Um novo agente de contraste baseado em nanopartículas magnéticas para detecção de colesterol como biomarcador da doença de Alzheimer

Resumo

Histórico

Considerando a alta incidência da doença de Alzheimer na população mundial ao longo dos anos, e os custos que a doença representa em termos sanitários e sociais para os países, é necessário desenvolver testes diagnósticos não invasivos que permitam detectar biomarcadores precoces da doença. Dentro dos métodos de diagnóstico precoce, o desenvolvimento de agentes de contraste para a ressonância magnética torna-se especialmente útil.

O acúmulo de evidências sugere que o colesterol pode desempenhar um papel na patogênese da doença de Alzheimer, uma vez que depósitos anormais de colesterol em torno das placas senis foram descritos em modelos animais transgênicos e pacientes com doença de Alzheimer. Experimentos in vivo também mostraram que a hipercolesterolemia induzida por dieta aumenta o acúmulo intraneuronal de proteína β-amilóide acompanhada por microgliose e acelera a deposição de β-amilóide no cérebro.

Apresentação da hipótese

No presente estudo, propomos pela primeira vez a síntese de um novo nanoconjugado composto de nanopartículas magnéticas ligadas a um anticorpo anticolesterol, para detectar os depósitos anormais de colesterol observados em placas senis na doença de Alzheimer por ressonância magnética. A nanoplataforma também poderia revelar a diminuição do colesterol observada nas membranas plasmáticas neuronais associadas a essa patologia.

Testando a hipótese

O delineamento experimental para testar a hipótese será feito primeiramente in vitro e posteriormente em estudos ex vivo e in vivo em uma segunda etapa.

Implicações da hipótese

A nanoplataforma projetada poderia, portanto, detectar depósitos de colesterol no nível cerebral. A detecção desse biomarcador em áreas que coincidem com o acúmulo de placa senil pode fornecer informações precoces sobre o início e a progressão da doença de Alzheimer.

Histórico

Vários estudos demonstraram que a presença de uma quantidade adequada de colesterol (CHO) na membrana plasmática neuronal desempenha um papel fundamental na proteção das células nervosas contra a toxicidade da proteína β-amilóide na doença de Alzheimer (DA), neutralizando a produção excessiva desta proteína [1,2,3]; neurônios enriquecidos em CHO são mais resistentes ao estresse oxidativo e à toxicidade da proteína β-amilóide [4, 5].

Portanto, pode-se supor que a quantidade de CHO presente na membrana plasmática neuronal, e não apenas seus níveis plasmáticos, pode desempenhar um papel na patogênese das doenças neurodegenerativas [6]. Na verdade, dados experimentais apóiam a ideia de que uma quantidade ideal de CHO nas membranas celulares é necessária para criar uma barreira protetora contra agentes tóxicos. Uma quantidade reduzida de CHO celular na membrana plasmática altera essa barreira protetora, reduzindo a proteção contra agentes tóxicos, incluindo a proteína β-amilóide [7]. Curiosamente, os neurônios no córtex cerebral de camundongos transgênicos com AD contêm menos CHO na membrana plasmática do que os de camundongos do tipo selvagem [8].

Mori et al. [9] mostraram que tanto em humanos quanto em camundongos transgênicos de proteína precursora de amiloide (APP), CHO é anormalmente acumulado em placas amilóides maduras, mas não em placas difusas ou imaturas, sugerindo que CHO poderia desempenhar um papel na formação e progressão de placas senis. Outros estudos subsequentes descobriram que o CHO e a apolipoproteína E estavam presentes no centro das placas fibrilares, mas não nas placas difusas em um estágio inicial. Em estágios mais avançados da doença, foi descrito um maior número de placas fibrilares imunopositivas para a colesterol oxidase [10]. A quantidade de CHO livre por placa senil, determinada por espectrometria de massa, foi semelhante à carga de proteína β-amilóide [8]. Este aumento mútuo na concentração de CHO e placas senis na DA poderia sugerir um novo mecanismo patogênico da doença [11]. Além disso, nos tecidos cerebrais de pacientes com DA, depósitos de lipídios co-localizados com placas senis fibrilares foram descritos usando espalhamento Raman anti-Stokes e microscopia de fluorescência de 2 fótons em amostras coradas com Tioflavina-S [10]. Duas morfologias lipídicas podem ser observadas:estruturas lamelares e macroagregados coalescentes de tamanhos submícron. Uma vez que a composição / organização lipídica varia ao longo das placas, há evidências claras de estreita interação amiloide-lipídeo nas placas fibrilares senis, tornando-as composições mais dinâmicas do que se pensava anteriormente [12].

Além disso, a fim de detectar biomarcadores de DA em estágios iniciais da doença, vários estudos propuseram o uso de nanopartículas de óxido de ferro magnético funcionalizado (MNPs) como agentes de contraste específicos para imagem por ressonância magnética (MRI) para placas senis [13,14, 15] e detecção de proteína de ferritina [16]. O efeito hipointenso exibido por essas partículas nas sequências ponderadas em T2 e T2 * fornece maior contraste nas imagens de ressonância magnética. Portanto, o uso de MNPs como agentes de contraste para ressonância magnética é um método promissor para o diagnóstico precoce da DA.

O presente trabalho apresenta a hipótese da utilização de um novo contraste baseado em MNPs biofuncionalizados, para a detecção por ressonância magnética de acúmulos anormais de CHO nas placas senis, que podem ser utilizados como um potencial biomarcador de DA.

O presente trabalho apresenta pela primeira vez, até onde sabemos, o desenho de um novo agente de contraste baseado em MNPs biofuncionalizados para a detecção por ressonância magnética de acúmulos anormais de CHO nas placas senis, que podem ser usados ​​como um potencial biomarcador de DA. .

A hipótese

Devido à alta incidência de DA entre a população mundial ao longo dos anos [17], e os custos associados da patologia em termos sociais e de saúde para os países [17], é urgente desenvolver ferramentas não invasivas que permitam a detecção de biomarcadores precoces para diagnóstico e evolução da doença.

Dentro dos métodos de diagnóstico precoce, o desenvolvimento de agentes de contraste para imagens moleculares (IM) torna-se especialmente útil. MI combina tecnologias de imagem convencionais com sondas moleculares, que são projetadas para detectar aspectos da bioquímica e da biologia celular que fundamentam a progressão da doença e a resposta ao tratamento [18,19,20].

Propomos a síntese de um agente de contraste baseado em MNPs revestidos com polietilenoglicol (PEG) e funcionalizado com estreptavidina (Fig. 1a) para permitir a ligação direcional de um anticorpo biotinilado que reconhece especificamente o CHO presente nas placas senis (NANOCHOAD) ( Fig. 1b). O anticorpo também reconhecerá o CHO presente na membrana plasmática celular, detectando assim a diminuição de CHO nas membranas plasmáticas neuronais. Os MNPs serão revestidos com cadeias de PEG para melhorar a estabilidade coloidal da nanoplataforma, facilitando sua dispersão na corrente sanguínea e a passagem pela barreira hematoencefálica (BBB) ​​[21].

Diagrama esquemático da nanoplataforma projetada e seu mecanismo de ação. a a estrutura de MNP e funcionalização com anticorpo anti-CHO (NANOCHOAD), b estratégias para penetração da nanoplataforma através de BBB, c Mecanismo de cruzamento através do BBB de NANOCHOAD. d nanoconjugado anti-CHO-MNP direcionando depósitos de CHO em placas amilóides

O BBB representa uma das barreiras biológicas mais exclusivas encontradas no tratamento e diagnóstico de doenças neurológicas, restringindo o acesso da maioria dos agentes diagnósticos e terapêuticos ao cérebro por via sistêmica [22, 23]. Portanto, o desafio no diagnóstico e tratamento de um grande número de distúrbios cerebrais é superar a dificuldade de entregar agentes terapêuticos e de contraste através do BBB para atingir regiões concretas do cérebro. Felizmente, as células endoteliais capilares cerebrais apresentam alguns mecanismos de transporte específicos mediados por receptor. Foi documentado que um grande número de receptores de transferrina são expressos por células endoteliais capilares cerebrais, envolvidas na transcitose mediada por receptor através da BBB [24].

Portanto, para resolver o problema da passagem do agente de contraste pelo BBB, propomos três estratégias alternativas:(i) conjugar os anti-CHO-MNPs com a transferrina [25], o que permitiria que ele passasse pelo BBB; (ii) a administração intranasal do conjugado anti-CHO-MNPs. A rota intranasal, que não é invasiva e ignora o BBB, é uma rota alternativa para a entrega de nanoconjugados ao cérebro [26, 27]; e (iii) a aplicação de campos magnéticos externos para facilitar o nanoconjugado para cruzar o BBB (Fig. 2c). Esta nova técnica de entrega pode fornecer dosagem clinicamente relevante para o cérebro (região olfatória, córtex, hipocampo ...) por meio de BBB [28,29,30] (Fig. 1c). Além disso, a passagem do nanoconjugado através do BBB também seria favorecida pelo uso de MNPs revestidos com PEG e pela deterioração do BBB devido à própria patologia. O nanoconjugado reconhecerá especificamente depósitos anormais de CHO em placas senis, pela afinidade antígeno-anticorpo (Fig. 1c, d). O acúmulo de nanopartículas em estruturas patológicas no parênquima cerebral como placas senis indicaria mudanças na localização de CHO no parênquima cerebral da DA. Portanto, a presença de anti-CHO-MNPs associados às placas senis mostrará sinais hipointensos na ressonância magnética ponderada em T2 *, permitindo a detecção do CHO associado a outras características estabelecidas da DA, como placas senis e, portanto, imagens de RM de CHO cerebral pode se tornar um novo biomarcador da doença. Além disso, são esperadas alterações na ressonância magnética devido a uma diminuição na membrana plasmática de CHO.

Desenho experimental para testar a hipótese. Primeiro, in vitro ( a ):determinação da biocompatibilidade do nanoconjugado sintetizado. Teste ex vivo ( b ):testar a especificidade do nanoconjugado anti-CHO-MNPs por incubação da nanoplataforma em fatias fixas do cérebro de camundongos transgênicos 5XFAD. Estudos in vivo ( c ):a nanoplataforma será injetada por via intravenosa ou por vias alternativas como aplicação intranasal / aplicação de campo magnético externo, e sua eficácia (direcionamento) será avaliada por ressonância magnética

A depuração do agente de contraste do parênquima cerebral poderia ser realizada pela internalização dos MNPs pelas células microgliais e seu subsequente processamento lisossomal, conforme demonstrado em estudos anteriores [16, 31, 32]. Os MNPs serão eliminados pelas vias comuns usadas para o metabolismo do ferro endógeno. No entanto, as vias de eliminação dos agentes de contraste, com base em seu tamanho e carga superficial, e sua toxicidade potencial serão determinadas durante o desenvolvimento da hipótese proposta, conforme detalhado a seguir.

Teste da hipótese

Síntese e caracterização de nanopartículas magnéticas

A síntese de nanopartículas de óxido de ferro será realizada através do método de co-precipitação controlada, por meio da mistura de íon ferroso (Fe2 +) e íon férrico (Fe3 +) em solução alcalina seguindo o trabalho de Predescu et al. [33]. Os MNPs serão revestidos com uma casca de PEG seguindo o protocolo previamente estabelecido por Liu et al. [34].

A estrutura, morfologia e magnetismo das nanopartículas de ferro revestidas com PEG serão investigadas usando difração de raios-X (XRD), microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier (FTIR) e magnetometria de dispositivo de interferência quântica supercondutor (SQUID).

Após a caracterização do nanomaterial magnético sintetizado, ele será funcionalizado com (1) proteína estreptavidina pelo método NHS / EDC. Em seguida, será acoplado a um anticorpo anti-CHO biotinilado e (2) proteína transferrina. A conjugação da transferrina será realizada pelo acoplamento do grupo carboxílico presente na superfície do ligante e do grupo hidroxila presente no revestimento de PEG [35].

Teste In Vitro

Em uma primeira etapa, a biocompatibilidade da nanoplataforma será testada in vitro (Fig. 2a). O nanoconjugado será adicionado a co-culturas de neurônios e astrócitos e a culturas de células endoteliais [36] para determinar a compatibilidade do nanoconjugado com células cerebrais típicas. Se a citocompatibilidade dos MNPs funcionalizados estiver correta, a eficácia do sistema será testada em um modelo ex vivo da doença (Fig. 2b). O modelo selecionado é um camundongo transgênico duplo APP / (presenilina-1) PS1 que coexpressa cinco mutações familiares de AD (5XFAD) e exibe uma patologia de placa amilóide semelhante à encontrada em AD [37].

O acúmulo de CHO ao redor das placas senis no modelo transgênico 5XFAD será avaliado por imunohistoquímica.

Se o modelo for válido, uma vez demonstrado o acúmulo de CHO nas placas senis, propõe-se testar a especificidade do nanoconjugado sintetizado. Para tanto, primeiramente serão obtidas fatias fixas de cérebro dos camundongos transgênicos 5XFAD e, em seguida, será tentada a união do nanoconjugado, incubando-se os anti-CHO-MNPs nas seções fixas do cérebro de camundongos 5XFAD. A especificidade do nanoconjugado será determinada, avaliando a co-localização dos anti-CHO-MNPs com os depósitos de CHO e as placas senis presentes nos cortes cerebrais 5XFAD, realizando os controles apropriados. No caso de nenhum acúmulo de colesterol evidente em 5XFAD ter sido detectado, uma mutação sueca alternativa no modelo de camundongo da proteína precursora da amiloide (APP _sw ), modelo de camundongo de AD, será usado, uma vez que, neste modelo, um acúmulo de CHO claramente associado a placas amilóides foi descrito no hipocampo [9].

Teste In Vivo

Uma vez demonstrada a especificidade do conjugado, as análises de biocompatibilidade do nanocojugado in vivo serão realizadas. A nanoplataforma seria injetada por via intravenosa em diferentes doses (variando de 25 a 100 mg / kg [38]) (Fig. 2c), e a toxicidade subaguda durante o curso do estudo será analisada pela observação de mortalidade, evidências de atrofia , congestão, inflamação ou quaisquer alterações comportamentais graves em camundongos. Será calculado o coeficiente de peso de cada órgão ao corpo. A toxicidade renal será determinada pelos níveis de nitrogênio ureico e creatinina no sangue. Os níveis de bilirrubina total e fosfatase alcalina no sangue podem ser testados como uma medida da funcionalidade hepática e biliar. Além disso, serão determinados os níveis de ácido úrico e estudos hematológicos para avaliar as alterações nos níveis de glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e hemoglobina. Finalmente, a fim de pesquisar mais detalhadamente os possíveis efeitos tóxicos, o exame histológico de vários tecidos (rim, fígado, baço, cérebro ou pulmão) será realizado [39]. A localização dos MNPs funcionalizados no sangue, urina e diferentes órgãos seria analisada em 24 h, 72 h, 1 semana, 2 semanas e 1 mês após a injeção de anti-CHO-MNPs.

Uma vez determinada a concentração adequada de MNPs, a nanoplataforma será injetada em camundongos controle e 5XFAD, e sua eficácia será avaliada por ressonância magnética (Fig. 2c). Se o anticorpo da nanoplataforma não reconhece o antígeno no sistema in vivo, então os MNPs podem ser funcionalizados com colesterol fenil-diino, um composto que em estudos anteriores foi encontrado para ser capaz de se ligar a acumulações de CHO in vivo [40] . A biocompatibilidade deste nanoconjugado será avaliada conforme descrito acima para o nanoconjugado MNP-CHO. Se a via de administração intravenosa não é eficaz cruzando a BBB, são propostas vias de administração alternativas como entrega intranasal ou aplicação de campos magnéticos externos (Fig. 2c).

Implicações da hipótese

O uso de MNPs biofuncionalizados para detectar DA in vivo por MRI foi amplamente demonstrado em vários estudos anteriores, por meio da conjugação dos MNPs a diferentes peptídeos:Aβ 1-40 [41], Aβ1-30 [42], Aβ1-42 [15] e anticorpos anti-Aβ-1-42 [43]. Após a administração intravenosa em modelos animais de DA, as placas senis e os depósitos vasculares de amiloide (angiopatia congofílica) foram detectados por ressonância magnética. No entanto, estes nanoconjugados são tóxicos por si próprios, uma vez que os fragmentos do péptido amilóide utilizado são neurotóxicos (Aβ1-40, Aβ 1-42). Além disso, devido ao seu tamanho, requerem a co-administração de compostos que facilitem sua passagem pelo BBB.

O NANOCHOAD funcionaria como um agente de contraste que permitiria a localização simultânea de dois biomarcadores específicos da AD:placas amilóides e perda de CHO na substância branca do cérebro [44], evitando a toxicidade. Devido à presença do PEG em sua estrutura, também facilitaria a passagem da nanoplataforma pela BBB [43].

Como pode ser visto, a maioria dos estudos dessas características é voltada para a detecção de placas senis, um dos principais biomarcadores da DA, mas não o único. Recentemente, um artigo no qual ferritina e, portanto, depósitos de ferro foram detectados por nanoconjugados baseados em MNPs foi publicado [16]. Porém, esse contraste para a detecção da ferritina apresenta baixa sensibilidade, uma vez que não é detectado por ressonância magnética e apenas pela quantificação em locais específicos do cérebro. A perda de substância branca no cérebro é um fenômeno massivo [44], não localizado; portanto, acredita-se que o agente de contraste proposto poderia ser mais sensível para a detecção precoce de biomarcadores de DA. É necessário promover o desenvolvimento de novos agentes de contraste que possam detectar com eficiência outros biomarcadores associados à DA nos estágios iniciais da doença.

Por outro lado, a composição do nanoconjugado proposto poderia resolver dois dos principais obstáculos para superar a eficácia dos agentes de contraste injetados por via intravenosa:a estabilidade coloidal na corrente sanguínea e a capacidade de cruzar com sucesso a BBB para atingir o alvo. A funcionalização da nanoplataforma com cadeias de PEG garantirá a estabilidade coloidal dos nanoconjugados na corrente sanguínea [15, 21]. Por outro lado, como estratégia para cruzar BBB, a conjugação dos MNPs com o peptídeo transferrina [25] irá facilitar o reconhecimento da transferrina por receptores específicos localizados na BBB permitindo que o nanoconjugado atravesse a BBB e se ligue ao seu alvo final . Esse fato, combinado com o tamanho reduzido do nanossistema e a alteração da BBB em pacientes com DA, facilitaria a passagem do nanoconjugado pela BBB.

Devido à novidade no desenho do nanoconjugado descrito, será necessário estudar em profundidade a biocompatibilidade e a dose administrada da nanoplataforma, principalmente para determinar as rotas de eliminação do agente de contraste do organismo.

Abreviações

AD:

Doença de Alzheimer

BBB:

Barreira hematoencefalica

CHO:

Colesterol

MI:

Imagem molecular

MNPs:

Nanopartículas de óxido de ferro magnético

MRI:

Imagem de ressonância magnética

PEG:

Polietileno glicol

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