Uma nanopartícula magnética de dupla segmentação para detecção de câncer humano

Resumo

Os tumores malignos são uma grande ameaça à vida humana e a alta densidade de vasos linfáticos está frequentemente associada a tumores metastáticos. Com a descoberta de moléculas direcionadas ao sistema linfático, como o receptor de hialuronana endotelial dos vasos linfáticos 1 (LYVE-1) e a Podoplanina, muitos estudos foram realizados para determinar o papel das células endoteliais linfáticas (LECs) na metástase tumoral. No entanto, desvantagens como não especificidade e alto custo limitam suas aplicações de pesquisa e diagnóstico. Neste estudo, Fe ₃ O ₄ @KCTS, um tipo de núcleo-casca de nanopartículas magnéticas, foi preparado ativando Fe ₃ O ₄ com carbodiimida e reticulação com α-cetoglutarato quitosana (KCTS). Os anticorpos LYVE-1 e Podoplanina foram então incorporados à superfície dessas nanopartículas magnéticas e, como resultado, nanossondas magnéticas de duplo direcionamento foram desenvolvidas. Os testes experimentais deste estudo demonstraram que uma nanossonda magnética de duplo direcionamento com LECs de alta pureza de tecidos tumorais foi desenvolvida com sucesso, fornecendo uma base para a aplicação clínica de LECs no tratamento do câncer colorretal, bem como no diagnóstico clínico precoce usando imagens bimodais.

Introdução

Os tumores malignos representam uma grande ameaça à saúde humana [1]. Estudos anteriores demonstraram que o microambiente tumoral afeta as características biológicas dos tumores, como metástases relacionadas ao tumor [2, 3]. No entanto, os mecanismos potenciais, particularmente o processo pelo qual as células endoteliais linfáticas (LECs) promovem a metástase tumoral, ainda não estão claros [4]. Portanto, é necessário projetar estratégias de diagnóstico para tumores com base no direcionamento dos vasos linfáticos. A falta de marcadores linfáticos específicos, especialmente aqueles que distinguem LECs do endotélio vascular, limita a pesquisa sobre as funções de LECs. Nos últimos anos, marcadores específicos de LECs, como receptor de hialuronano endotelial de vasos linfáticos 1 (LYVE-1) [5, 6], Podoplanina [7], receptor de fator de crescimento endotelial vascular 3 (VEGFR-3) [8] e Prox -1 foram identificados [9]. Isso acelerou a pesquisa em vasos linfáticos tumorais, especialmente ao direcionar os vasos endolinfáticos tumorais para diagnosticar tumores. Também permitiu estudos sobre o mecanismo de metástase tumoral por classificação de células endolinfáticas endolinfáticas usando esferas imunomagnéticas [10]. No entanto, semelhante a muitos outros marcadores usados em patologia molecular, nenhum dos marcadores moleculares associados a LECs é completamente específico para LECs. Devido à expressão transitória de Prox-1 no núcleo [11], não é adequado para aplicações clínicas. Embora o VEGFR-3 seja expresso em LECs, ele carece de especificidade linfática no câncer porque também é expresso no epitélio vascular [8]. LYVE-1 é especificamente expresso em LECs, bem como em sinusóides hepáticos normais, endotélio do baço, vênulas endoteliais altas, bem como macrófagos de tecido ativado, mas não é expresso no epitélio vascular [7]. A podoplanina não é expressa em células epiteliais vasculares, mas é um marcador específico para LECs [7, 12].

Óxido ferroférrico magnético, ouro nano, pontos quânticos, lipossomas e óxido de titânio são amplamente usados no diagnóstico e tratamento de câncer por causa de sua alta biocompatibilidade, grande área de superfície específica e fácil de modificar com outras moléculas funcionais biológicas [13, 14]. Além das características acima, óxido ferroférrico magnético (Fe ₃ O ₄ ) tem uma distribuição de tamanho estreita, boa dispersibilidade, alto paramagnetismo e tamanho controlável, tornando-o adequado para imagens de ressonância magnética [15]. Entre eles, o óxido de ferro superparamagnético revestido com anticorpos tem sido amplamente utilizado na separação celular, reconhecimento e diagnóstico precoce de tumores [16, 17]. Como uma substância natural de alto peso molecular, a superfície da quitosana é rica em grupos hidroxila e amino, e tem sido amplamente utilizada devido às suas excelentes propriedades, como biocompatibilidade, compatibilidade sanguínea, segurança e degradabilidade microbiana [18]. Portanto, a combinação de quitosana ou derivado de quitosana e Fe magnético ₃ O ₄ é mais propício para aplicações biológicas, porque pode evitar que os grânulos magnéticos se aglomerem entre si para formar fluidos magnéticos. Por este motivo, produz um melhor desempenho de dispersão.

Na pesquisa de tumores, a detecção de vasos linfáticos em tumores é baseada na marcação direta com anticorpos ou por meio de um anticorpo combinado com esferas magnéticas para classificar as células endoteliais linfáticas. Aqui, para direcionar os vasos linfáticos intratumorais com mais precisão, projetamos uma nanossonda multi-direcionada, ou seja, dois anticorpos altamente específicos contra células endoteliais linfáticas, anticorpo anti-Lyve-1 e anticorpo anti-podplanina. Esses anticorpos foram ligados a nanopartículas de tetróxido de ferro revestidas com quitosana. Em comparação com outras nanossondas, as nanossondas projetadas neste estudo contendo dois anticorpos são mais precisas para a detecção de vasos linfáticos e as células endoteliais linfáticas isoladas são, portanto, mais puras.

Neste estudo, para enriquecimento rápido e isolamento de LECs de células cancerosas humanas, um ligante com uma especificidade relativamente alta para o anticorpo anti-LYVE-1 e o anticorpo anti-podplanina foram usados para facilitar a ligação às nanopartículas superparamagnéticas revestidas com quitosana para preparar nanopartículas magnéticas esferas para selecionar LECs. Também foi verificado que a sonda era capaz de diagnóstico bimodal de tumores sólidos.

Materiais e Método

Linha celular e condições de cultura celular

A linha de células de câncer de cólon (HT29), que foi adquirida do banco de células ATCC, foi cultivada a 37 ° C em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, EUA) que contém 10% de soro fetal bovino ( Gibco, Grand Island, NY, EUA), 100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina, abaixo de 5% de CO ₂ .

Modelo Animal Experimental

Quarenta camundongos fêmeas NOD / SCID (4-6 semanas de idade) foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Pequim, China). As células HT29 cultivadas em fase log foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após digestão com tripsina, as células foram centrifugadas a 1000 rpm por 5 min. As células foram então ressuspensas em PBS e a concentração de células foi ajustada para 2 × 10 ⁷ / mL. Cada camundongo foi injetado com 200 μL da suspensão de células. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais da Universidade Médica de Guangxi (Guangxi, China).

Preparação e caracterização de Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-Nanossondas magnéticas de anticorpo duplo

A quitosana (Xi’an Ruixi Biotechnology) foi carboxilada com ácido α-cetoglutárico para obter α-cetoglutarato carboximetilquitosana (KCTS) rico em grupos CO em sua superfície [19]. Fe ₃ O ₄ (Xi’an Ruixi Biotechnology) foi usado como o núcleo e KCTS foi definido como a estrutura básica do esqueleto. Depois de ativar o Fe ₃ O ₄ nanopartículas com carbodiimida, Fe ₃ O ₄ @KCTS foi formado pela combinação da ligação covalente de KCTS-COOH e superfície-OH. Os anticorpos LECs selecionados foram especificamente para anticorpo humano LYVE-1 APC-conjugado (R&D Systems®, Cat. No. FAB20892A) e anticorpo anti-podoplanina (FITC) (Abcam, Cat. No. ab205333). Estes anticorpos foram reticulados covalentemente com Fe ₃ carboxilado O ₄ @KCTS usando EDC / NHS ativado. Consequentemente, nanossondas magnéticas modificadas com anticorpos duplos LECs, referidas como Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-Nanossonda magnética de anticorpo duplo (0,1 mg / mL) foram obtidos. As nanopartículas conjugadas com anticorpo duplo foram preservadas no escuro a 4 ° C.

A morfologia e distribuição de tamanho do Fe ₃ preparado O ₄ @ KCTS-LECs-Nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo foram avaliadas usando microscópio eletrônico de transmissão (TEM; H-7650, Japão). O tamanho de partícula (tamanho), potencial Zeta e índice de dispersão de partícula (PDI) do Fe ₃ O ₄ @ KCTS-Double anticorpo foram medidos usando dispersão de luz dinâmica (DLS; PRO3000, Japão), e sua fotoluminescência foi medida com um espectrofotômetro de fluorescência (FL-7000, Perkin Elmer, EUA).

Imunohistoquímica e Imunofluorescência

Seções de tecido congelado foram preparadas e colocadas em acetona de gelo por 10 min e então imersas em solução de PBS por 10 min. Após bloqueio em BSA a 1% e lavagem três vezes com PBS, as seções foram incubadas com anticorpo humano LYVE-1 APC conjugado e anticorpo anti-podoplanina (FITC) a 4 ° C por 30 min. Após a incubação, as seções foram imersas três vezes em solução de PBS após o que uma solução de coloração 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) foi adicionada ao tecido tumoral para cobrir completamente os tecidos. As seções foram incubadas novamente por 5 min em temperatura ambiente. Posteriormente, foram lavados três vezes com PBS, seguido pela adição de agente anti-fluorescência de extinção quando as seções estavam completamente secas. Finalmente, as seções foram montadas em uma lamínula e observadas em um microscópio confocal (Nikon DS-Ri1; Nikon, Tóquio, Japão).

Tecidos de câncer de cólon preservados em formalina foram incluídos em parafina para este estudo. Seções desparafusadas de xenoenxertos de câncer HT29 foram bloqueados com peróxido de hidrogênio a 3%, bloqueados em soro normal a 5% e incubados com anticorpo anti-LYVE-1 (Abcam, ab10278, Reino Unido) durante a noite a 4 ° C. A seguir, o anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG H&L (HRP) (ab205718) marcado com biotina no reagente de marcação de superstreptavidina conjugada com peroxidase de rábano foi incubado por 30 min. A cor foi medida usando solução de 3,3′-diaminobenzidina (DAB).

Purificação de células

O volume médio dos tumores era de cerca de 1,5 × 1 × 1 cm ³ . Antes de remover os tumores, os camundongos foram desinfetados por imersão em etanol 75% por 3-5 min. A pele desinfetada dos camundongos foi cortada com tesouras e pinças esterilizadas em uma bancada limpa. O tecido tumoral foi cuidadosamente excisado e colocado em uma placa de Petri contendo PBS. O tecido tumoral embebido foi então cortado com tesoura oftálmica e colocado em placa estéril. O tecido desfiado foi pipetado para um tubo de centrífuga de 50 mL usando um tubo pasteurizado. Em seguida, adicionou-se ao tubo três vezes o volume de colagenase I e agitou-se no vórtex durante 10 minutos para obter uma mistura de tecido tumoral colagenase I. A mistura foi então colocada num banho de água a 37 ° C durante 20 min e isto foi repetido cinco vezes. No final da digestão, a colagenase I foi interrompida pela adição de um meio completo e a mistura foi deixada em repouso por 2 min. Após centrifugação a 300 g por 10 min, os tumores foram lavados duas vezes com PBS, então ressuspensos em 10 mL de PBS e filtrados lentamente através de uma peneira com um tamanho de poro de 75 μm (malha 200). As células filtradas foram contadas, calculadas em dois tubos de centrífuga de 15 mL, ressuspensas em PBS, depois centrifugadas a 300 g por 10 min e depois lavadas três vezes. (1) Método de classificação de esferas magnéticas MACS:as células lavadas foram ressuspensas em 100 μL de tampão. Uma solução contendo PBS pH 7,2, 0,5% BSA e 2 mM EDTA foi preparada diluindo a solução estoque MACS BSA (Cat. No. 130-091-376) a 1:20 com solução de enxágue auto MACS ™ (Cat. No. 130 -091-222). Em seguida, 10 μL de anticorpo humano LYVE-1 APC-conjugado foram adicionados e, em seguida, incubados a 4 ° C por 15 min no escuro. Por fim, foi lavado três vezes com 2 mL de solução tampão. Após a centrifugação, 80 μL de solução tampão foram adicionados para ressuspender as células e 20 μL de solução de esferas magnéticas de fluoresceína anti-APC foram adicionados. A mistura foi incubada por 15 min, lavada três vezes, centrifugada e bem misturada com 300 μL de solução tampão. Finalmente, as células positivas na coluna foram rapidamente eliminadas com 3 mL de solução tampão. As células resultantes foram cultivadas em uma placa de seis poços. (2) Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-método de classificação de nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo:as células lavadas foram ressuspensas em 200 μL de tampão, misturadas com Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo, incubadas a 4 ° C por 20 min no escuro, depois lavadas três vezes com 4 mL de tampão, centrifugadas e ressuspensas em 160 μL de tampão. Finalmente, as células foram eluídas usando um ímã e cultivadas em uma placa de 6 poços.

Imunofluorescência de células classificadas por métodos diferentes

As células classificadas por diferentes métodos de classificação foram ajustadas para uma concentração de células de 5 × 10 ⁴ / mL com PBS, e espalhe uniformemente em uma placa de 12 poços. Um mililitro da suspensão de células foi adicionado a cada poço e depois cultivado a 37 ° C por 24 h em 5% de CO ₂ em torno da. O meio antigo foi então descartado e as células foram lavadas três vezes com solução de PBS. Em seguida, 200 μL de paraformaldeído a 4% foram adicionados a cada poço e as células foram mantidas em temperatura ambiente por 10 min. As células foram então lavadas três vezes com solução de PBS, anticorpo LYVE-1 humano conjugado com APC e anticorpo anti-podoplanina (FITC) foram adicionados. Após incubação no escuro a 4 ° C durante 2 h, as células foram lavadas três vezes. Além disso, 50 μL de DAPI foram adicionados a cada poço e incubados em temperatura ambiente por 10 min para tingir os núcleos de azul seguido de lavagem três vezes com PBS. Por último, o inibidor de anti-fluorescência foi colocado no centro da lâmina, e o lado coberto de células foi colocado em uma lâmina de vidro e observado usando um microscópio confocal de varredura a laser.

Citometria de fluxo de células classificadas por métodos diferentes

As células classificadas por diferentes métodos foram ressuspensas com anticorpo humano LYVE-1 APC-conjugado e anticorpo anti-podoplanina (FITC) em 200 μL de tampão de ligação (HEPES / NaOH 10 mM pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM) , e incubado a 4 ° C por 1 h no escuro, depois lavado três vezes com PBS. As células foram detectadas e analisadas por citometria de fluxo (BD Accury6; Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) e depois analisadas pelo software FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR, EUA).

Detecção de atividade de LECs

As células da fase de crescimento logarítmica classificadas por diferentes métodos foram coletadas, digeridas e contadas. A concentração de células foi ajustada para 2 × 10 ⁵ células / mL e 50 μL dessas células foram adicionados a cada poço de uma placa de lâmina μ revestida com Matrigel e incubados em um CO 5% ₂ incubadora a 37 ° C por 6 h. O meio foi separado e descartado com conta-gotas pasteurizado seguido pela adição de solução de PBS contendo 1 μg / mL de calceína AM (Invitrogen, Cat. No. c3099). As células foram então incubadas à temperatura ambiente durante 1 h no escuro, lavadas com PBS e fotografadas ao microscópio (Nikon, Japão). Depois disso, 1 × 10 ⁵ as células foram misturadas com 500 μL de meio completo contendo 20 μg / mL de DiI-ac-LDL (Molecular Probes, Invitrogen) e, em seguida, inoculadas em uma placa de 24 poços a 37 ° C por 4 h. A solução de cultura antiga foi removida e as células foram lavadas três vezes em PBS. Em seguida, 50 μL de solução DAPI foram adicionados a cada poço e incubados por 10 min em temperatura ambiente para tingir os núcleos de azul. Depois de lavar três vezes com PBS, eles foram finalmente fotografados em um microscópio.

Imagem de RM e fluorescência in vivo

As etapas a seguir foram seguidas para determinar se o tumor era direcionado por Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo em animais. O modelo de xenoenxerto subcutâneo de camundongo NOD / SCID de câncer de cólon foi usado para ressonância magnética ou varredura de fluorescência. A imagem ponderada em T2 foi conduzida em uma condição específica que incluiu campo de visão (80 × 80 mm), tempo de eco (69 ms) e espessura da camada (2,0 mm) usando um scanner de ressonância magnética 3.0T (Discovery 750, gE, alemanha) , tendo uma bobina de volume de mouse de 40 mm de diâmetro. Os camundongos NOD / SCID foram divididos em dois grupos ( n =3); o grupo experimental e o grupo de bloqueio do receptor. Todos os camundongos foram injetados com Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-anticorpo duplo (0,5 mmol / kg) nanopartículas magnéticas através da veia da cauda. Cada camundongo foi examinado em quatro pontos de tempo específicos:antes da injeção, 0,5 h, 12 h e 24 h após a injeção. No grupo de bloqueio do receptor, cada camundongo foi injetado com anticorpo anti-LYVE-1 (Abeam, ab10278, UK) e anticorpo anti-podoplanina (Abcam, ab10288, UK) antes da injeção com Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-anticorpo duplo. Varreduras de ressonância magnética foram realizadas nos mesmos quatro momentos. As imagens de fluorescência foram obtidas usando o sistema de imagem in vivo de pequenos animais (Bruker, EUA). Os pontos de tempo para agrupamento, injeção de drogas e varredura foram os mencionados acima.

Toxicidade do Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-Nanossonda magnética de anticorpo duplo

Toxicidade de Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanossonda magnética de anticorpo duplo contra LECs foi avaliada pelo ensaio CCK-8. Células (100 μL de meio, 2 × 10 ⁵ / mL) foram cultivadas durante a noite em placas de 96 poços a 37 ° C em atmosfera humanizada contendo 5% de CO ₂ , então tratado com Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanossonda magnética de anticorpo duplo (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg / mL) por 24 ou 48 h sob a mesma condição. Após a incubação, 10 μL de solução de CCK-8 foram adicionados a cada poço, seguido por outra incubação por 2 h. A densidade óptica (DO) foi medida a 450 nm por leitor de microplacas ELISA (Thermo Scientific, EUA).

Para avaliar a toxicidade do Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanossonda magnética de anticorpo duplo in vivo, camundongos NOD / SCID fêmeas receberam uma injeção na veia da cauda única de 200 μL de PBS (grupo de controle) ou Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanossonda magnética de anticorpo duplo (2 mg / mL) ( n =3 animais por grupo). Após 1 semana, os camundongos foram sacrificados, seções dos principais tecidos (coração, pulmão, fígado, baço, rim) foram obtidas e imersas em solução de formaldeído a 10%, desidratadas e incluídas em parafina. Cortes parafinizados (4 μm de espessura) foram cortados e corados com hematoxilina-eosina.

Análise de data

O software estatístico SPSS 16.0 foi utilizado para a análise dos dados. Os dados das medidas foram expressos em x ± s, a comparação entre os grupos foi feita por análise de variância e a comparação dos dados de contagem foi feita pelo teste do qui-quadrado. P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultado

Princípio de uma nanopartícula magnética de dupla segmentação para detecção de câncer humano

Neste estudo, conforme mostrado no Esquema 1, Fe ₃ O ₄ @KCTS, um tipo de núcleo-casca de nanopartículas magnéticas, foi preparado ativando Fe ₃ O ₄ com carbodiimida e reticulação com α-cetoglutarato quitosana (KCTS). O LYVE-1 e os anticorpos de podoplanina foram então adicionados à superfície dessas nanopartículas magnéticas, formando nanossondas magnéticas de duplo direcionamento. Essas sondas foram injetadas em modelos de camundongos através da veia da cauda para diagnosticar o tumor por imagens de RM ponderadas em T2 e imagens de fluorescência. Após a excisão, o tumor foi esmagado em uma única célula e então incubado com a sonda para identificar as células endoteliais de linfócitos com maior pureza por um ímã para explorar o mecanismo de metástase do tumor. Os resultados demonstraram que uma nanossonda magnética de duplo direcionamento que fornece LECs de alta pureza de tecidos tumorais foi desenvolvida com sucesso, fornecendo uma base para a aplicação clínica de LECs em câncer colorretal, bem como no diagnóstico clínico precoce por imagem de modo duplo de câncer colorretal.

Ilustração esquemática de Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo

Caracterização de Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-Nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo

Imagens TEM (Fig. 1a) mostraram que Fe ₃ nu O ₄ é irregular com esférico e possui aglomerados entre as partículas. Quando Fe ₃ O ₄ foi modificado por KCTS (Fig. 1b), as partículas eram regulares esféricas ou ovais, e as partículas estavam uniformemente dispersas. Conforme mostrado na Fig. 1c, Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo foram modificadas com o anticorpo carregado negativamente na superfície de Fe ₃ O ₄ @KCTS que conferiu cargas negativas, aumentando assim a repulsão eletrostática entre as nanopartículas. Fe ₃ O ₄ As nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo @ KCTS-LECs eram esféricas, uniformes, livres de agregação de partículas e não estavam danificadas. O diâmetro médio foi 91,28 ± 2,31 nm e o PDI foi 0,207 ± 0,015 (Fig. 1d). A figura mostra que a distribuição de tamanho das nanopartículas era estreita e apresentava boa dispersão em água. A superfície carregada negativamente apresentou potencial zeta de - 32,8 ± 1,51 mV, com valor absoluto superior a - 30, indicando que o material apresentava boa estabilidade (Fig. 1e).

Caracterização de nanossonda magnética. a Imagem de micrografia eletrônica de transmissão de Fe ₃ O ₄ nanossonda (barra de escala, 100 nm). b Imagem de micrografia eletrônica de transmissão de Fe ₃ O ₄ Nanossonda @KCTS (barra de escala, 100 nm). c Imagem de micrografia eletrônica de transmissão de Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanossonda magnética de anticorpo duplo (barra de escala, 100 nm). d O tamanho de partícula foi detectado por análise de tamanho e o tamanho médio da sonda foi de 91,28 nm. e O potencial Zeta era de cerca de - 32,8 mv. f The Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanossonda de anticorpo duplo tem picos de emissão sob luz de excitação de 488 e 545

Os resultados do espectrômetro de fluorescência são mostrados na Fig. 1f. Um pico de emissão distinto foi observado no anticorpo anti-podoplanina (FITC) sob uma luz de excitação 488 e no anticorpo anti-LYVE-1 (APC) sob uma luz de excitação 545. A presença de picos de emissão no Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-complexo anticorpo duplo sob excitação 488 e 545 indica que os materiais foram acoplados com sucesso.

Imunohistoquímica e Imunofluorescência

Como mostrado na Fig. 2a, b, foi observada a expressão de LYVE-1 em tecidos de câncer de cólon e LYVE-1 e anticorpo de podoplanina em tecidos tumorais congelados. Isso demonstrou que uma pequena quantidade de células endoteliais linfáticas estava presente em tecidos de câncer de cólon.

Expressão de vasos linfáticos em tecidos de câncer colorretal. a Os vasos dilatados nas seções de tecido foram positivos para LYVE-1 na membrana da célula endotelial por imunohistoquímica (barra de escala, 100 μm). À direita está uma imagem ampliada. b Os vasos dilatados nas seções de tecido foram positivos para LYVE-1 e podoplanina na membrana da célula endotelial, conforme revelado por imunofluorescência (barra de escala, 50 μm)

Isolamento e enriquecimento de LECs

A coloração por imunofluorescência foi realizada nas células obtidas por dois métodos de classificação diferentes. Verificou-se que as células classificadas por esferas magnéticas LYVE-1 MicroBeads expressaram a proteína LYVE-1, mas não a podoplanina, enquanto as células obtidas por Fe ₃ O ₄ As nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo KCTS-LECs expressaram a proteína LYVE-1 e a proteína podoplanina (Fig. 3a). Além disso, os resultados da citometria de fluxo das células classificadas por diferentes métodos foram analisados. Conforme mostrado na Fig. 3b, a taxa de co-expressão da proteína LYVE-1 e da proteína podoplanina por esferas magnéticas LYVE-1 MicroBeads foi de 71,2%, enquanto a taxa de co-expressão dos dois marcadores obtidos por classificação com Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo foi de 88,9%. Duas amostras independentes t testes mostraram que havia diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos ( P <0,05) (Fig. 3c).

Análise da pureza das células endoteliais linfáticas. a Micrografias de fluorescência de imagem de duas cores de LYVE-1 (vermelho) e podoplanina (verde) / núcleos [4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) no câncer colorretal humano isolado LECs classificados usando LYVE-1 Microbeads e Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-anticorpo duplo (barra de escala, 100 μm). b A co-expressão de LYVE-1 (APC) e podoplanina (FITC) conforme revelada pela detecção por citometria de fluxo. c Resultados da citometria de fluxo, * P <0,05

Comparação de funções biológicas de LECs obtidas pelos dois métodos de classificação diferentes

Além disso, comparamos as características biológicas das células endoteliais linfáticas obtidas por dois métodos de classificação diferentes. Os resultados do teste do tubo de cola Matrigel são mostrados na Fig. 4a. As células obtidas por classificação com Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo tinham uma capacidade de formação de tubos mais forte. O resultado do ensaio de captação de células endoteliais Dil-ac-LDL mostrado na Fig. 4b revela que uma fluorescência vermelha foi observada nas células classificadas por esferas magnéticas LYVE-1 MicroBeads, mas uma fluorescência vermelha mais forte foi observada nas células classificadas por Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo. Esses resultados indicam que as células obtidas pelo Fe ₃ O ₄ As nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo @ KCTS-LECs tinham maior pureza, melhor capacidade de formação de tubos e fagocitose de células endoteliais, indicando que são mais adequadas para pesquisa em células endoteliais linfáticas em tumores.

Comparação de funções biológicas de LECs. a Determinação da capacidade de formação de tubo LECs in vitro por Calcein AM (verde) in vitro (barra de escala, 50 μm). b Ensaio de fagocitose de células endoteliais (marcado com DiI, vermelho; DAPI, azul) da função das células endoteliais usando LECs isolados por micropérolas LYVE-1 e Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-anticorpo duplo (barra de escala, 100 μm)

Análise de imagem bimodal in vivo

Os resultados da imagem in vivo são mostrados na Fig. 5a. Foi descoberto que não havia fluorescência do tumor antes da injeção de Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo. Após a injeção, a fluorescência do tumor aumentou, atingindo o pico em 12 h. Depois disso, a fluorescência diminuiu gradualmente com o tempo. No grupo de controle fechado, quase não houve fluorescência do tumor ao longo do experimento. Após 24 h, observou-se que o material havia sido completamente metabolizado do corpo dos camundongos de ambos os grupos. Da mesma forma, a ressonância magnética mostrada na Fig. 5b revelou que a imagem do tumor enfraqueceu gradualmente, atingindo seu nível mais fraco após 12 h, seguido por recuperação gradual com o tempo. No entanto, o poder de imagem do tumor no grupo de controle fechado foi quase inalterado. Pode-se inferir que o Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo tinham altas propriedades de direcionamento de tumor in vivo.

Imagem de fluorescência e ressonância magnética de modelos de tumor de xenoenxerto subcutâneo de câncer colorretal de camundongos NOD / SCID. a Camundongos NOD / SCID foram anestesiados e fotografados com sistema de imagem de fluorescência na pré-injeção e pós-injeção 0,5 h, 12 h e 24 h. b Camundongos NOD / SCID foram anestesiados e fotografados com scanner de ressonância magnética 3.0T na pré e pós-injeção 0,5 h, 12 h e 24 h

Toxicidade in vitro e in vivo de nanopartículas magnéticas

A citotoxicidade in vitro das nanossondas magnéticas foi avaliada nos LECs que foram classificados por Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo. Os resultados do ensaio CCK-8 mostraram que a viabilidade da célula era alta após a incubação com várias concentrações de nanossonda magnética (Fig. 6a). Isso sugere que Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticorpo duplo têm citotoxicidade mínima. Avaliamos ainda a toxicidade das nanopartículas magnéticas in vivo. Camundongos NOD / SCID fêmeas foram tratados com nanossonda magnética e, em seguida, seções de tecido dos órgãos principais após a coloração com hematoxilina-eosina foram examinadas. Conforme mostrado na Fig. 6b, não foram observados sinais óbvios de necrose ou inflamação. Esses resultados sugeriram que a nanossonda magnética não produziu efeitos tóxicos in vivo. Essas descobertas indicam que a nanossonda magnética projetada neste estudo é adequada para aplicação como uma sonda de detecção em investigações em animais e humanos.

Toxicidade de Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanossonda magnética de anticorpo duplo. a LECs foram incubados com várias concentrações de nanossonda magnética, e a viabilidade celular foi medida em 24 he 48 h. b Camundongos NOD / SCID foram tratados com PBS ou nanossonda magnética, e as seções dos órgãos principais foram coradas com hematoxilina-eosina e examinadas por microscopia de luz (barra de escala, 100 μm)

Discussão

It has long been know that transportation through the lymphatic system is an important pathway for tumor cell proliferation. However, compared with vascular endothelial cells (BECs) in blood vessels, LECs, as major components of lymphatic vessels, have not been fully studied. Identification of LECs markers will promote investigations on LECs and make it easier to distinguish them from BECs. LYVE-1 is a type I intact transmembrane glycoprotein receptor composed of 322 amino acid residues [20, 21], and it is presently considered to be the most specific lymphatic endothelial cells marker [22, 23]. Podoplanin is a type I transmembrane salivary mucin-like glycoprotein with a molecular weight of 38 kDa. Current research shows that podoplanin can distinguish lymphatic vessels and blood vessels very well [24, 25]. Therefore, it can be combined with other lymphatic markers to identify LECs. In this study, two antibodies were used to sort LECs, and the purity of the sorted cells was verified by immunofluorescence co-localization, flow double staining, and co-expression. The cells sorted by Fe₃ O ₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles displayed similar biological characteristics with LECs, and had stronger tube-forming ability and better phagocytic ability.

Recently, immunomagnetic-based purification methods have been used to separate different cells from mixed cultures, while magnetic beads coated with LYVE-1 or podoplanin antibodies have been used to separate specific subpopulations from crude cells populations [10, 26]. These methods only purify the target subgroups from mixed cultures. It is likely that this not only leads to incomplete isolation of LECs, but also causes contamination of heterogeneous cells such as vascular endothelial cells. Furthermore, these methods are time-consuming and are costly. Previously, several specific lymphoid markers were reported, e.g., LECs were isolated from different tissues primarily by the means of collagenase treatment. However, during primary culture, collagenase treatment may produce a mixture of cells, including vascular endothelial cells and interstitial cells.

In this study, the Fe₃ O ₄ @KCTS-LECs-diabody magnetic nano-double targeting probe was constructed using chitosan-coated ferroferric oxide which binds to highly specific target molecules LYVE-1 and podoplanin expressed on lymphatic endothelial cells. The electron microscope analysis showed that the probe had uniform appearance and good dispersibility. Zeta potential reflects the stability of a molecular probe. Highly positive or negative zeta potential values reflect high stability and low capacity to aggregate. It is generally believed that molecules with zeta potential greater than + 30 mV or less than − 30 mV have good stability. In this experiment, the probe had a zeta potential of − 32.8 ± 1.51 mV, which indicates that the probe had good stability.

Fe ₃ O ₄ is a magnetic nanoparticle oxide which has been widely used in modern medicine and biology because of its unique physical properties. It is particularly used in diagnosis systems based on magnetic resonance imaging and magnetic hyperthermia as well as in cell separation applications. The contrast agents used in MR imaging can be divided into paramagnetic iron oxide nanoparticles (T2-negative contrast agent) and Gd compounds (T1-positive contrast agent). Fe ₃ O ₄ nanoparticle resonance contrast agent is considered to be a R2-weighted, and its performance is often affected by some factors, such as (a) composition, (b) NP size, (c) surface coating, and (d) synergistic magnetic effect produced by multiple superparamagnetic Fe₃ O ₄ NP centers in a small volume [27]. In addition, it can be used in sorting of target cells under the magnetic field effect, that is, after the target cells are combined with specific probes, the target cells are sorted by magnet adsorption. For example, the lymphatic endothelial cells sorted using the probe designed in this study had better tube forming ability and endothelial cell phagocytosis. The relaxation parameter R1 or R2 is typically used to measure the quality of the MRI contrast agent, which describes the ability of the contrast agent T1 or T2 relaxation time [28]. The current NP-based T1 contrast agents are associated with cell toxicity, generating the need for better alternatives. Fe ₃ O ₄ provides good biocompatibility compared to the above-described cerium-based materials [29]. In this study, we studied the in vitro and in vivo toxicity of the nano-probes modified by chitosan on the surface of Fe₃ O ₄ . Our results showed that the probe was suitable for sorting of specific cells, and had low toxicity. It is therefore an ideal material that can be used for culturing of the sorted cells and further research on tumor metastasis through lymphatic vessels.

Here, specific target molecules such as peptides, antibodies, aptamers, etc. were attached to the surface of magnetic nanomaterials, thereby facilitating tumor diagnosis and treatment [30, 31]. This study successfully constructed the Fe₃ O ₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nano-double targeting probe. This probe could bind to specific target molecules, and hence can be used to separate lymphatic endothelial cells and MR/fluorescence imaging.

Conclusões

In summary, a dual targeting magnetic nanoparticle that can detect human cancer is presented in this study. The magnetic nanoparticle probe displays high biosafety and stability. The probe could bind to specific target molecules, thereby enabling sorting of lymphatic endothelial cells. The double antibody coating customized by incorporating self-made magnetic beads produced enabled separation of pure LECs, which reduced sorting time, improved cell activity, and reduced cost. These findings indicate that the magnetic nanoprobe designed in this study is suitable for application as a detection probe in animal and human investigations. This study provides a platform for studying the mechanisms of lymphatic metastasis and role of lymphatic endothelial cells in tumors. Moreover, the Fe₃ O ₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles can be applied in fluorescence/MR molecular imaging in vivo, enabling clinical diagnosis of cancer.