A Universidade de Zhejiang forneceu a CSO-SA. Outros reagentes adquiridos eram de grau AR.

Determinação do CMC e ¹ Espectros H NMR de CSO-SA

Neste relatório, a concentração micelar crítica (CMC) de CSO-SA foi determinada por espectrofotometria de fluorescência usando pireno como uma sonda fluorescente. Várias concentrações de solução de CSO-SA foram adicionadas a uma solução de pirenoacetona após o que a acetona foi evaporada durante a noite. Os espectros de emissão e os valores de pico de pireno em soluções CSO-SA de diferentes concentrações foram analisados por espectrofotometria de fluorescência. O primeiro pico ( I ₁ =374 nm) e o terceiro pico ( I ₃ =385 nm) do espectro. Traçamos a concentração logarítmica (Log C) como a abcissa e I ₁ / eu ₃ como ordenada e calculado o CMC para as micelas de polímero.

CSO e CSO-SA foram dissolvidos em D ₂ O a uma concentração de 10 mg / ml. ¹ Os espectros de H NMR foram registrados, comparados e analisados para os picos CSO e CSO-SA característicos.

Grau de substituição de amina detectado

O grau de substituição da amina (SD%) foi detectado pelo método do ácido trinitrobenzeno sulfúrico (TNBS).

Diferentes concentrações de soluções CSO e CSO-SA foram preparadas após as quais 4% NaHCO ₃ e 0,1% de TNBS foram adicionados sucessivamente. Após incubação a 37 ° C durante 2 h em banho-maria, foi adicionado ácido clorídrico 2 mol / L. A absorvância foi medida a 344 nm por espectrofotometria ultravioleta-visível após 30 min de ultrassonicação. Uma curva padrão foi desenhada e o DP% da amostra CSO-SA foi calculado.

Tamanho e potencial de partícula CSO-SA

Uma solução de CSO-SA de 1,0 mg / ml foi preparada e as micelas foram dispersas completamente com uma sonda desreguladora de células ultrassônicas. O tamanho de partícula e o potencial de CSO-SA foram determinados com analisador de tamanho de partícula e potencial de superfície.

Captação celular de CSO-SA

As soluções FITC e CSO-SA foram misturadas, agitadas durante a noite e transferidas para um saco de diálise. FITC não reagido e etanol absoluto foram removidos por diálise com água desionizada por 24 h. Finalmente, foi obtida solução CSO-SA (FITC-CSO-SA) marcada com FITC com uma concentração de 1,0 mg / mL.

As células MGC803 e BGC823 foram utilizadas como células alvo para examinar a absorção celular de CSO-SA. Com base na taxa de proliferação celular, as células foram semeadas em placas de 24 poços e cultivadas durante a noite até que se tornassem completamente aderentes. Oitenta μL de solução FITC-CSO-SA foram então adicionados em um ponto de tempo definido. As células foram incubadas com 10 μL de Hoechst 33342 (1 mg / mL) por 15 min para corar o núcleo da célula. A absorção de CSO-SA por FITC-CSO-SA foi detectada por microscopia confocal de varredura a laser.

Distribuição In Vivo de CSO-SA

A distribuição de CSO-SA in vivo foi determinada por coloração com corante fluorescente DiR. A solução CSO-SA / DiR foi preparada por diálise.

Camundongos nus machos de seis semanas de idade foram usados como modelo experimental. Camundongos nus foram inoculados por via subcutânea com 1 × 10 ⁸ / mL células MGC803. CSO-SA / DiR foi administrado através da veia da cauda em um volume de células tumorais de aproximadamente 200 mm ³ . Os ratos foram então anestesiados em determinados pontos de tempo. A distribuição cronometrada de CSO-SA / DiR in vivo foi registrada usando um pequeno imageador de corpo vivo de animal (faixa de comprimento de onda, 580-700 nm, tempo de exposição 1000 ms).

Detecção de concentração de EMO por HPLC

A concentração de EMO foi determinada por HPLC. O EMO foi aplicado a uma coluna compactada Eclipse XDB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) com uma coluna de proteção (4,6 × 10 mm, 5 μm). A temperatura da coluna foi fixada em 30 ° C, a taxa de fluxo foi de 1,0 mL / min, o comprimento de onda de detecção foi de 254 nm e o volume de injeção foi de 20 μL. A fase móvel foi metanol / ácido fosfórico 0,1% (85:15, v / v). A concentração de EMO foi representada graficamente como abcissa e a área do pico como ordenada. Curvas padrão de EMO foram desenhadas para determinar a faixa linear ideal. Todas as amostras injetadas por HPLC foram filtradas através de um filtro orgânico de 0,45 μm para proteger a coluna.

Preparação de CSO-SA / EMO

Neste estudo, EMO foi encapsulado com uma sonda ultrassônica. Uma proporção de formulação inicial de 10% (EMO:CSO-SA, w / w) foi usada como ponto de partida. A solução EMO foi lentamente adicionada, gota a gota, à solução micelar em banho de gelo. A sonda ultrassônica foi então aplicada por 20 ciclos (400 W, trabalho 2 s, parada 3 s).

As micelas carregadas com a droga foram transferidas para um saco de diálise (MWCO, 3,5 kDa) e dialisadas contra água desionizada por 24 h para remover o etanol do solvente. CSO-SA / EMO puro foi obtido por centrifugação do dialisado para remover EMO livre.

Propriedades de CSO-SA / EMO (Potencial de diâmetro de partícula, TEM, EE%)

O tamanho de partícula e potencial de superfície de CSO-SA / EMO foram medidos com tamanho de partícula e analisador de potencial de superfície.

Uma solução de CSO-SA / EMO 0,1 mg / ml foi adicionada gota a gota a um fio de cobre coberto com filme de carbono, corado com ácido fosfotúngstico 2% e seco. A morfologia e o tamanho das partículas de CSO-SA / EMO foram observados por microscopia eletrônica de transmissão.

Eficiência de aprisionamento (EE%) e carga de droga (DL%) de CSO-SA / EMO foram detectados por extração com solvente orgânico e HPLC. A uma amostra de 200 μL de solução micelar CSO-SA / EMO, 1,8 mL de metanol foi adicionado para dispersar as micelas e extrair a droga. A concentração de EMO foi medida como C _EMO . Outros 400 μL de solução micelar CSO-SA / EMO foram colocados em tubo de centrifugação de ultrafiltração e centrifugados (12.000 rpm, 5 min) para obtenção do sobrenadante. O EE% e DL% foram calculados de acordo com as seguintes fórmulas:
$$ \ mathrm {EE} \% =\ left (10 \ times {C} _ {\ mathrm {EMO}} - C \ right) \ times V / {M} _ {\ mathrm {EMO}} \ times 100 \% $$$$ \ mathrm {DL} \% =\ left (10 \ times {C} _ {\ mathrm {EMO}} - C \ right) \ times \ mathrm {V} / \ left [\ left ( 10 \ times {C} _ {\ mathrm {EMO}} - C \ right) \ times V + {M} _ {\ mathrm {CSO} - \ mathrm {SA}} \ right] \ times 100 \% $$
onde C _EMO é a concentração de EMO em micelas, C é a concentração de EMO das micelas carregadas com a droga após a centrifugação de ultrafiltração, V é o volume de micela carregada de droga submetida a diálise, M _EMO é a quantidade de EMO administrada durante o carregamento de drogas, M _CSO-SA é a massa da CSO-SA.

Avaliação da liberação de drogas in vitro

A liberação do fármaco de CSO-SA / EMO foi investigada usando PBS (pH 7,2) como meio de liberação. Um mililitro de solução de micela carregada com droga foi colocado em um saco de diálise de 3,5 kDa selado em ambas as extremidades e então colocado em um tubo contendo meio de liberação apropriado. A bolsa de diálise foi colocada em um agitador termostático horizontal a 37 ° C. As amostras foram retiradas em pontos de tempo definidos e substituídas com o mesmo volume de meio de liberação fresco. O conteúdo de EMO nas amostras foi determinado por HPLC e a quantidade cumulativa de EMO liberada foi calculada.

Citotoxicidade de CSO-SA / EMO

As taxas de sobrevivência de células de câncer gástrico tratadas com CSO-SA / EMO, CSO-SA e EMO foram detectadas pelo ensaio MTT. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma concentração de aproximadamente 10 ⁵ / ml. CSO-SA / EMO, CSO-SA e EMO foram adicionados em diferentes concentrações. Após a incubação por diferentes períodos de tempo, 20 μL de solução de trabalho de MTT foram adicionados. Após 4 h de incubação, 200 μL de DMSO foram adicionados e a densidade óptica (DO) da solução a 570 nm foi medida por leitor de microplaca.

Efeito de CSO-SA / EMO no ciclo celular

As células das duas linhas celulares foram semeadas em uma placa de 6 poços a uma densidade de 10 ⁵ / mL. Após 12 h de cultura, CSO-SA, CSO-SA / EMO e EMO foram adicionados e incubados por 24 h. As células foram então digeridas, coletadas e lavadas. A 500 μL de solução de coloração de PI foi então adicionado a cada amostra de célula, o pellet celular foi lentamente ressuspenso e as células foram incubadas no escuro a 37 ° C por 30 min. A fluorescência vermelha foi detectada por citômetro de fluxo em um comprimento de onda de excitação de 488 nm. O conteúdo de DNA foi analisado pelo software FlowJo.

Efeitos antitumorais de CSO-SA / EMO avaliados por análises in vivo e histológicas

Os experimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Comitê de Uso e Cuidado de Animais, Universidade de Zhejiang. Células MGC803 (1 × 10 ⁶ ) foram injetados subcutaneamente no flanco anterior direito de camundongos nus machos com 5 a 6 semanas de idade. Os tumores foram autorizados a crescer até um diâmetro de aproximadamente 5 mm. Nesse ponto, os camundongos foram divididos aleatoriamente em um grupo de controle, um grupo de injeção de EMO e um grupo de injeção de CSO-SA / EMO, com 3 animais em cada grupo. Todos os camundongos foram injetados por via intravenosa com os reagentes relevantes através da veia da cauda uma vez por dia durante 2 semanas. Um paquímetro eletrônico Vernier foi usado para medir os diâmetros longo (a) e curto (b) do tumor (b). O volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula V =a × b ² / 2. O peso corporal de cada camundongo foi registrado após o qual os tumores foram coletados para análise histológica. A taxa de inibição do tumor foi determinada nos tecidos do tumor após coloração com hematoxilina e eosina (HE). A marcação terminal de desoxinucleotídeo transferase dUTP nick-end (TUNEL) foi realizada para detectar a apoptose celular no tecido do íleo terminal usando um kit de detecção de morte celular in situ de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados e discussão

CMC e ¹ Espectros H NMR de CSO-SA

Os polímeros anfifílicos auto-montados em micelas em meio hidrofílico. CMC mais baixo resultou em maior formação de micelas. Isso foi benéfico para a manutenção da estrutura das micelas após a administração intravenosa. Quando CSO-SA formou micelas, a sonda fluorescente de pireno poderia facilmente entrar no núcleo hidrofóbico das micelas aumentando a intensidade de fluorescência do pireno carregado, o que aumentou a intensidade do espectro de emissão. Neste ponto, eu ₃ aumentou significativamente mais rápido do que I ₁ , assim, o eu ₁ / eu ₃ a razão de intensidade de fluorescência diminuiu abruptamente. Um ponto de interrupção significativo pode ser observado no I ₁ / eu ₃ plot e valores Log C (Fig. 1). Os cálculos do ponto de inflexão mostraram que o CMC foi de 179,02 μg / mL. Quanto menor for o CMC, mais forte será a capacidade de formar micelas e mais forte será a resistência à diluição, o que melhorou a proteção da estrutura micelar após a administração intravenosa.

Variação da razão de intensidade de fluorescência ( I ₁ / eu ₃ ) versus concentração logarítmica de CSO-SA

EDC foi usado como um agente de acoplamento de reticulação para reagir com o grupo carboxila de SA e formar o derivado de isoureia -OO-acil intermediário ativo. Isso pode reagir com o grupo amina primário de CSO para formar uma ligação amida. A estrutura de CSO-SA foi determinada e confirmada com base no espectro de prótons de ressonância magnética nuclear. ¹ H NMR (400 MHZ, D ₂ O) δ 1,06 (m, CH2), 1,02 (m, CH3) correspondem ao próton de metileno e próton de metila de SA, respectivamente.

Graus substitutos do grupo de aminoácidos

O SD% de CSO-SA é a porcentagem de grupos amino substituídos com ácido esteárico na quitosana. TNBS reagiu com grupos amino livres em quitosana e formou derivados de trinitrobenzeno com uma absorção de UV em 344 nm. A curva padrão do derivado trinitrobenzeno de quitosana foi determinada por absorção de UV a 344 nm. O SD% de CSO-SA foi calculado como 9,3 ± 8%. Isso confirmou que CSO e SA foram associados com sucesso com base em sua proporção de enxerto.

CSO-SA, CSO-SA / EMO Tamanho de partícula e potencial

A Tabela 1 mostra que a média Z de CSO-SA foi 139,3 ± 2,2 nm. PDI foi de 0,179 ± 0,03 indicando uma dispersão relativamente uniforme. Em comparação com CSO-SA, a média Z e PDI de CSO-SA / EMO aumentaram. Depois de carregar EMO, a carga positiva de superfície de CSO-SA / EMO foi maior do que a de CSO-SA.

Captação de células

FITC não afetou as propriedades físico-químicas de CSO-SA. Obtivemos FITC-CSO-SA por enxerto de fluoresceína FITC em CSO-SA. Depois que as células foram coradas com Hoechst 33342, a captação de células FITC-CSO-SA foi observada usando microscopia confocal de varredura a laser. Descobrimos que a captação de MGC803 aumentou gradualmente com o aumento do tempo e a fluorescência de FITC aumentou gradualmente. A captação micelar de BGC823 foi semelhante a MGC803 de uma maneira dependente do tempo. FITC-CSO-SA teve boa capacidade de penetração celular e foi distribuído uniformemente no citoplasma das células cancerosas gástricas (Fig. 2).

Captação celular dependente do tempo in vitro de micelas CSO-SA em MGC803 ( a ) e BGC823 ( b ) células por 1, 4, 8, 12 h, respectivamente (azul, Hoechst 33342; verde, FITC; barra de escala =50 μm)

Distribuição de CSO-SA In Vivo

A tecnologia de imagem no infravermelho próximo (NIR) é vantajosa para a penetração de biomateriais e tecidos. Depois que CSO-SA / DiR foi injetado na veia da cauda de camundongos nus, a distribuição de CSO-SA / DiR foi observada e registrada em momentos diferentes usando um pequeno animal vivo imageador de corpo. Como mostrado na Fig. 3, a distribuição de CSO-SA / DiR foi semelhante a outras micelas 4 h após a injeção na veia da cauda e foi distribuída principalmente no fígado, baço e tecidos tumorais. A distribuição de nanomicelas no tumor aumentou gradualmente de intensidade com o aumento do tempo. Este enxerto CSO-SA indicado tinha uma boa capacidade de direcionamento passivo principalmente devido ao efeito EPR das nanomicelas (Fig. 3).

Imagem de corpo inteiro de CSO-SA / DiR em momentos diferentes após i.v. injeção

Preparação de CSO-SA / EMO

A influência de diferentes ambientes de pH na carga de drogas

Preparamos uma solução de CSO-SA e ajustamos o pH do CSO-SA para investigar o efeito do pH na carga de drogas. Conforme mostrado na Fig. 4, CSO-SA teve boa capacidade de carga de droga e exibiu uma tendência parabólica na faixa de pH 6,4-6,8. O nível mais alto de carga de droga foi observado em pH 6,6, tornando esse valor o pH ideal para a carga de droga (Fig. 4).

Efeitos de diferentes valores de pH de enxertos de CSO-SA na carga de drogas. Os dados são apresentados como médias ± DP ( n =3)

Eficiência de encapsulamento, TEM e carregamento de drogas

CSO-SA se auto-monta em micelas de nanocompósito de núcleo de concha. As porções hidrofóbicas formam espontaneamente estruturas centrais hidrofóbicas para repelir o meio hidrofílico. Esta estrutura fornece um veículo chave para o carregamento de drogas porque EMO pode ser facilmente encapsulado no núcleo hidrofóbico devido à sua estrutura hidrofóbica. Investigamos o efeito de CSO-SA na capacidade de carga de EMO, variando a dosagem de EMO. Conforme mostrado na Fig. 5, com o aumento da dosagem de EMO, a quantidade de carga de droga aumenta. A taxa de carregamento de CSO-SA atingiu 21,16% quando a proporção era de 30% (Fig. 5).

A influência de diferentes proporções de EMO e CSO-SA (5-30%) na carga de drogas. Os dados são apresentados como as médias ± SD ( n =3)

CSO-SA / EMO foi ampliado 30.000 vezes com um microscópio eletrônico de transmissão. A forma e o tamanho das nanomicelas foram observados e registrados.

Lançamento EMO de CSO-SA / EMO

A solução de micela carregada com droga foi adicionada a um saco de diálise de 3,5 kDa com PBS (pH 7,2) sendo usado como um meio de liberação. Cada vez que uma amostra era removida, ela era substituída com o mesmo volume de meio de liberação fresco.

A concentração de EMO em diferentes pontos de tempo foi determinada por HPLC, após o qual a porcentagem de liberação cumulativa foi calculada. Conforme mostrado na Fig. 6, CSO-SA / EMO exibiu um efeito significativo de liberação sustentada em comparação com EMO livre. Esses resultados mostram que a porcentagem de liberação de EMO livre foi de 38,4% em 0,5 h, enquanto a porcentagem de liberação de EMO de CSO-SA / EMO foi de aproximadamente 6,6%. Às 4 h, a porcentagem de liberação de EMO livre foi de 83,7% e a porcentagem de liberação de CSO-SA / EMO foi de aproximadamente 32,5%. Em 72 h, a liberação de EMO livre atingiu 97,2%, enquanto a liberação de EMO de CSO-SA / EMO foi de 78,4%. O EMO foi liberado das micelas carregadas de drogas CSO-SA / EMO de duas maneiras principais:por meio da dissociação de EMO do núcleo micelar e pela penetração do núcleo da micela no meio de liberação.

Perfil de liberação de EMO de CSO-SA / EMO ao longo de 72 h. Barras de erro no gráfico representam os desvios padrão ( n =3)

Toxicidade de CSO-SA / EMO para células cancerosas gástricas

O ensaio MTT é um método padrão para detectar a viabilidade celular. A citotoxicidade de EMO, CSO-SA e CSO-SA / EMO livres para células de câncer gástrico MGC803 e BGC823 foi medida usando o ensaio MTT. Ele mostrou que EMO e CSO-SA / EMO poderiam inibir células MGC803 e BGC823 de uma maneira dependente da dose e do tempo. No entanto, na mesma concentração, CSO-SA / EMO teve um efeito inibitório maior nas células MGC803 e BGC823 em comparação com a solução EMO livre. O IC ₅₀ foram calculados os valores (Tabela 2) de EMO e CSO-SA / EMO para células de câncer gástrico. O IC ₅₀ de CSO-SA / EMO foi significativamente menor do que a de EMO em cada ponto de tempo (24 h, 48 h, 72 h). O IC ₅₀ os valores de CSO-SA mostraram que CSO-SA era um transportador biológico seguro com pouca toxicidade biológica, o que confirmou que a citotoxicidade de CSO-SA / EMO foi causada por EMO (Fig. 7).

Viabilidade celular de células de câncer gástrico MGC803 e BGC823 tratadas com CSO-SA, EMO e CSO-SA / EMO por 24 h, 48 h e 72 h. Os dados são apresentados como as médias ± SD ( n =3)

A Tabela 2 e a Fig. 7 mostraram que a citotoxicidade do sistema de entrega de drogas CSO-SA / EMO foi significativamente maior do que a de EMO livre. No entanto, quando a liberação de CSO-SA / EMO e EMO livre em um ambiente in vivo foi simulada, a liberação de EMO livre atingiu 38,4% em 0,5 h, enquanto a liberação de CSO-SA / EMO foi de apenas 6,6%. No geral, a concentração de EMO livre foi maior do que CSO-SA / EMO em cada ponto de tempo.

Este fenômeno é facilmente explicado. Embora CSO-SA / EMO tenha lançado EMO de forma relativamente lenta, o efeito antitumoral de CSO-SA / EMO não diminui ou diminui. Muitos estudos demonstraram que os sistemas de entrega de nanofármacos podem melhorar a atividade antitumoral de drogas quimioterápicas [21].

Em primeiro lugar, embora o EMO livre exiba uma explosão inicial de atividade, o EMO não pode ser eficientemente absorvido pelas células, ao passo que o CSO-SA acelerou muito a absorção celular por meio de endocitose ou fagocitose.

Em segundo lugar, quando CSO-SA / EMO se fecha às membranas celulares, a interação entre as nanopartículas e as membranas celulares pode afetar a estrutura e as propriedades das nanomicelas, bem como a função de macromoléculas biológicas, como os canais iônicos. Portanto, a ligação de CSO-SA / EMO às membranas celulares não resulta em uma simples adsorção física, mas pode alterar o equilíbrio dinâmico da célula e, assim, promover ainda mais a citotoxicidade de CSO-SA / EMO.

Finalmente, o EMO livre tem uma estrutura de antraquinona hidrofóbica, resultando em má distribuição no sangue. O sistema de entrega de drogas CSO-SA / EMO aumenta a solubilidade de EMO e melhora a dissolução, levando a uma concentração molecular mais alta nas células circundantes.

Detecção de parada do ciclo celular pelo FCM

A análise do ciclo celular é um aspecto importante do tratamento clínico de tumores malignos. A aplicação de drogas específicas do ciclo em células tumorais durante períodos sensíveis a drogas tem demonstrado grande eficácia. Embora os análogos do brometo de etídio não possam penetrar nas células normais, eles podem manchar os núcleos das células ao penetrar nas membranas celulares danificadas. O DNA de fita dupla incorporado em PI produz fluorescência vermelha e a intensidade da fluorescência é proporcional ao nível de DNA de fita dupla. O conteúdo de DNA foi determinado por citometria de fluxo (FCM) após coloração de DNA com PI. A distribuição do ciclo celular e a apoptose foram analisadas com base na distribuição do conteúdo de DNA.

Estudos têm mostrado que a EMO afeta a distribuição do ciclo celular [11, 22]. A análise de FCM mostrou que CSO-SA / EMO e EMO podem bloquear células MGC803 e BGC823 na fase G2 / M do ciclo celular.

As células MGC803 foram expostas à mesma concentração (20 μM) de CSO-SA, solução de EMO livre e CSO-SA / EMO por 24 h. A porcentagem de células MGC803 na fase G2 / M foi de 8,95%, 15,29% e 23,12%, respectivamente. A porcentagem do grupo controle foi de 6,47%. As porcentagens de células BGC823 em G2 / M tratadas com 20 μM de CSO-SA, EMO livre ou CSO-SA / EMO nas mesmas condições foram 14,25%, 16,79% e 35,71%, respectivamente, que foram valores maiores do que no grupo de controle (13,66%). Estes dados mostraram que CSO-SA / EMO bloqueou a fase G2 / M das células MGC803 e BGC823 de forma mais eficiente e significativa do que EMO livre na mesma concentração. O CSO-SA não apresentou diferença em relação aos controles (Fig. 8).

Distribuições do ciclo celular de células MGC803 e BGC823 tratadas com EMO e CSO-SA / EMO por 24 h. t do aluno teste foi calculado e os dados são apresentados como as médias ± DP ( n =3), (* p <0,05, ^** p <0,005, ^*** p <0,001)

Efeito antitumor de CSO-SA / EMO In Vivo

Para estudar ainda mais o efeito antitumoral de CSO-SA / EMO, a taxa de inibição do tumor e os níveis de apoptose celular foram avaliados in vivo. Os resultados mostraram que ambos CSO-SA / EMO e EMO tiveram um efeito inibitório notável no crescimento do tumor (Fig. 9a). A taxa de inibição do tumor do grupo CSO-SA / EMO foi três vezes maior do que a do grupo EMO (Fig. 9d). O peso dos ratos em cada grupo não mudou significativamente (Fig. 9b). Isso mostrou que CSO-SA / EMO e EMO eram relativamente seguros. Alterações morfológicas e apoptose em tecidos tumorais de cada grupo mostraram que CSO-SA / EMO teve efeitos antitumorais significativos (Fig. 9e, f).

Efeito antitumoral de CSO-SA / EMO in vivo. a Forma do tumor em cada grupo. b Peso corporal do camundongo em cada grupo. c Volume do tumor em cada grupo. d Taxa de inibição do tumor. e Imagens representativas de tecido tumoral corado por TUNEL de cada grupo (barra de escala =200 μm). f Imagens representativas de tecido tumoral corado com HE de cada grupo (barra de escala =200 μm)

Conclusões

Neste estudo, detectamos estrutura, CMC, SD%, tamanho de partícula e potencial de CSO-SA com diferentes métodos. Os resultados provam que o CSO-SA anfifílico teve um bom desempenho como portador. A intensidade da fluorescência das células cancerosas gástricas mostrou que CSO-SA foi absorvido rapidamente em 12 h. Camundongos nus foram usados como modelo para estudar a distribuição de CSO-SA em 72 h. Com o tempo, a distribuição de CSO-SA na lesão tornou-se mais concentrada exibindo um bom efeito de direcionamento passivo.

CSO-SA / EMO foi preparado com o método de ultrassom-diálise. CSO-SA tinha grande capacidade de carregamento de drogas. When environment pH was set at 6.6, the level of drug loading reached 21.6% at a 30% formulation ratio. Compared with CSO-SA, CSO-SA/EMO had bigger particle size and zeta potential. The shape of CSO-SA/EMO could be recorded directly using TEM. The release of EMO from CSO-SA/EMO was 78.4% within 72 h, it indicated a smooth and continuous process in body. Considering the antitumor effect of CSO-SA/EMO compared with free EMO, we confirmed it with various experiments.

CSO-SA toxicity to gastric cancer cells was detected by MTT assay. The results showed that CSO-SA was a safe biological carrier. Compared with that of free EMO, CSO-SA/EMO significantly enhanced the antitumor activity against gastric cancer cells. MGC803 and BGC823 cell cycle could be arrested in the G2/M phase more effectively by CSO-SA/EMO. Tumor volume, HE staining, and TUNEL assay proved more significant antitumor effect of CSO-SA/EMO than free EMO.

Based on above results, CSO-SA is both biocompatible and safe carrier. CSO-SA/EMO in this study utilizes a new and effective dosage formulation for the treatment of cancer and exhibits good passive targeting effect in vivo.