Gelatina Sensível a Redox / Nanogéis de Aptâmero de Sílica para Entrega Direcionada de siRNA

Resumo

Interferência de RNA (RNAi) tem vantagens potenciais sobre outras abordagens de terapia gênica devido à sua alta especificidade e capacidade de inibir a expressão do gene alvo. No entanto, a estabilidade e a entrega específica de tecido de siRNA permanecem como os maiores obstáculos para a terapêutica de RNAi. Aqui, desenvolvemos tal sistema conjugando nanogéis à base de gelatina com o aptâmero AS1411 direcionado a nucleolina e siRNA substituído por desoxinucleotídeo juntos (Apt-GS / siRNA) por meio de um ligante dissulfeto para obter docking transiente de siRNA. Estes nanogéis Apt-GS / siRNA demonstraram liberação favorável de siRNA sob condições de redução devido à clivagem por dissulfeto. Além disso, este sistema inteligente poderia liberar eletivamente siRNA no citosol em células positivas para nucleolina (A549) por uma desmontagem desencadeada pela glutationa e, subsequentemente, RNAi eficiente para a luciferase. Além disso, os nanogéis Apt-GS equipados com dissulfeto mostraram boa biocompatibilidade in vitro. Tomados em conjunto, estes nanogéis inteligentes redox-responsivos e direcionados a tumores exibem um grande potencial na exploração de entrega de siRNA funcionalizada e terapia tumoral.

Introdução

A interferência de RNA (RNAi) é um silenciamento específico de sequência de genes e também está sendo avaliada como o método mais promissor no tratamento de uma ampla gama de doenças, incluindo distúrbios genéticos, cânceres e doenças infecciosas, devido à sua alta especificidade e baixa toxicidade [1] Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) com moléculas de RNA de fita dupla são mais resistentes à degradação da nuclease do que os oligonucleotídeos antisense e, portanto, apresentam vantagens sobre a terapia antisense. A incorporação de nucleotídeos quimicamente modificados em siRNAs foi usada para aumentar ou diminuir a eficácia e a duração do RNAi. A substituição dos ribonucleotídeos da fita sense por desoxinucleotídeos pode aumentar a estabilidade da fita sense e manter ∼ 40% da eficácia do RNAi [2, 3]. No entanto, a entrega específica de tecido de siRNA continua a ser um grande obstáculo para suas aplicações, apesar das grandes potências de knockdown de genes observadas nos estudos in vitro [4, 5].

A entrega baseada em nanopartículas tem vantagens potenciais na estabilização de siRNA eficaz e modificação adicional para entrega específica ao local [6,7,8]. A entrega dirigida ao local produtiva de siRNA pode melhorar a transfecção e reduzir os efeitos fora do alvo, que são necessários para a maioria das aplicações práticas [9]. A nucleolina está associada a diversos processos biológicos e expressamente expressa no núcleo e no citoplasma de várias células normais. Além disso, a nucleolina é altamente expressa nas membranas plasmáticas de células cancerosas em proliferação ativa em relação às suas contrapartes normais e, portanto, é usada como um alvo atraente para tratamentos antineoplásicos. O aptâmero AS1411 (também conhecido como AGRO100), um aptâmero de DNA do quarteto G, pode se ligar fortemente à nucleolina da superfície celular e bloquear a via antiapoptótica em células cancerosas combinando-se com o modulador essencial de fator nuclear kB, que alcançou ensaios clínicos de fase II como o primeira droga de aptâmero de ácido nucleico para o tratamento de câncer em humanos [10, 11]. Até agora, AS1411 foi conjugado com sucesso a várias nanopartículas e internalizou-as em células cancerosas [12,13,14,15]. A gelatina tem sido empregada para encapsulamento de siRNA devido a sua excelente biocompatibilidade, biodegradabilidade e propriedades de gelificação [16,17,18]. Nosso grupo explorou uma série de nanogéis de gelatina reticulada com siloxano (GS NGs) com tamanho e carga de superfície controlados, demonstrando a eficiência de transfecção de GS NGs in vitro e in vivo [19, 20].

Além das barreiras intracelulares, as barreiras intracelulares após a internalização, incluindo a desmontagem eficiente de siRNA e o escape endossomal, permanecem igualmente desafiadoras. A conjugação de siRNA a um carreador por meio de ligações lábeis ou não-lábeis é um método promissor para superar esse desafio de entrega. A liberação responsiva a estímulos sob pH ácido e potencial redox tem recebido grande interesse. A ligação cruzada de dissulfeto exibe grande potencial em uma explosão de liberação de drogas através de ligações clivadas em células tumorais devido ao nível mais alto de glutationa (GSH) no ambiente extracelular [21, 22]. Foi relatado que os conjugados poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) / siRNA formados por meio de uma ligação dissulfeto exibem um encapsulamento aprimorado e eficiência de entrega [23].

Neste trabalho, nanogéis híbridos baseados em GS com funções duplas de responsividade redox de conjugação de dissulfeto e direcionamento de tumor específico do aptâmero AS1411 foram explorados como um transportador de siRNA para terapia de câncer (Esquema 1). Nosso objetivo é investigar se AS1411 GS NGs funcionais melhoraria a internalização celular eficaz e atingiria o silenciamento do gene específico do tumor do gene modelo da luciferase in vitro. Além disso, a segurança deste sistema também foi avaliada in vitro.

Um Apt-GS NGs responsivo a redox e direcionado a tumor foi desenvolvido para entrega de siRNA com conjugação de dissulfeto e aptâmero AS1411

Métodos

Materiais

Gelatina (número de flor:240-270, pH 4,5-5,5) foi adquirida da BBI Company Inc. (EUA). N -succinimidil 3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), 3-glicidoxipropil-trimetoxisilano (GPSM) e 3-aminopropil-trimetoxisilano (APTMS) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (EUA). O brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazolil-2) -2, 5-difeniltetrazólio (MTT) foi adquirido a Amresco Co. (EUA). Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino, penicilina e estreptomicina foram obtidos da Hyclone Co. (EUA). Aptâmero AS1411, AS1411 marcado com 5'-FAM e DNA de controle negativo (TDO) foram sintetizados por Sangon Biotech Co. (China). Fita com sentido de tiol do Luc-siRNA, 5′-SH- (CH ₂ ) ₆ -CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3 ′ (substituto de desoxinucleotídeos para ribonucleotídeos) e fita anti-sentido, 3′-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5 ′, e fita anti-sentido marcada com FAM na extremidade 3 'foram sintetizados e purificados com HPLC por Gene Pharma Co. ( China). Lipofectamine 2000, plasmídeo de luciferase pGL3 e sistema de ensaio de luciferase foram adquiridos da Promega Co. (EUA). As células A549 de adenocarcinoma de pulmão humano maligno e fibroblastos NIH 3T3 normais foram usados e fornecidos pelo Centro de Engenharia Biomédica da Universidade de Xiamen (China). Todos os materiais usados eram de qualidade analítica e sem purificação adicional. A vidraria foi cuidadosamente limpa e enxaguada com água desionizada.

As sequências de DNA são as seguintes:

Aptâmero AS1411:5′-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTTT-3 ′, Controle TDO:5′-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTTT-3 ′

Preparação e caracterização de complexos Apt-GS / siRNA

Os nanogéis de gelatina / sílica amino-funcionalizados (GS NGs) foram primeiro preparados por um procedimento sol-gel, conforme descrito anteriormente [19]. Normalmente, 0,2 g de GPSM foram adicionados a 20 mL de solução de gelatina a 0,75% em solução de HCl (pH =3) a 60 ° C sob 30 min de agitação e, subsequentemente, adição de 0,08 g de APTMS e incubação por mais 24 h. Os GS NGs obtidos foram purificados por centrifugação (14.000 rpm, 25 ° C, 12 min) por três vezes. Em segundo lugar, GS NGs (0,5 mL, 5 g / L em PBS) foram tratados com 25 uL de SPDP (20 mM em DMSO) durante 60 min à temperatura ambiente, seguido pela adição de AS1411 tiolado (1 mg / mL) e agitação durante 12 h. Os nanogéis Apt-GS foram obtidos por centrifugação (14.000 rpm, 25 ° C, 12 min) e purificados com água desionizada três vezes. Em terceiro lugar, a suspensão de Apt-GS NG ativada por SPDP obtida (80 mL, 5 mg / mL) foi diretamente misturada com a cadeia de sentido de siRNA durante a noite a 4 ° C. Após purificação por centrifugação, a cadeia anti-sentido de siRNA foi adicionada e incubada por 5 min a 94 ° C, em seguida, hibridizada por 20 min a 47 ° C para formar complexos Apt-GS / siRNA.

As morfologias de superfície dos complexos AS1411-GS e AS1411-GS / siRNA foram examinadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (Hitachi S-4300, Japão). O tamanho de partícula e os potenciais zeta de cada amostra foram medidos por um detector de espalhamento de luz dinâmico Nano-ZS Zetasizer (Malvern Instruments, UK). Os diâmetros efetivos das partículas foram calculados a partir da função de autocorrelação usando o software Malvern Zetasizer assumindo uma distribuição log-normal. As conjugações de GS e AS1411 ou siRNA foram determinadas por coleta e medição da concentração de DNA marcado com FAM não ligado usando microscopia de fluorescência F-7000 (Olympus-IX73, Japão). Grupo amino total (-NH ₂ ) os níveis na superfície de nanogéis de GS foram determinados quantitativamente usando a reação colorimétrica de ninidrina. A quantidade era de cerca de 0,642 mmol / g.

Análise de eletroforese em gel

A eletroforese em gel foi conduzida a 100 V por 20-30 min usando gel de agarose a 2% (p / v) em tampão TBE. As imagens foram observadas por irradiação com um sistema de documentação em gel (Tanon GIS-2008, China). No ensaio de encapsulação Apt-GS / siRNA, os complexos siRNA, GS / siRNA e Apt-GS / siRNA foram carregados no gel sem quaisquer aditivos. Em ensaios responsivos a redox, o complexo GS / siRNA e Apt-GS / siRNA foram incubados com solução GSH 10 mM em PBS por 2 h antes da medição.

Citotoxicidade In Vitro

A citotoxicidade contra células A549 de adenocarcinoma de pulmão humano foi avaliada pelo ensaio MTT. Resumidamente, células A549 (1 × 10 ⁴ células / poço) foram semeados em placas de cultura de poliestireno de 96 poços e incubados por 24 h até a confluência de 70%. Após a remoção do meio de cultura, 100 μL de meio DMEM sem soro contendo nanogéis (100–600 mg / mL) foram adicionados a cada poço. As células tratadas com meio serviram apenas como grupo de controle negativo. Após 24 h de co-incubação, 100 μL de meio fresco com 20 μL de solução de MTT (5 mg / mL em tampão PBS) foram adicionados e cultivados por mais 4 h. Em seguida, a solução de MTT foi removida e 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados. Após oscilação de 30 min no escuro, a absorbância de cada poço foi medida por um leitor de microplacas (TECAN DNA export, Swiss) no comprimento de onda de 490 nm. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. A viabilidade celular relativa (%) foi expressa como uma porcentagem em relação às células de controle não tratadas.

Internalização de células

As células são co-cultivadas com 25 μL de nanogéis Apt-GS e TDO-GS marcados com FAM (2 mg / mL) por 10 h em meio sem soro a 37 ° C. Após lavagem três vezes com PBS, as células foram fixadas com paraformaldeído (4% em PBS) por 30 min e então observadas em microscópio confocal de varredura a laser (Leica, Alemanha). Para quantificar a captação celular, as células foram tratadas com 25 μL de AS1411-GS marcado com FAM e TDO-GS (2 mg / mL) por um período (0,5–16 h) em meio sem soro a 37 ° C. Para avaliar o papel da nucleolina na captação celular de Apt-GS NGs, a mistura dos Apt-GS NGs preparados e aptâmeros AS1411 livres de concentrações variadas (0,5, 5 e 50 μM) foi incubada com as células A549 por 8 h. Em seguida, as células foram ressuspensas em PBS gelado e as células fluorescentes com nanogéis marcados com FAM foram contadas a partir de 10.000 células usando um citômetro de fluxo EPICS XL (Beckman Coulter, EUA). A análise de dados foi realizada com software de citômetro de fluxo EPICS XL, e portas analíticas foram escolhidas como 1% das células de controle caindo dentro da região positiva.

Silenciamento de genes

A capacidade de silenciar genes foi examinada usando a combinação de siRNA para luciferase e as células que expressam luciferase. Resumidamente, A549 expressando luciferase (2 × 10 ⁵ células / poço) e fibroblastos NIH 3 T3 (4 × 10 ⁵ células / poço) foram semeadas em placas de 12 poços e cultivadas durante a noite e, em seguida, tratadas com 100 μL de complexos de teste (80 μg / mL) contendo LUC-siRNA (ou siRNA de controle) por 8 h. As amostras foram divididas em três grupos:(a) apenas complexos Apt-GS / siRNA por 8 h, (b) complexos Apt-GS / siRNA por 8 h seguidos por lipossomas por mais 1 h (denominado como A-GS / si → Grupo Lip), e (c) co-incubação de complexos Apt-GS / siRNA e lipossoma por 8 h (A-GS / si + grupo Lip). As células sem qualquer tratamento e as transfectadas com o plasmídeo luciferase pGL3 (Madison, WI, EUA) serviram de controlo. Após mais 40 h de incubação, a eficiência do gene knockdown foi investigada quantificando a expressão da luciferase em células usando um sistema de ensaio de luciferase de acordo com o protocolo do fabricante. As experiências foram realizadas em triplicado e os dados são apresentados como médias ± erros padrão das médias.

Resultados e discussões

Síntese e caracterização de complexos GS-AS1411 / siRNA

Para construir o transportador de siRNA direcionado ao câncer, o nanogel de gelatina / sílica-AS1411 (Apt-GS) foi projetado (Esquema 1) usando um método sol-gel [19, 20]. Imagem típica de TEM (Fig. 1) revelou que GS em branco e Apt-GS eram estruturas esféricas dispersas com diâmetros médios de 170–200 nm. O DNA marcado com FAM foi usado para a síntese para confirmar o acoplamento de AS1411 e siRNA em GS NGs. A quantidade de aptâmero conjugado em GS foi de aproximadamente 0,65 μmol / g, conforme quantificado usando espectros de fluorescência. Enquanto isso, fluorescência verde intensa pode ser facilmente observada nas imagens de fluorescência, sugerindo a integração do aptâmero AS1411 e siRNA. Conforme representado na Fig. 2, o tamanho hidrodinâmico de GS nua, Apt-GS e Apt-GS / siRNA NGs (162,3 nm, 216,5 nm e 234,9 nm, respectivamente) aumentou gradualmente junto com o procedimento de funcionalização devido a um aumento no camada funcional de superfície. Por outro lado, o potencial zeta de Apt-GS foi menos positivo (33,9 ± 0,5 mV) do que o de GS NGs (40,1 ± 0,5 mV) devido ao efeito de mascaramento de aptâmeros de DNA negativos na superfície. Após uma nova conjugação com siRNA na superfície, o potencial zeta de Apt-GS / siRNA NGs ainda muda negativamente para 24,9 mV devido ao excesso de grupos de fosfato negativos livres de siRNA. Este resultado sugeriu uma toxicidade biológica reduzida porque as fortes cargas positivas poderiam interferir com proteínas carregadas negativamente no sangue e romper a membrana celular [24].

Imagens de Apt-GS ( a , c ) e nanogéis Apt-GS / siRNA ( b , d ) a , b Imagens TEM. As barras de escala representam 0,5 μm. c , d Imagens fluorescentes. Barras de escala representam 5 μm

Tamanho hidrodinâmico e potenciais zeta de nanogéis GS, Apt-GS e Apt-GS / siRNA

Carregamento e liberação de siRNA

Um RNAi com sucesso só pode ocorrer quando o siRNA é entregue e liberado rapidamente de seu portador no citoplasma [25]. As células tumorais têm concentração de GSH 7–10 vezes maior do que nas células normais [26, 27]. Neste estudo, o siRNA foi conjugado a Apt-GS NGs ativos por meio da reação de reticulação de dissulfeto. A eletroforese em gel (GE) foi realizada para avaliar a capacidade de carregamento e liberação de siRNA dos complexos Apt-GS / siRNA. Como esperado, enquanto o pDNA livre (Fig. 3, pistas 1-5) mudou para sua posição usual, os complexos Apt-GS / siRNA exibiram a mobilidade diminuída em um ensaio de mudança de eletromobilidade (Fig. 3, pistas 10-11) demonstrando o bom carregamento de siRNA. Para simular a condição intracelular, 10 mM de GSH foi tratado com complexos por 2 h para reduzir os NGs de Apt-GS / siRNA. Conforme mostrado na Fig. 3, faixa 6–7, moléculas de siRNA foram observadas no gel de poliacrilamida após o tratamento de GSH, indicando que Apt-GS / siRNA NGs poderia liberar reversivelmente moléculas de siRNA funcionais por clivagem de dissulfeto na presença de glutationa. Além disso, a quantidade de siRNA nas nanopartículas foi analisada comparando a quantidade total de siRNA e o siRNA de controle em eletroforese em gel de poliacrilamida a 2%. O Apt-GS encapsulou moléculas de siRNA em uma proporção de 3:1∼2:1 pmol por micrograma. É também notado que a mistura de siRNA e Apt-GS apresentou retenção mais fraca devido ao aprisionamento físico de siRNA negativo (Fig. 3, faixa 8).

Análise de AGE de ligação reversível de siRNA a nanogéis Apt-GS. Pistas 1-5:siRNA livre com quantidade de 50, 40, 30, 20 e 10 pmol. Pistas 6 e 7:GS / siRNA e Apt-GS / siRNA com GSH 10 mM em 2 h. Pista 8:a mistura de siRNA livre e NGs Apt-GS. Pistas 10 e 11:complexos GS / siRNA e Apt-GS / siRNA sem GSH 10 mM como controles

Citotoxicidade e segmentação de nucleolina

A avaliação da citotoxicidade in vitro foi investigada pelo ensaio MTT em células A549. O ensaio MTT é usado para avaliar a citotoxicidade dos nanogéis preparados. O siRNA de luciferase não tóxico foi selecionado como repórter, o qual não tem efeito de morte nas células tumorais [28, 29]. Portanto, a viabilidade celular representou a biocompatibilidade do transportador. Como mostrado na Fig. 4, a proliferação celular não foi notavelmente afetada por GS, Apt-Apt e Apt-Apt / siRNA nas concentrações de grupos de 100-600 μg / mL (viabilidade celular> 80%) e a citotoxicidade apareceu em dose -dependente. Em comparação com GS NGs nus, os nanogéis modificados com AS1411 tiveram uma ligeira diminuição na viabilidade celular devido à inibição da sinalização de NF-κB [27, 30] e destruição das membranas de organela [16]. A biocompatibilidade benigna dos nanogéis Apt-GS os torna adequados como transportadores de siRNA in vivo.

Viabilidade celular de células A549 com nanogéis GS, Apt-GS e Apt-GS / siRNA de várias concentrações determinadas pelo ensaio MTT

Para avaliar o direcionamento de Apt-GS em células tumorais in vitro, incubamos células A549 e fibroblastos 3T3 com as mesmas quantidades de Apt-GS marcado com FAM ou TDO-GS de controle (GS decorado com um oligonucleotídeo de controle). Níveis baixos de fluorescência podem ser observados em células 3T3 ou quando as células foram tratadas com controle TDO-GS (Fig. 5b, c). Em contraste, a fluorescência verde emitida pelo aptâmero AS1411 foi acentuadamente aumentada em células cancerosas A549 (Fig. 5a), sugerindo que Apt-GS foi especificamente acumulado em células tumorais devido à introdução dos aptâmeros AS1411 direcionados a nucleolina. Na análise quantitativa por citometria de fluxo (Fig. 6), Apt-GS NGs exibiram intensidades de fluorescência dependentes do tempo em ambos os tipos de células. De 0,5 a 16 h, a intensidade de fluorescência de internalização de Apt-GS em células A549 e células 3T3 melhorou 13 e 2 vezes, respectivamente. Quanto à proporção de células contendo NGs, ela aumentou rapidamente nos primeiros 30 min e aparentemente máxima de possível saturação às 8 h em A549,96% das células A549 foram anexadas ou retiradas dos nanogéis em 16 h, enquanto apenas 52% das células 3T3 foi observado. A fim de avaliar o papel da nucleolina na absorção celular de nanogéis, a mistura dos aptâmeros Apt-GS NGs preparados e aptâmeros AS1411 livres de concentrações variadas (0,5, 5 e 50 μM) foi incubada com células A549 por 8 h. A intensidade de fluorescência e as porcentagens de células contendo nanogéis diminuíram em 50% e 30%, respectivamente, ao usar o aptâmero AS1411 livre para competir com o Apt-GS NGs para a nucleolina expressa na membrana celular, sugerindo endocitose mediada por receptor induzida por nucleolina ( Fig. 6c). Estes dados demonstraram que Apt-GS NGs exibiu um maior acúmulo em células cancerosas A549 via internalização mediada por nucleolina.

a - c Captação celular de FAM-siRNA entregue por nanogéis Apt-GS e TDO-GS. As imagens foram tiradas com CLSM. Sinal verde:FAM. A barra de escala é de 10 μm

Análise de citometria de fluxo (FCMS) de captação celular de nanogéis Apt-GS e TDO-GS marcados com FAM em diferentes tipos de células. Inserir:perfis FACS, a , b as curvas vermelhas, verdes, azuis, roxas, aqua e amarelas apresentam o tempo de incubação de 0,5 a 16 h; c curva vermelha, verde, azul e roxo significam a concentração de AS1411 de 0 a 16 μM

Interferência de RNA

É relatado que a incorporação de desoxinucleotídeos em siRNA pode aumentar a estabilidade da fita sense e manter ∼ 40% da eficácia do RNAi [2, 3]. Para avaliar a eficiência de knockdown de portadores de siRNA de teste, empregamos um sistema de gene repórter de luciferase substituído por ribonucleotídeo em ambas as células. A eficiência do gene knockdown (KD) do siRNA foi avaliada através da atividade da luciferase após 48 h. Como mostrado na Fig. 7a, o Apt-GS / siRNA melhora a eficiência de knockdown do gene 4,6 vezes das células A549 em comparação com 6% das células 3T3 normais, mostrando boa seletividade celular. Isso sugeriu que a modificação do aptâmero AS1411 aumentou a eficiência de transfecção, gerando um efeito de direcionamento. Foi comprovado que os lipossomas catiônicos auxiliam na entrega da carga e no escape dos lisossomas [31]. Além disso, a adição subsequente de lipossoma (A / si-GS → grupo Lip) não ajudou a melhorar a atividade de silenciamento de gene mediada por siRNA (30,4%), apesar da interrupção do endossoma, inferindo a liberação de siRNA em ambiente intracelular de glutationa (GSH) por clivagem de dissulfeto . Além disso, a co-transfecção de lipossomas e Apt-GS / siRNA (grupo A / si-GS + Lip) melhorou ligeiramente a eficiência de knockdown da expressão de luciferase (41,6%) em A549 embora o lipossoma auxilie no escape do lisossoma, em correspondência com relatórios anteriores [27 , 30]. No entanto, as células A549 tiveram atividades de silenciamento gênico 2,7 vezes e 1,4 vezes para o grupo A / si-GS → Lip e para A / si-GS + Lip, respectivamente, em comparação com as células 3T3, inferindo uma diminuição na seletividade celular.

Efeito de silenciamento in vitro de siRNA anti-luciferase formulado em nanogéis Apt-GS com diferentes tratamentos ( a ) e concentração de complexos Apt-GS / siRNA (A-GS / si) no silenciamento de genes ( b )

Em seguida, examinamos o efeito da concentração dos nanogéis no RNAi. Conforme mostrado na Fig. 7b, a eficiência de interferência do gene atingiu o máximo na concentração do complexo de 80 μg / ml. A diminuição da eficiência de KD a uma concentração de 120 μg / ml pode ser devido a um aumento da citotoxicidade do aptâmero. Também é observado que a adição de um lipossoma de agente de escape de endossomo pode aumentar a eficiência de interferência de RNA em baixas concentrações de nanogéis de Apt-GS / siRNA (40 μg / ml e 80 μg / ml), mas não levou a uma redução em altas concentrações (120 μg / ml). Assim, acredita-se que Apt-GS pode entregar com sucesso siRNA às células tumorais e, subsequentemente, resultar em RNAi específico.

Conclusões

A estabilidade e a entrega específica de tecido de siRNA permanecem como os maiores obstáculos para a terapêutica de RNAi. Aqui, o siRNA substituído por desoxinucleotídeo é usado para melhorar a estabilidade do siRNA, e o núcleo GS foi ainda revestido com aptâmero AS1411 para direcionamento de tumor e ligante dissulfeto para entrega responsiva a redox de siRNA. O veículo tem uma estrutura esférica com um tamanho de cerca de 200 nm e possui cargas positivas na superfície. Estes nanogéis Apt-GS / siRNA preparados poderiam proteger a carga e exibiram liberação acelerada de siRNA sob DTT adicionado por clivagem de dissulfeto. Além disso, com o aptâmero de direcionamento AS1411, os novos nanogéis Apt-GS Apt-GS poderiam efetivamente entregar e liberar mais carga para o citoplasma, levando a uma melhoria significativa (~ 5 dobras in vitro na atividade de silêncio em células A549 com superexpressão de nucleolina). No geral, essas descobertas sugerem que a entrega de siRNA substituído por desoxinucleotídeo é uma estratégia inovadora e esses nanogéis inteligentes direcionados a tumores responsivos a redox são uma grande promessa para a entrega de siRNA e terapia de tumor.

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados que suportam as conclusões deste artigo estão incluídos no artigo.

Abreviações

APTMS:: 3-aminopropil-trimetoxissilano
DMEM:: Meio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO:: Dimetilsulfóxido
FAM:: Fluoresceína amidita
GE:: Eletroforese em gel
GPSM:: 3-Glicidoxipropil-trimetoxissilano
GS NGs:: Nanogéis de gelatina reticulados com siloxano
MTT:: Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazolil-2) -2,5-difeniltetrazólio
RNAi:: Interferência de RNA
siRNAs:: Pequenos RNAs interferentes
SPDP:: N -succinimidil 3- (2-piridilditio) -propionato
TDO:: Oligonucleotídeo de DNA negativo

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