Nanopartículas de ouro de formato redondo:efeito do tamanho da partícula e da concentração no crescimento da raiz de Arabidopsis thaliana

Resumo

Hoje em dia, devido a uma ampla gama de aplicações de nanopartículas (NPs) em muitas áreas industriais, o acúmulo dessas entidades no ambiente representa um grande risco. Devido à sua inércia, NPs de metal nobre podem permanecer em solos contaminados quase inalterados por muito tempo. Nesse contexto, a absorção de partículas pelas plantas, dependente do tamanho, da forma e da concentração, pertence a uma área inexplorada. Neste trabalho, apresentamos soluções de água de AuNPs esféricos sintetizados biologicamente amigáveis ​​com distribuição de tamanho bastante estreita na faixa de tamanho de 10 a 18 nm. Sua caracterização completa por espectroscopia de absorção atômica, plasma acoplado indutivamente equipado com espectroscopia de massa, dispersão de luz dinâmica (DLS) e métodos TEM foi seguida pelo estudo de seu efeito no crescimento de Arabidopsis thaliana (raízes primárias e laterais), de maneira dependente do tamanho da partícula e da concentração. Devido à forma estritamente redonda dos AuNPs e à ausência de aglomeração de partículas, o tamanho derivado de DLS e a distribuição de tamanho estavam em boa concordância com os obtidos a partir de TEM. O comprimento e o número de A. thaliana raízes laterais foram significativamente afetadas por todos os tipos de AuNPs. Os menores AuNPs na concentração mais alta inibiram o comprimento das raízes primárias e, em contraste, aumentaram o crescimento da raiz do cabelo.

Histórico

Hoje em dia, a química e a engenharia modernas produzem enormes quantidades de nanoobjetos para melhorar as propriedades de utilidade da matéria, não apenas em aplicações especiais, mas cada vez mais em produtos de consumo diário. Materiais nanoestruturados, ou seja, nanopartículas [1, 2], nanobastões [3], nanotubos [4], nanotêxteis não tecidos [5], conforme se encontram ou presos a diferentes tipos de suportes, aumentam significativamente os rendimentos em quase todas as áreas de aplicações industriais que variam desde cosméticos [6] e saúde [7], sobre bioengenharia [8, 9], até aplicações de conversão de energia [10] e catalisadores [3]. Embora a inclusão de nanomateriais nesses produtos possa melhorar seu desempenho, sua decomposição no final de sua vida útil fornece vários pontos-chave de entrada para NPs sintéticos no meio ambiente. NPs especialmente projetados, que têm sido amplamente utilizados em catalisadores, estabilizadores de corante de proteção UV, agentes antimicrobianos na indústria têxtil ou produtos de saúde e cosméticos (em particular aqueles de alta inércia química, como Au, Ag, Pt e Pd) devem receber atenção especial, pois podem se acumular no meio ambiente quase inalterados por muitos anos, desencadeando processos até então desconhecidos na sua absorção pelas plantas. Em relação às nanopartículas de metais nobres (NMNPs), alguns trabalhos pioneiros foram publicados sobre o efeito das nanopartículas de prata (AgNPs) em mudas de agrião ( Arabidopsis thaliana ), indicando que concentrações muito baixas de AgNPs (<1 ppm) podem ser tóxicas para as mudas [11]. AgNPs de 20 a 80 nm claramente atrofiaram o crescimento e sua fitotoxicidade depende da concentração e do tamanho de partícula. Observou-se que a ponta da raiz (capa e columela) ficava marrom claro quando as raízes primárias eram expostas aos AgNPs. A ponta marrom foi atribuída à adsorção de AgNPs em si ou em conjunto com materiais da parede celular ou metabólitos secundários produzidos pelas pontas das raízes. No entanto, o mecanismo exato ainda não foi elucidado.

Embora existam alguns estudos abordando o papel dos NPs no ambiente [12], aqueles que têm como alvo as nanopartículas de ouro (AuNPs) ainda são raros [13]. Se disponível, a maioria dos dados publicados sobre nanotoxicologia enfocou a citotoxicidade em mamíferos [14,15,16] ou impactos em animais e bactérias [17,18,19,20], e apenas alguns estudos consideraram a toxicidade de engenharia genética NPs para plantas. Além disso, a interação de NMNPs com plantas e outros organismos que compartilham semelhanças com células vegetais, como algas, tem sido pouco estudada até agora, o que implica que as consequências gerais da exposição a NMNPs para células vegetais ainda permanecem obscuras [11]. A falta desses dados leva a um entendimento incorreto de como os NMNPs são transferidos e acumulados nos vários níveis da cadeia alimentar.

Neste trabalho, relatamos o efeito das nanopartículas de ouro no crescimento das plantas, particularmente no desenvolvimento das raízes primárias e laterais de A. thaliana na presença de partículas de tamanhos diferentes. AuNPs foram sintetizados pelo método úmido sob protocolo biologicamente amigável sem estabilizadores, produzindo nanopartículas esféricas com controle preciso sobre seu tamanho e distribuição de tamanho. Antes do tratamento da planta, AuNPs foram completamente caracterizados por um amplo espectro de métodos analíticos (AAS, ICP-MS, DLS e TEM).

Experimental

Materiais, aparelhos e procedimentos

Nanopartículas de ouro foram sintetizadas por um procedimento ligeiramente adaptado publicado por Batús et al. [20]. Resumidamente, 149 mL de água foram aquecidos em um frasco de fundo redondo de dois gargalos de 250 mL até começar a refluxo. Em seguida, 1 mL de citrato de sódio 0,33 M e 0,945 mL de 10 mg / mL de tetracloroaurato de potássio (III) em água foram subsequentemente adicionados. Após 30 min, o aquecimento foi interrompido e a mistura reaccional foi deixada arrefecer. Em todas as experiências de preparação, foi usada água Milli-Q (18,2 M + a 25 ° C).

Para ensaios de raiz de A. thaliana , AuNPs sintetizados de três tamanhos diferentes (10, 14 e 18 nm) foram centrifugados a 5000 g por 1 h para aumentar a concentração de partículas até o valor limite de 2.000 mg / L.

A. thaliana Sementes Columbia (Col-0) (obtidas a partir de sementes Lehle, EUA) foram esterilizadas em superfície com 30% ( v / v ) solução de lixívia por 10 min e enxaguada cinco vezes com água esterilizada. As sementes estéreis foram semeadas em placas de ágar contendo ½ meio Murashige-Skoog (MS) e ágar vegetal a 1% (pH 5,8). Para sincronizar a germinação das sementes, as placas de ágar foram mantidas a 4 ° C por 2 dias. A. thaliana as plantas foram cultivadas por 5 dias em placas orientadas verticalmente em uma câmara de crescimento a 22 ° C com 100 μmol m ^{- 2} s ^{- 1} intensidade da luz em condições de dias longos (ciclo claro / escuro de 16 h / 8 h).

Mudas de cinco dias de idade de tamanho semelhante foram transferidas para placas de ágar (20 plantas por placa) contendo meio MS 1/16, diferentes concentrações de AuNPs (0, 1, 10 e 100 mg / L) e ágar vegetal a 1% ( pH 5,8). AuNPs foram adicionados ao meio após a autoclavagem. Como controle, o efeito do tampão citrato de sódio também foi investigado. O comprimento da raiz foi marcado e as mudas foram cultivadas pelos próximos 5 dias. Ambos, o incremento da raiz primária e o comprimento das raízes laterais foram medidos usando o software JMicroVision 1.2.7.

Métodos analíticos

As soluções preparadas de AuNPs foram caracterizadas por espectroscopia de absorção atômica (AAS), plasma acoplado indutivamente equipado com espectroscopia de massa (ICP-MS), espalhamento de luz dinâmico (DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM).

As concentrações de NPs preparados foram determinadas por meio de AAS por um dispositivo VarianAA880 (Varian Inc., EUA) usando um atomizador de chama com comprimento de onda de 242,8 nm. A incerteza típica de concentração determinada por este método é inferior a 3%.

Plasma indutivamente acoplado com detector de espectroscopia de massa (ICP-MS) foi usado para determinar a concentração de íons Au originados de uma fonte química de Au não reagida, usando o espectrômetro triplo quadrupolo Agilent 8800 (Agilent Technologies, Japão) conectado a um auto-amostrador. A solução colóide AuNPs foi pipetada em microtubos hidrofóbicos de 1,5 mL e centrifugada a 30000 g na centrífuga Eppendorf 5430 por 1 h. Após a centrifugação, 0,3 mL do sobrenadante foi cuidadosamente removido com pipeta e analisado o ICP-MS. A nebulização da amostra foi realizada usando um dispositivo MicroMist equipado com uma bomba peristáltica. A solução tampão pura (citrato de sódio 2,2 mM) foi usada como uma amostra em branco. A incerteza da medição foi inferior a 3%.

As imagens TEM foram medidas usando JEOL JEM-1010 (JEOL Ltd., Japão) operado a 400 kV. A gota da solução coloidal foi colocada em uma grade de cobre revestida com um filme fino de carbono amorfo em um papel de filtro. O excesso de solvente foi removido. As amostras foram secas ao ar e mantidas sob vácuo em um dessecador antes de colocá-las em um porta-amostras. O tamanho de partícula foi medido a partir das micrografias TEM e calculado levando em consideração pelo menos 500 partículas.

A distribuição do tamanho de partícula foi determinada por Zetasizer ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Inglaterra) no regime DLS para distribuição de tamanho de partícula, equipado com um fotodiodo de avalanche para detecção de sinal. Laser de estado sólido com bomba de diodo (50 mW, 532 nm) foi usado como fonte de luz. As medições foram realizadas em cubetas de poliestireno à temperatura ambiente.

Resultados e discussão

Caracterização de nanopartículas

Tamanho e distribuição de tamanho de AuNPs foram determinados por análises TEM e DLS. Os resultados estão resumidos na Tabela 1, juntamente com as concentrações de AuNP determinadas por AAS imediatamente após a síntese de NPs e as concentrações de íons Au residuais determinadas por ICP-MS. A partir desses dados, é evidente que nosso protocolo de síntese fornece nanopartículas de Au com tamanho bem controlado com distribuição de tamanho bastante estreita. Aqui, usamos o método modificado publicado por Batús et al. [20] para a síntese de AuNPs estabilizados por citrato com tamanho e forma controlados. O protocolo desenvolvido permite a extensão de tamanho direcionada com base no aumento de AuNPs pré-sintetizados por meio de redução catalisada de superfície de Au ³⁺ junto com a inibição simultânea efetiva da nucleação secundária.

Wang et al. [21] descobriram que durante uma exposição hidropônica de 3 dias a A. thaliana para Ag ⁺ e AgNPs (5 nm) na mesma concentração, a concentração de Ag diminuiu mais rapidamente no Ag ⁺ -solução tratada do que na AgNP, indicando absorção mais rápida de Ag ⁺ íons. Portanto, tomamos atenção especial para minimizar o possível efeito dos íons Au na distorção do resultado. AuNPs sintetizados como foram centrifugados até a concentração limite de 2.000 mg / L e diluídos com meio MS para as concentrações necessárias (1, 10 e 100 mg / L). Após este procedimento, a concentração de íons Au residuais em soluções contendo 100 mg / L de AuNPs foi determinada por ICP-MS (ver Tabela 1). Aparentemente, a centrifugação teve efeito positivo na presença de íons Au residuais cujas concentrações foram reduzidas em duas ordens de magnitude em comparação com as soluções sintetizadas (Tabela 1, AAS) e no conteúdo do próprio tampão citrato.

Para quantificar a polidispersidade NP, realizamos a medição DLS, que é muito sensível à presença de conglomerados de partículas eventualmente formados (Fig. 1). Nesta medição, mesmo uma pequena quantidade de NPs aglomerados causa a dominância do pico correspondente em diâmetros consideravelmente mais altos, especialmente na distribuição de tamanho de intensidade ponderada (ver inserção na Fig. 1). Felizmente, nenhuma aglomeração de partículas foi detectada e, portanto, a credibilidade da avaliação do tamanho pode ser afetada apenas pela aproximação esférica [22]. Apesar dessa desvantagem, a medição DLS fornece um quadro geral estatisticamente mais significativo da distribuição do tamanho de partícula em comparação com o TEM, uma vez que avalia todo o volume da amostra de uma vez. Devido à natureza predominantemente de formato redondo dos NPs preparados (ver Fig. 2), os tamanhos derivados de DLS estavam em bom acordo com aqueles obtidos por TEM (Tabela 1). Aglomerados de partículas aparentes, visíveis na imagem TEM (Fig. 2, 10 nm), foram mais provavelmente causados ​​pela necessidade de remoção de solvente nas medições de TEM, ao invés da interconexão de partículas individuais na própria solução colóide.

Análise dinâmica de espalhamento de luz (distribuição de tamanho ponderada em número) de soluções aquosas de AuNPs de diferentes tamanhos. A inserção mostra dados de intensidade ponderada “brutos”. Os números referem-se ao diâmetro médio das partículas em nm

Imagens TEM do conjunto preparado de AuNPs. Observe que a ampliação da imagem difere para tamanhos NPs específicos

Adaptação de soluções de nanopartículas para atender às condições da biologia vegetal

Devido à forte tendência de agregação de AuNPs em meios de crescimento de plantas (meio MS), comumente usados ​​para o crescimento de plantas in vitro [23], tivemos que otimizar a proporção mútua desses dois componentes para evitar a agregação de NPs, preservando as condições aceitáveis ​​para o crescimento da planta. Diferentes diluições de MS foram testadas. A agregação de AuNPs foi facilmente visível pela mudança de cor (transição de vermelho para roxo). Devido à baixa concentração inicial de AuNPs sintetizados (cerca de 30 mg / L, ver Tabela 1), insuficiente para experimentos biológicos, foi necessário aumentar a concentração de NP por centrifugação. Por este procedimento, aumentamos a concentração de partículas até o valor limite de 2.000 mg / L. Essas soluções de NPs foram então diluídas para as concentrações finais, o que também diminuiu a concentração do tampão citrato em nossos experimentos. Para experimentos de cultivo de A. thaliana , diluímos AuNPs em meio MS 1/16. A agregação mínima de NPs foi detectável neste meio e os NPs eram muito mais estáveis ​​em comparação com 1/2 MS, 1/4 MS e 1/8 MS com crescimento de planta quase inalterado. A concentração de AuNPs nas soluções finais foi determinada por AAS. Como os experimentos de crescimento das plantas foram realizados in vitro (em condições estéreis), o efeito do procedimento de esterilização em NPs também foi estudado. A autoclavagem comumente usada (121 ° C, 20 min) do meio de crescimento preparado causou a agregação completa dos NPs investigados. Portanto, este procedimento não foi adequado para nossos experimentos. A adição de NPs em meio de ágar autoclavado a cerca de 60 ° C foi finalmente usada como um procedimento alternativo em que nenhuma agregação de NP foi detectada e o processo de esterilização ainda era eficaz.

Efeito de NPs no crescimento da raiz de Arabidopsis thaliana in vitro

Plantas modelo, como dicot A. thaliana têm o potencial de ajudar a entender os fatores de estresse que reduzem os rendimentos globais das culturas com o objetivo de identificar genes que podem melhorar a viabilidade sob condições de estresse [24]. Todas as formas testadas de AuNPs tiveram efeito significativo nas raízes laterais (LRs). Tanto o comprimento (Fig. 3a) quanto o número (Fig. 3b) de LRs foram reduzidos em plantas tratadas com AuNP. As maiores concentrações de AuNPs (100 mg / L) de todos os tamanhos de partícula investigados diminuíram o comprimento dos LRs para cerca de 50%. O número de LRs diminui para cerca de 70% no caso de AuNPs de 18 nm e a concentração mais alta (100 mg / L). Uma redução ligeiramente menor do número de LRs foi observada quando a maior concentração de AuNPs menores (14 e 10 nm) foi usada (Fig. 3b). O comprimento das raízes primárias também diminuiu após o tratamento com AuNP (Fig. 3c). O efeito negativo do AuNP de 10 nm foi considerável, especialmente em concentrações de partículas mais altas. O efeito de partículas maiores (14,18 nm) foi muito menor e semelhante ao efeito do tampão de citrato de sódio que foi usado como controle. A maioria dos estudos publicados com NPs projetados indica certo grau de fitotoxicidade, especialmente em altas concentrações de NP. Por exemplo, AgNPs revestidos com citrato inibiram A. thaliana alongamento da raiz da muda com uma resposta linear à dose de 67 a 535 μg / L após 2 semanas [25]. Vários outros estudos usando o alongamento da raiz e ensaios de germinação de sementes demonstraram que a fitotoxicidade foi afetada pelo tamanho dos NPs. Muitos estudos concluíram que quanto menores os NPs, mais fitotóxicos eles são. No entanto, esta generalização sobre a toxicidade dependente do tamanho dos nanomateriais projetados nem sempre é verdadeira para todas as combinações de plantas e tipos de NPs [21, 25]. Ao contrário disso, os nanotubos de carbono de parede única afetaram positivamente o alongamento da raiz do tomate, repolho, cenoura e alface em 24 a 48 h [26]. O efeito positivo de AuNPs de 24 nm na taxa de germinação das sementes e no crescimento vegetativo foi relatado por Kumar et al. [13].

Efeito de AuNPs em a comprimento e b número de raízes laterais e c alongamento da raiz primária de A. thaliana mudas. As plantas foram expostas a diferentes concentrações (0,1, 10 e 100 mg / L) de AuNPs de 10, 14 e 18 nm. Os dados são médias + DP de 19–20 plantas. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; t teste

Efeito positivo substancial de AuNPs de 10 nm no crescimento do cabelo da raiz foi observado durante os experimentos de crescimento da raiz (Fig. 4). Este efeito exibiu forte dependência da concentração. O aumento da concentração de NP induziu um crescimento mais pronunciado dos pelos da raiz (Fig. 4e). Este comportamento foi freqüentemente observado em raízes cultivadas em solos pobres em fósforo [27]. Um efeito semelhante não foi observado no caso de AuNPs de 14 e 18 nm. Ao contrário, García-Sánchez et al. [28] observado, durante A. thaliana tratamento com AgNPs disponíveis comercialmente, inibição em uma série de fios de cabelo relacionados a 1 cm da raiz da planta. A diminuição da raiz do cabelo foi observada no caso de todas as partículas testadas, independentemente do seu tamanho específico (10, 20, 40 e 80 nm), utilizando uma concentração uniforme de soluções de tratamento de 200 mg / L. Os pelos da raiz aumentam substancialmente a área de superfície da raiz em contato com o solo, e a maior parte da água e dos nutrientes que entram na planta são absorvidos por eles. Assim, seu desenvolvimento é significativamente afetado por estímulos ambientais e sinais de estresse [29].

Efeito de diferentes concentrações de AuNPs de 10 nm no crescimento do cabelo da raiz em A. thaliana mudas. a Controle, b - d mudas tratadas com 1, 10 e 100 mg / L de AuNPs, respectivamente, e e detalhe do crescimento induzido do cabelo da raiz em planta exposta a 100 mg / L de AuNPs. As barras de escala correspondem a 1 cm

Conclusões

Preparamos com sucesso nanopartículas de ouro por redução suave de dois componentes (citrato de sódio-tetracloroaurato de potássio) em ambiente aquático, fornecendo partículas redondas e estreitas com excelente controle sobre o tamanho resultante. A centrifugação pós-síntese permitiu atingir as concentrações desejadas de NPs e eliminou a influência dos íons e do tampão citrato na distorção dos resultados em experimentos com plantas. O efeito de AuNPs de diferentes tamanhos (10, 14 e 18 nm de diâmetro) e concentrações (1, 10 e 100 mg / L) no crescimento da raiz de A. thaliana foi investigado. O número e o comprimento das raízes laterais diminuíram significativamente após o tratamento com soluções de NPs de maiores concentrações de partículas, independentemente do seu tamanho específico. Um efeito negativo no crescimento da raiz primária foi observado no caso de AuNPs de 10 nm. Surpreendentemente, os menores AuNPs (10 nm) induziram claramente o crescimento do cabelo da raiz. No geral, este estudo mostrou que a exposição direta de plantas a AuNPs contribuiu significativamente para a fitotoxicidade e ressalta a necessidade de descarte eco-responsável de resíduos e lamas contendo nanopartículas de Au.

Abreviações

AAS:

Espectroscopia de absorção atômica

AgNPs:

Nanopartículas de prata

AuNPs:

Nanopartículas de ouro

DLS:

Espalhamento de luz dinâmico

ICP-MS:

Espectroscopia de massa equipada com plasma indutivamente acoplado

LRs:

Raízes laterais

MS:

Murashige e Skoog

NMNPs:

Nanopartículas de metal nobre

NPs:

Nanopartículas

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

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