Usando nanopartículas magnéticas carregadas positivamente para capturar bactérias em concentração ultralow

Resumo

A detecção de bactérias em baixas concentrações sem processos de cultura demorados permitiria diagnósticos rápidos. Uma vez que existe atração eletrostática entre células bacterianas carregadas negativamente e nanopartículas magnéticas carregadas positivamente (NP +), a captura de bactérias é uma grande promessa para atingir esse objetivo. Aqui, apresentamos uma abordagem rápida e altamente eficiente para capturar Escherichia coli , que foi usado como modelo para bactérias gram-negativas. Captura de E. coli em concentrações muito baixas de 10 e 100 CFU / mL usando NP + é rápida e eficientemente alcançada dentro de 1 h. Além disso, a eficiência de captura de NP + foi superior a 90%, analisando o número de colônias bacterianas na placa. A microscopia óptica e eletrônica de transmissão confirmou a capacidade de captura bacteriana de nanopartículas carregadas eletricamente (NPs). Em contraste, nanopartículas magnéticas carregadas negativamente (NP−) não mostraram afinidades com E. coli . Esses resultados mostraram que células bacterianas, como E. coli , carregam uma carga negativa. Ao contrário de um sistema de captura dependente de ligante, nosso NP + projetado tem potencial para capturar uma ampla gama de bactérias por meio de atrações eletrostáticas.

Histórico

As doenças infecciosas estão entre os desafios de saúde mais urgentes do mundo. A contaminação microbiana dos recursos hídricos é uma grande ameaça à saúde pública. Escherichia coli ( E. coli ), uma bactéria gram-negativa, é muito comum em água e alimentos contaminados. Algumas cepas de E. coli pode até causar infecções bacterianas graves. Bactérias em baixas concentrações são difíceis de detectar e geralmente requerem um processo de pré-enriquecimento antes de análises adicionais. Os métodos microbiológicos baseados em cultura são trabalhosos e podem levar vários dias. Além disso, algumas cepas bacterianas podem entrar em um estado viável, mas não cultivável, onde são viáveis, mas não podem ser cultivadas em ágar de rotina, o que impede sua detecção por métodos baseados em cultura [1]. Inversamente, a rápida captura e descontaminação de patógenos bacterianos podem fornecer resultados em tempo real para mitigar surtos de doenças infecciosas.

Uma variedade de materiais são desenvolvidos para rápida captura e remoção de bactérias da fonte contaminada. Nanotubos de carbono e esferas de oligoacilisina ligadas à resina têm sido usados para remover as bactérias da água [2, 3]. Nanopartículas magnéticas, que podem ser convenientemente separadas de vários recursos pelo emprego de processos magnéticos, foram amplamente utilizadas para detecção de bactérias e descontaminação após funcionalizadas com moléculas orgânicas [4,5,6]. As técnicas magnéticas têm as vantagens de captura de alvos por economia de tempo (tempo de separação comum em 1 h), alta recuperação, possível automação e separação em escala [7]. A eficiência e seletividade da separação magnética dependem em grande parte dos ligantes, mas às vezes é difícil obter um ligante com alta afinidade e especificidade para o alvo. Portanto, é necessário desenvolver um sistema de captura bacteriana com nanopartículas magnéticas independentes de ligantes para capturar a bactéria, principalmente em baixas concentrações.

Muitos cientistas investigaram a natureza da carga elétrica das bactérias. Bechhold (1904) foi o primeiro a descobrir o fato de que as células bacterianas carregam uma carga negativa [8]. Embora já se soubesse que grandes populações de células bacterianas tendiam a manter uma carga negativa, pouco se sabe sobre a eletrofisiologia das bactérias no nível de células individuais. Em 2011, Cohen et al. revelou aumento elétrico em E. coli em até 1 Hz usando uma proteína indicadora de voltagem fluorescente [9]. Uma vez que muitos tipos de paredes celulares bacterianas têm carga negativa, as nanopartículas com carga positiva podem interagir fortemente com um amplo espectro de bactérias por meio de interações eletrostáticas.

Para aproveitar as nanopartículas magnéticas e a carga negativa de bactérias individuais para a detecção rápida de patógenos, projetamos um sistema para capturar bactérias em baixas concentrações. Nanopartículas magnéticas carregadas positivamente foram fabricadas por polietilenimina (PEI), que é composta por abundantes grupos amina. Em seguida, investigamos a afinidade de nanopartículas funcionalizadas com PEI contra E. coli . Este método inovador fornece ligação eficiente às bactérias por interações eletrostáticas.

Materiais e métodos

Nanomateriais

Hidrato de cloreto de ferro (III) (FeCl ₃ · 6H ₂ O), hidróxido de amônio (NH ₄ OH, 28% em peso), ácido clorídrico (solução aquosa a 37% em peso), etilenoglicol e acetato de sódio foram adquiridos em Shanghai (China) Reagent Company. Ortossilicato de tetraetila (TEOS), (3-aminopropil) trietoxissilano (APTES) e tetrametilrodamina de fluoresceína (TRITC) foram adquiridos na Sigma-Aldrich (EUA). Poli (etileno imina) ramificado (PEI, 99%, Mw =10.000) foi adquirido da Alfa Aesar. Todas as soluções foram preparadas usando água desionizada Milli-Q (18,2 MΩ cm a 25 ° C de resistividade).

NP Sínteses

Fe ₃ O ₄ nanopartículas foram preparadas por uma reação solvotérmica [10]. Resumidamente, 0,081 g de FeCl ₃ · 6H ₂ O foi dissolvido em 30 mL de etilenoglicol sob agitação magnética. Em seguida, foram adicionados a esta solução 0,3 g de ácido poliacrílico (PAA) e 1,8 g de ureia. Depois de ser agitada durante 30 min, a solução foi aquecida a 200 ° C durante 12 h usando uma autoclave de aço inoxidável forrada com Teflon. Quando resfriado à temperatura ambiente, um produto preto, ou seja, núcleos de nanopartículas magnéticas, foi coletado por um ímã. Seguido por lavagem com etanol e água desionizada cada três vezes, o Fe ₃ O ₄ nanopartículas foram tratadas com 0,15 M HCl sob sonicação por 15 min e, em seguida, foram revestidas com sílica por meio de hidrólise e TEOS.

Para preparar as nanopartículas magnéticas fluorescentes negativamente carregadas (NP−), o complexo APTES-TRITC (C33H44N3O6Si) foi primeiro reagido sob condições escuras durante a noite em etanol. O complexo foi então enxertado no Fe ₃ O ₄ nanopartículas através da reação entre APTES e grupos hidroxila no Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ Nano-partícula. Posteriormente, 30 μL de TEOS foram adicionados e reagiram por 24 h no escuro. Seguido por lavagem com etanol e água desionizada cada três vezes, foram produzidos NP- fluorescentes. Através da modificação de NP− com o polímero policatião PEI, as nanopartículas magnéticas carregadas positivamente (NP +) foram concluídas.

Caracterização NP

Os estudos de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram realizados por um TECNAI F ^{- 30} microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução operando a 300 kV. O tamanho de partícula e o potencial zeta de NPs foram determinados pela série Malvern Zeta Sizer Nano (Westborough, MA). A fluorescência foi examinada com um microscópio confocal de varredura a laser Carl Zeiss LSM5 EXITER (Zeiss, Jena, Alemanha).

Preparação de bactérias

A cepa Gram-negativa E. coli BL21 foram usados como a bactéria modelo. E. coli foi cultivado em 100 mL de meio de crescimento Luria Broth [11]. As bactérias foram cultivadas em incubadora termostática a 200 rpm, 37 ° C por 16 h. Posteriormente, foram retirados 100 μL da cultura bacteriana, diluídos com o meio 1 × 10 ⁵ vezes, revestido no ágar e cultivado a 37 ° C por 24 h. O número de unidades formadoras de colônias foi contado. As células bacterianas restantes foram colhidas por centrifugação a 5000 rpm por 5 min, lavadas três vezes com 1 × PBS (10 mM, pH 7,4) e diluídas para concentrações de aproximadamente 1 × 10 ³ unidade formadora de colônia (CFU) / mL. Por questões de segurança, todas as amostras bacterianas foram colocadas em uma autoclave a 121 ° C por 20 min para matar as bactérias antes do descarte e todos os utensílios de vidro em contato com as bactérias foram esterilizados antes e após o uso.

Experiência de captura de bactérias

Todos os estudos de captura de lote foram conduzidos em tampão PBS 1 × esterilizado. Quarenta microlitros de NPs (1 μg / μL) foram dispersos na solução salina esterilizada sob ultra-som por 10 min e, em seguida, 1 mL da solução bacteriana (aproximadamente 10 ³ CFU / mL) foi adicionado à suspensão. Após incubação de 10 min, as bactérias ligadas a NP foram capturadas por meio de um ímã permanente na parede do frasco e as bactérias livres foram removidas com a solução de lavagem. As bactérias capturadas foram liberadas pela remoção do ímã e ressuspensas em PBS. Para análise microscópica, uma alíquota de bactéria foi espalhada em lâminas e corada com Hema-3 (Fisher Diagnostics). Para a análise de imunofluorescência, uma alíquota de bactéria foi espalhada em lâminas e corada com 4′-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Eficiência de captura bacteriana de NPs em diferentes concentrações

Um mililitro de suspensão bacteriana (aproximadamente 2 × 10 ² CFU / mL) foi incubado com diferentes quantidades (5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 e 100 μg / mL) de NP + ou NP− por 10 min. Após a separação magnética pelas nanopartículas, a solução total foi então amostrada e analisada quanto à concentração bacteriana por meio de um método de contagem em placa. A eficiência de captura bacteriana dos NPs foi testada pela contagem do número de CFU nas placas de ágar LB.

Capacidade dos NPs de capturar bactérias em baixas concentrações

Quarenta microgramas de NP + ou NP− foram incubados com 1 mL de suspensão bacteriana em concentrações muito baixas (10 e 10 ² CFU / mL). Após a separação magnética pelas nanopartículas, a solução total foi então amostrada e analisada quanto à concentração bacteriana por meio de um método de contagem em placa. A eficiência de captura bacteriana dos NPs foi testada pela contagem do número de CFU nas placas de ágar LB.

Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP), conforme indicado nas legendas das figuras. Uma análise de variância bidirecional (ANOVA) com análise hoc adequada foi calculada usando o software GraphPad Prism com P valores <0,05 considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Caracterização de NPs magnéticos

O diagrama esquemático para a preparação das nanopartículas de compósito magnético com superfície carregada é exibido na Fig. 1. O Fe ₃ O ₄ nanopartículas são conjugadas com APTES para formar uma camada fina de SiO ₂ casca na superfície das nanopartículas após a reação com TEOS e NH ₄ OH. Para visualizar e quantificar as células capturadas diretamente, o complexo APTES-TRITC é inicialmente reagido, seguido por enxerto na superfície do Fe ₃ O ₄ @silica composites através de uma clássica reação sol-gel. Abundantes grupos de SiOH governam a superfície geral deste produto, exibindo uma forte carga de superfície negativa, ou seja, nanopartículas magnéticas carregadas negativamente (NP−). Para nanopartículas magnéticas carregadas positivamente (NP +), as moléculas de PEI são usadas para cobrir e modificar a superfície de NP−. O produto modificado mostra uma forte carga superficial positiva devido à presença abundante de grupos amina.

Desenho das nanopartículas. Diagrama esquemático mostrando o projeto de nanopartículas compostas superparamagnéticas (NPs) fluorescentes, com superfície carregada

Conforme mostrado na Fig. 2a, TEM demonstrou que nanopartículas de compósito magnético tinham um diâmetro de 450 nm, que eram compostas de SiO ₂ uniformizado revestimento (tamanho de 60 nm). O espalhamento dinâmico de luz (DLS) das partículas na Fig. 2b exibiu uma distribuição de tamanho estreita com um diâmetro médio aumentado após a funcionalização da superfície. Os tamanhos máximos das nanopartículas compostas com as cargas positivas e negativas são 620 e 700 nm, respectivamente. Nanopartículas medidas por DLS são geralmente maiores do que aquelas medidas por TEM. Isso ocorre porque o tamanho avaliado pelo DLS é influenciado pelo movimento browniano e depende da temperatura ambiente, do raio dinâmico da nanopartícula e da extensão da aglomeração das nanopartículas desencadeada por um ambiente estático por meio da ocorrência de conflito [12]. A Figura 2c mostra as distribuições de potencial zeta das nanopartículas negativas e positivas. Em água desionizada (pH 7,0), os potenciais zeta do NP− e NP + são - 26,6 mV e + 28,1 mV, respectivamente. As dependências do pH dos potenciais zeta para NP + são representadas no arquivo adicional 1:Figura S1. Estes resultados indicaram que as nanopartículas carregadas na superfície estão bem dispersas em solução aquosa em condições neutras, o que poderia ser aplicado para captura de células.

Caracterização das nanopartículas. a Imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de nanopartículas carregadas positivamente (NP +) e nanopartículas carregadas negativamente (NP−). b Tamanho de espalhamento de luz dinâmico e distribuição de NPs. c Distribuições de potencial Zeta de NPs

Capacidade de NPs magnéticos para capturar E. coli

A Figura 3 mostra o procedimento experimental geral de captura de bactérias. NPs foram misturados com uma solução de bactérias e incubados em temperatura ambiente por 10 min. Posteriormente, usamos um ímã permanente para capturar as bactérias “magnetizadas” (nanopartículas magnéticas ligadas à superfície da célula) na parede do tubo. Após a retirada da solução remanescente e lavagem dos agregados por PBS (com ímã externo), transferimos os agregados para uma lâmina para análise microscópica. Conforme mostrado no esquema, NP + fornece capacidade de resposta eletrostática suficiente para enriquecer rapidamente E. coli . Ao contrário, as bactérias são removidas com enxágue com PBS no experimento NP−.

Ilustração dos procedimentos de captura de bactérias. E. coli em suspensão são respectivamente misturados com NP + e NP−, seguidos por 10 min de incubação. As bactérias “magnetizadas” foram atraídas para a parede do frasco por um ímã. Após a remoção da solução remanescente, as bactérias foram capturadas por NPs, lavadas com PBS e contadas a partir do número de colônias bacterianas

Imagens ópticas para as nanopartículas são mostradas na Fig. 4. A imagem óptica de NP− mostrou as partículas monodispersas e uniformemente distribuídas. No entanto, NP + tendeu a se aglomerar. A distribuição de tamanho de NP + é obviamente mais ampla do que NP−. Esses resultados demonstraram que NP + e NP− tinham um padrão de interação completamente diferente com E. coli . Para investigar melhor a afinidade bacteriana de NP +, a localização NP + em E. coli foi examinado usando análise de fluorescência. A Figura 5a mostra que capturou E. coli são positivos para DAPI (cor azul) e TRITC (cor vermelha). A fim de confirmar claramente a afinidade de NP + para bactérias, a tecnologia TEM foi usada. Na Fig. 5b, uma série de NP + foi observada agregando-se na parede celular bacteriana. Esses resultados sugerem que NP + tem uma forte afinidade por bactérias.

Comparação de E. coli capacidade de ligação de NP + e NP−. As imagens à esquerda são os campos de contraste de fase da ligação das bactérias com NP +. As imagens certas têm apenas nanopartículas, sugerindo que NP− sem capacidade de ligação a E. coli células

Imagens fluorescentes e TEM de E. coli ligação com NP +. a Os painéis superiores mostram as imagens fluorescentes de E. coli células que se ligam a NP +. DAPI é usado para manchar o núcleo da célula. TRITC é rotulado em NPs. b Os painéis inferiores são imagens representativas de TEM que mostram NP + e E. coli complexos

Detecção de baixas concentrações de E. coli

Para caracterizar ainda mais a dinâmica das bactérias e as interações NP +, incubamos E. coli em um número constante (2 × 10 ² CFU / mL) com várias concentrações de NPs variando de 5 a 100 μg / mL. As bactérias ligadas a NP foram então capturadas magneticamente e separadas. As eficiências de captura magnética de bactérias por NP + e NP− são representadas graficamente como mostrado na Fig. 6. O número de E. coli capturado por NP− é de apenas 12%, mesmo em uma alta concentração de 100 μg / mL. Em contraste com NP−, NP + mostrou capacidades significativas de captura bacteriana e alcançou 81% de eficiência de captura com 40 μg / mL ( P <0,001). Como pode ser visto nas placas de ágar LB, foi demonstrado um aumento dependente da dose de colônias bacterianas com NP +.

Capture eficiências de E. coli por NP + ou NP− em várias concentrações indicadas. A imagem da esquerda é a fotografia de placas de ágar LB revestidas com E. coli capturado por NP + e NP−. A imagem da direita mostra a eficiência de captura bacteriana de NP nas diferentes concentrações indicadas. E. coli (2 × 10 ² CFU em 1 mL de solução de PBS) sem incubação de NP foi contado como 100% e serviu como controle. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001

A fim de confirmar a afinidade NP + para E. coli na concentração ultrabaixa, misturamos 40 μg NP com 1 ml de solução PBS contendo apenas 10 e 100 CFU de E. coli . A Figura 7 mostra fotografias das colônias resultantes em placas de ágar para todas as amostras. Como esperado, o NP + realmente capturou E. coli em uma concentração ultrabaixo, enquanto as colônias bacterianas não eram óbvias em placas usando NP−. As poucas colônias na placa podem ser atribuídas à afinidade não específica das nanopartículas. Uma análise posterior indicou que mais de 90% das eficiências de captura bacteriana foram obtidas em uma concentração ultrabaixa (10 e 100 UFC / mL) usando NP +. Em contraste, a eficiência de captura é inferior a 4% com NP− nas mesmas condições e tem uma diferença significativa ( P <0,001). Esses resultados sugerem que o NP + tem uma forte afinidade por bactérias, o que pode ser explicado pelas atrações eletrostáticas. Para investigar as propriedades de captura bacteriana de amplo espectro, empregamos três bactérias gram-positivas ( Bacillus subtilis , Staphylococcus aureus e Lactococcus lactis ) como modelos. Conforme ilustrado no arquivo adicional 1:Figura S2, NP + têm uma maior capacidade de adsorção de bacilos ( E. coli e B. subtilis ) do que estafilococos ( S. aureus ) e estreptococos ( L. lactis ) Além disso, também descobrimos que moléculas com carga negativa, como o 3-bromopiruvato (3-BP) e o DNA, podem interferir no efeito de captura bacteriana. Os mortos E.coli é inválido para tal sistema (Arquivo adicional 1:Figura S3).

Capture eficiências de E. coli por NP + ou NP− em concentrações ultrabaixo. A imagem da esquerda é a fotografia de placas de ágar LB revestidas com E. coli capturado por NP + e NP−. A imagem certa mostrou o E. coli eficiência de captura de NPs (40 μg / mL) com concentrações ultrabaixas de bactérias. E. coli (10 e 100 CFU em 1 mL de solução de PBS) sem incubação de NP foi contado como 100% e serviu como controle. *** P <0,001

Discussão

Sabe-se que ambas as bactérias gram-negativas (como, E.coli ) e bactérias gram-positivas (como B. subtilis ) interagem muito mais facilmente com partículas carregadas positivamente do que partículas carregadas negativamente por meio de atrações eletrostáticas [13, 14]. Isso também foi encontrado em nosso estudo. Uma vantagem em nosso sistema de captura é que as nanopartículas funcionalizadas com PEI têm mais grupos amina, que foram capazes de capturar bactérias em concentrações ultrabaixas. Até o momento, existem alguns ensaios gerais e satisfatórios que podem detectar bactérias em concentrações inferiores a 10 ² CFU / mL sem pré-enriquecimento de bactérias por meio de um processo de cultura. Este estudo exibiu um ensaio simples que usa nanopartículas eletricamente magnéticas para capturar e detectar bactérias gram-negativas (os organismos têm uma membrana citoplasmática, uma parede celular e uma membrana externa intacta) em 1 h a uma concentração de 10 UFC / mL.

Em nosso experimento, descobrimos que a carga superficial de NPs pode influenciar a eficiência de captura bacteriana. Aqui, os efeitos da carga na superfície de NPs nas eficiências de captura bacteriana foram estudados usando E. coli como uma bactéria modelo. Quando NP + foram usados no ensaio de captura, eles exibiram capacidade adsortiva eficiente da bactéria. As eficiências de captura bacteriana aumentaram com a dosagem de NP +. A microscopia TEM mostra agregados macroscópicos compostos por nanopartículas e células bacterianas. Em contraste, NP−, mesmo em altas concentrações, exibiu baixa capacidade de captura bacteriana. No geral, essas observações demonstraram que o NP + tem uma capacidade de captura significativamente maior do que o NP−.

Embora as bactérias gram-positivas e gram-negativas tenham diferenças em sua estrutura de membrana, a maioria delas tem uma carga negativa quando cultivadas em valores de pH fisiológicos [15, 16]. A carga da superfície celular das células bacterianas foi caracterizada por cromatografia de interação eletrostática (ESIC) [17]. A parede celular em bactérias gram-positivas é composta principalmente por uma espessa camada de peptidoglicano, que é incorporado ao ácido teicóico. Por outro lado, as bactérias gram-negativas possuem uma camada de lipopolissacarídeo na superfície externa seguida por uma fina camada de peptidoglicano. O ácido teicóico e os lipopolissacarídeos conferem uma carga negativa à superfície das células bacterianas [18]. Anteriormente, as nanopartículas de prata carregadas positivamente (AgNPs) exibiam notável eficácia contra os microrganismos, incluindo E. coli [19]. Eles descobriram que as partículas menores apresentam maior atividade antibacteriana. Consideramos que partículas maiores podem ter um benefício diferente de absorvibilidade bacteriana. Em primeiro lugar, as partículas maiores dificilmente atingem o conteúdo nuclear das células para causar a toxicidade para as bactérias. Em segundo lugar, eles podem fornecer uma área de superfície maior e, portanto, uma interação bacteriana mais forte. Portanto, nós projetamos e aplicamos nanopartículas maiores com carga positiva como um agente de “esponja” para capturar bactérias.

Conclusões

Em conclusão, por nanopartículas magnéticas de PEI, demonstramos um ensaio simples e rápido para permitir E. coli para ser capturado e analisado. Os arquivos existentes de perfis ópticos e TEM de bactérias permitem uma fácil identificação das bactérias capturadas. A alta recuperação fornecida por nanopartículas magnéticas carregadas positivamente permitirá a detecção de outras cepas de bactérias em concentrações ultrabaixas.

Abreviações

APTES:: 3-aminopropil trietoxissilano
CFU:: Unidade formadora de colônia
DLS:: Espalhamento de luz dinâmico
E. coli :: Escherichia coli
NP:: Nanopartículas magnéticas carregadas negativamente
NP +:: Nanopartículas magnéticas carregadas positivamente
NPs:: Nanopartículas
PAA:: Ácido poliacrílico
PEI:: Polietilenimina
SD:: Desvio padrão
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
TEOS:: Ortosilicato de tetraetilo
TRITC:: Tetrametilrodamina

Síntese ionotérmica de silício nanoporoso cristalino e seu uso como materiais de ânodo em baterias de íon-lítio Impedância de Superfície de Metasurfaces / Estruturas Híbridas de Grafeno

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias