Um novo método sem solvente orgânico para nanofármaco direcionado para eficácia anticâncer aprimorada

Resumo

Uma vez que o grupo hidrofóbico é sempre essencial para a síntese das nanopartículas carregadas de drogas, a maioria dos métodos depende fortemente de solvente orgânico, que pode não ser completamente removido e pode ser uma ameaça potencial para os pacientes. Neste estudo, nós completamente sintetizados 10-hidroxicamptotecina (HCPT) carregados com folato (FA) nanoneedles (HFNDs) para terapia de câncer altamente eficiente com alta carga de droga, propriedade de direcionamento e capacidade de imagem. Deve-se notar que nenhum solvente orgânico foi usado no processo de preparação. O estudo de captação celular in vitro e o estudo de distribuição in vivo mostraram que os HFNDs, com FA na superfície, revelaram uma propriedade de direcionamento óbvio e entraram nas células HeLa mais facilmente do que as nanagulhas quitosana-HCPT sem FA modificado (NDs). Os testes de citotoxicidade ilustraram que os HFNDs possuíam melhor capacidade de matar as células HeLa do que o fármaco individual ou os NDs na mesma dose, indicando seu bom efeito anticâncer. O experimento anticâncer in vivo revelou ainda mais os efeitos anticâncer pronunciados e os efeitos colaterais mais baixos dos HFNDs. Este novo método sem solvente orgânico levará a um sistema promissor de entrega sustentada de medicamentos para o diagnóstico e tratamento do câncer.

Histórico

Ao longo das últimas duas décadas, a concentração da pesquisa foi focada em melhorar as propriedades farmacocinéticas subótimas da quimioterapia para aumentar sua eficácia [1, 2]. Progresso significativo foi feito, e muitos sistemas de entrega de drogas multifuncionais baseados em nanopartículas foram preparados com sucesso, o que demonstra uma ampla gama de propriedades combinadas, como longa circulação [3, 4], direcionamento [5,6,7], imagem [8 , 9,10], sensibilidade ao pH [11,12] e liberação sustentada do fármaco [9,13].

Nos últimos anos, o formato da partícula não esférica tem atraído cada vez mais atenção por seu potencial efeito na liberação de drogas [14,15,16,17,18,19]. Já existem evidências de que a forma influencia muitas propriedades das partículas, como a biodistribuição e a degradação [20,21,22]. Acima de tudo, a internalização celular provou ser fortemente dependente da forma [23,24,25]. Porque as partículas devem ser capazes de entrar nas células cancerosas e agir em seus alvos terapêuticos para matá-las. E muitos estudos descobriram que as células cancerosas preferiam partículas com alta proporção de aspecto [10, 26].

No entanto, a maioria desses métodos depende fortemente de solventes orgânicos, principalmente devido ao grupo hidrofóbico necessário nos processos de preparação de nanopartículas [27]. Estes solventes orgânicos podem ser residuais dentro das partículas e não podem ser completamente removidos por práticas convencionais, tais como destilação a pressão reduzida ou liofilização. Como resultado, vestígios de solventes orgânicos permanecem no medicamento, os quais são chamados de solventes residuais. Embora os solventes residuais sejam muito poucos e possam atender às instruções especiais publicadas em farmacopeias que controlam estritamente as quantidades máximas permitidas de solventes residuais em produtos farmacêuticos, os solventes residuais se acumulam no corpo e podem acentuar a doença ou causar outros problemas graves questões. Assim, os fabricantes têm aspirado a minimizar a quantidade de solventes orgânicos usados no processo de produção dos medicamentos. Portanto, será um salto muito importante para a medicina, a saúde humana e o meio ambiente usar a química “verde” na indústria farmacêutica, embora enfrentando muitas dificuldades.

Neste estudo, desenvolvemos nanagulhas modificadas com folato (FA) carregadas com HCPT (HFNDs) com uma razão de aspecto elevada e pontas afiadas por meio de um método completamente verde sem o uso de qualquer solvente orgânico. A precipitação com pH controlado do HCPT e da quitosana modificada por FA (CS-FA) levou à nucleação de nanagulhas com HCPT nanocristalino como o núcleo envolvido com CS-FA como estabilizadores estéricos. Descobriu-se que os HFNDs possuem boas propriedades de segmentação e capacidade de imagem. Os estudos in vitro e in vivo foram então sistematicamente investigados. Esses resultados destacam o grande potencial das nanagulhas funcionais de imagem modificadas por FA para quimioterapia altamente eficiente, bem como para aplicações de diagnóstico de câncer.

Métodos

Materiais

Todos os produtos químicos são de qualidade analítica e usados como recebidos sem purificação adicional. Água desionizada (DI) foi usada em todos os experimentos. FA foi adquirido de Bio Basic Inc. 10-hidroxicamptotecina (HCPT; pureza> 99%) foi adquirido de Lishizhen Pharmaceutical Co., Ltd. Quitosano (Mw =70.000, 90% de grau de desacetilação) foi obtido de Zhejiang Aoxing. N -Hidroxissuccinimida (NHS) e cloridrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDC) foram adquiridos de Sigma-Aldrich.

Síntese do Conjugado FA-Quitosana

FA (10 mg), quitosana (20 mg), EDC (4 mg) e NHS (4 mg) foram adicionados a 2 mL de solução tampão PBS (pH 5,5) e agitados à temperatura ambiente por 12 h para obter a suspensão de CS-FA . Em seguida, a suspensão foi dialisada contra uma solução tampão (pH 10) para remover o excesso de moléculas de FA. A suspensão restante foi centrifugada (5000 rpm) e liofilizada por 24 h para obter o pó de CS-FA seco.

Preparação de HFNDs

HCPT (10 μg) foi dissolvido em 200 μL de solução aquosa de NaOH (0,1 M) para obter a solução A, e CS-FA (10 μg) foi dissolvido em 200 μL de HCl (0,1 M) para obter a solução B. Depois, a solução A e a solução B foram adicionadas gota a gota a água pura (1 mL) sob agitação vigorosa durante 30 s, e a mistura foi sonicada (200 W) num banho de gelo durante 6 min. A suspensão foi centrifugada (10.000 rpm, 5 min) e liofilizada por 24 h. Para a preparação dos NDs, a solução de quitosana foi usada para substituir a solução B.

Caracterização

A morfologia dos HFNDs foi examinada por SEM (UV-70) a 15 kV. O tamanho e os valores do potencial zeta foram determinados por uma máquina Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern). Três medições paralelas foram realizadas para determinar os valores médios. A cristalinidade de HFNDs foi analisada com XRD (X’pert PRO). O conteúdo de FA em HFNDs foi determinado por espectrofotometria de UV (Beckman DU800). Todas as amostras foram testadas a 281 nm. A curva padrão foi desenhada previamente para determinar a concentração de FA. O conteúdo de HCPT em HFNDs foi determinado por espectrofotometria de fluorescência a 383 nm. A curva padrão foi desenhada previamente para determinar a concentração de HCPT. O conteúdo e a eficiência de aprisionamento foram calculados pelas Eqs. (1, 2, 3 e 4):
$$ \ mathrm {Droga} \ \ mathrm {carregando} \ \ mathrm {conteúdo} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {HCPT} \ \ left (\% \ right) =\ left (\ mathrm {weight} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {HCPT} \ \ mathrm {in} \ \ mathrm {HFNDs} \ right) / \ left (\ mathrm {weight} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {HFNDs} \ right) \ times 100 \% $$ (1) $$ \ mathrm {Entrapment} \ \ mathrm {eficiência} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {HCPT} \ left (\% \ right) =\ left (\ mathrm { peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {droga} \ \ mathrm {in} \ \ mathrm {HFNDs} \ direita) / \ left (\ mathrm {peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {alimentação} \ \ mathrm {drug} \ right) \ times 100 \% $$ (2) $$ \ mathrm {Porcentagem} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {F} \ mathrm {A} \ \ mathrm {in} \ \ mathrm {the} \ \ mathrm {conjugação} \ \ left (\% \ right) =\ left (\ mathrm {weight} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {FA} \ \ mathrm {in} \ \ mathrm {conjugação} \ direita) / \ esquerda (\ mathrm {peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {conjugação} \ direita) \ vezes 100 \% $$ (3) $$ \ mathrm {Droga} \ \ mathrm {carregando} \ \ mathrm {conteúdo} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {F} \ mathrm {A} \ \ left (\% \ right) =\ left (\% \ right) =\ left (1- \ mathrm {Drug} \ \ mathrm { carregando} \ \ mathrm {conteúdo} \ \ mathrm { of} \ \ mathrm {HCPT} \ right) \ times \ mathrm {porcentagem} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {F} \ mathrm {A} \ \ mathrm {in} \ \ mathrm {the} \ \ mathrm {conjugação} \ times 100 \% $$ (4)

Estudo de liberação de drogas in vitro

O estudo de liberação de drogas in vitro de HFNDs foi realizado usando a técnica de diálise. Os HFNDs foram dispersos em uma solução tampão de PBS (10 mL) e colocados em um saco de diálise pré-dilatado (MWCO 3500 Da). A bolsa de diálise foi então imersa em PBS (0,1 M, 200 mL, pH 7,4) e oscilou continuamente em uma incubadora com agitação (100 rpm) a 37 ° C. Todas as amostras foram analisadas por espectrofotometria de fluorescência.

Imagem Confocal de Células

A imagem confocal de células foi realizada usando um microscópio confocal de varredura a laser Leica. A imagem do HCPT foi realizada sob a excitação do laser de 382 nm, e a emissão foi coletada na faixa de 500–550 nm. As células HeLa foram semeadas e pré-incubadas a 37 ° C por 24 h (5% CO ₂ ) antes de incubar com os HFNDs por 8 h.

Captação celular medida por medição de fluorescência

As células HeLa foram semeadas em uma placa de 24 poços (1 × 10 ⁶ mL / poço). A placa foi então incubada a 37 ° C por 24 h em uma atmosfera umidificada (5% CO ₂ ) As células foram então incubadas com NDs e HFNDs em concentrações equivalentes de HCPT. As células tratadas com o fármaco foram incubadas durante 6 h a 37 ° C, seguidas de serem lavadas duas vezes com PBS e digeridas por tratamento com tripsina (0,05%) / EDTA. As suspensões foram centrifugadas (1000 rpm, 4 ° C) durante 4 min. Os sedimentos celulares foram lavados com PBS para remover a fluorescência de fundo no meio. Após dois ciclos de lavagem e centrifugação, as células foram ressuspensas com 2 mL de PBS e interrompidas completamente por sonicação vigorosa. A quantidade de HCPT na mistura sonicada foi analisada por espectroscopia de fluorescência (excitação a 382 nm). As células em branco na ausência de droga foram medidas para determinar o nível de autofluorescência das células como controle.

Ensaios de citotoxicidade

A citotoxicidade de HFNDs foi determinada pelo ensaio MTT. Resumidamente, um número adequado de células HeLa de fase exponencial foram plaqueadas em quintuplicado em uma microplaca de fundo plano de 96 poços e incubadas por 24 h na presença de fármaco / partículas. Neste estudo, 20 μL de solução de brometo de 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazólio (MTT) (5 mg / mL em PBS) foram adicionados em cada poço, e as placas foram incubadas a 37 ° C por mais 4 h. Em seguida, um volume de 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado e a placa foi agitada em banho-maria a 37 ° C por 30 min. A absorvância a 570 nm foi medida usando um leitor de microplacas (modelo 680; Bio-Rad).

Biodistribuição

Para imagens de fluorescência in vivo, DiR foi encapsulado em NDs e HFNDs. DiR-NDs e DiR-HFNDs foram administrados por via intravenosa em camundongos nus portadores de tumor HeLa através das veias da cauda a uma dose equivalente de DiR-HCPT por quilograma de peso corporal do camundongo. Em intervalos de tempo predeterminados, os camundongos foram anestesiados e fotografados com o sistema de imagem Maestro in vivo (Cambridge Research &Instrumentation, Woburn, MA, EUA). Após 24 h, os camundongos foram sacrificados e o tumor, bem como os principais órgãos (baço, fígado, rim, pulmão e coração) foram excisados, seguido por lavagem da superfície com NaCl a 0,9% para a imagem ex vivo.

Inibição de tumor In Vivo

Quando o volume do tumor HeLa dos camundongos com tumor HeLa foi de aproximadamente 60 mm ³ , os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos e tratados por injeção intravenosa de NaCl a 0,9%, HCPT livre, NDs e HFNDs a cada 3 dias com uma dose de 80 μg de HCPT por camundongo. O volume do tumor e o peso corporal foram monitorados a cada 3 dias. O volume do tumor foi calculado pela seguinte fórmula:volume do tumor =0,5 × comprimento × largura ² .

Após 21 dias, os camundongos foram sacrificados, seguidos dos tumores excisados e pesados. Em seguida, os tumores foram fixados em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C, incluídos em parafina, seccionados (4 μm), corados com hematoxilina e eosina (H&E) e observados em sistema de microscopia digital.

Análise estatística

A significância estatística dos resultados do tratamento foi avaliada usando o t de Student teste (bicaudal); P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todas as análises (nível de confiança de 95%).

Resultados e discussão

Síntese do Conjugado FA-Quitosana

Primeiro, conjugamos o FA à quitosana por uma reação de amidação entre o grupo terminal carboxílico da FA e o amidogênio da quitosana (Fig. 1). A estrutura da conjugação (CS-FA) foi confirmada por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR). Como mostrado na Fig. 2, o pico em 1605 / cm tornou-se mais forte no espectro de IV de CS-FA do que de quitosana, correspondendo à vibração de alongamento C =O da nova ligação amido. O resultado indicou que o FA foi conjugado com sucesso ao amidogênio da quitosana via ligação amido. Para investigar a porcentagem de AF na conjugação, foi elaborada uma curva padrão por espectrofotometria ultravioleta. E o percentual de AF foi calculado em 23,4 ± 2,5%.

Via sintética do conjugado CS-FA

Espectros de FTIR de ( a ) FA, ( b ) quitosana e ( c ) CS-FA

Preparação de HFNDs

É do conhecimento comum que a solubilidade do HCPT em água é extremamente pobre, mas pode se dissolver em álcali. A quitosana é exatamente o oposto:solúvel em ácidos e insolúvel em água. E o CS-FA apresentou solubilidade semelhante à quitosana. Assim, o HCPT e o CS-FA foram dissolvidos em álcali e ácidos, respectivamente. Quando as duas soluções foram misturadas, a reação de neutralização aconteceria. A mistura produzida foi controlada para ser neutra, o que seria um solvente pobre para HCPT e CS-FA. A diminuição da solubilidade desencadeada por mudanças de pH forneceu uma oportunidade para a nucleação de nanagulhas HCPT e a coprecipitação de CS-FA para as nanagulhas HCPT em crescimento (Fig. 3a). A nucleação dinâmica e precipitação das nanagulhas sob ultrassom, mais a oclusão ativa do ingrediente macio CS-FA, levaram à formação de HFNDs, em vez de cristal HCPT em massa. Para otimizar as condições de formulação, um experimento de condição foi projetado para estudar o efeito da razão de HCPT para CS-FA, potência ultrassônica, pH da mistura produzida e concentração da mistura produzida na morfologia de HFNDs (Tabela 1).

a Ilustração do método totalmente ecológico de preparação de HFNDs. b , c As imagens SEM de HFNDs

A Figura 4 mostra a morfologia das partículas em diferentes condições. Quando o CS-FA era excessivo, o excesso de CS-FA se prendia à superfície das partículas produzidas (Fig. 4a). Enquanto o CS-FA era muito pequeno, o CS-FA não foi capaz de parar o crescimento das nanagulhas HCPT, que eram propensas a se agregar (Fig. 4b). Como a nucleação foi desencadeada por mudanças de pH, o pH da mistura produzida teve um papel importante no processo de preparação. O pH deve ser controlado para neutro, ou a cristalização seria danificada (Fig. 4c). A potência ultrassônica também teve grande influência na morfologia dos HFNDs. As nanagulhas se agregariam em baixa potência (Fig. 4d) e se quebrariam em fragmentos em alta potência (Fig. 4e). Além disso, descobriu-se que a concentração da mistura produzida tem um grande efeito no tamanho dos HFNDs. O tamanho diminuiu com o aumento da concentração (Figs. 3b e 4f).

a - f As imagens SEM de HFNDs sob diferentes condições (ver detalhes na Tabela 1). g Distribuição do tamanho de partícula dos HFNDs. h Potencial Zeta dos HFNDs

A Figura 3b, c mostra a morfologia em forma de agulha otimizada dos HFNDs com um comprimento médio de cerca de 800 nm e a largura de cerca de 80 nm. O resultado da medição DLS mostra um tamanho de 104,3 ± 5,7 nm (Fig. 4g) e um potencial zeta de +16,3 ± 1,9 mv (Fig. 4h). Além do mais, uma dispersão de 2% em peso de HFNDs mostrou boa estabilidade por 2,5 dias, pelo menos. Uma vez que não há sinais de fluorescência de CS-FA, podemos medir o conteúdo de carga de droga HCPT dos HFNDs usando as características de fluorescência do HCPT. O conteúdo de carga de droga HCPT dos HFNDs foi de 70,2 ± 3,1%, e a eficiência de encapsulação foi de 83,1%. E o conteúdo de AF dos HFNDs foi de 7,0%, calculado por meio da porcentagem de AF no CS-FA.

Análise de XRD

Como se sabe, a forma do fármaco afeta muito as propriedades das nanopartículas. Portanto, é de grande importância compreender a forma de HCPT nos HFNDs. A difração de raios-X foi empregada para detectar a forma de HCPT dentro dos HFNDs (Fig. 5). É claro que o HCPT puro mostra muitos picos cristalinos agudos, representativos das características de alta cristalinidade. Enquanto os amplos picos de quitosana semicristalina ainda existiam no padrão de XRD dos HFNDs, a maioria dos picos pertenciam ao HCPT, sugerindo a alta cristalinidade do HCPT. Em suma, os resultados de XRD sugerem que HCPT está no estado cristalino em HFNDs. Além disso, a cinética de crescimento do HCPT dentro dos HFNDs foi alterada, principalmente devido à oclusão ativa e aos efeitos de confinamento do CS-FA. Para investigar o efeito do CS-FA no processo de cristalização, os cristais de HCPT foram preparados sem a existência de CS-FA. A Figura 6 mostra a morfologia dos cristais HCPT. Eram em forma de bastão, com comprimento superior a 10 μm, totalmente diferente dos HFNDs. Isso demonstrou ainda que o CS-FA alterou a cinética de crescimento do HCPT dentro dos HFNDs.

Os padrões de XRD de ( a ) quitosana, ( b ) HCPT, e ( c ) MHNDs

A imagem SEM de cristais em massa HCPT

Estudos de liberação de drogas in vitro

Uma vez que o comportamento de liberação do fármaco é uma propriedade importante para um sistema de liberação de fármacos, os estudos de liberação in vitro dos HFNDs foram realizados usando uma técnica de diálise, juntamente com pós de HCPT livres. Todas as amostras foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os perfis de liberação são mostrados na Fig. 7. O perfil de HCPT livre mostrou que pelo menos 30% da droga foi liberada no primeiro tempo de amostragem de 1 he quase 100% em 18 h. No entanto, o perfil de liberação dos HFNDs parece ser uma liberação prolongada e sustentada das duas drogas ao longo de 48 horas. A liberação prolongada do fármaco pode ser atribuída ao fato de que o invólucro polimérico de CS-FA pode limitar a liberação do fármaco no núcleo. Essas vantagens poderiam promover a aplicação dos HFNDs para o sistema de liberação sustentada de medicamentos.

Perfis de liberação de droga in vitro dos MHNDs em PBS (pH 7,4) a 37 ° C. ( a ) HCPT grátis; ( b ) HFNDs

Captação celular

Não importa como o sistema de liberação do fármaco atinja o local do tumor alvo, por administração sistêmica ou por administração local direta, é de grande importância que eles possam penetrar na área do tumor para atuar em seu alvo intracelular. Microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) foi realizada para avaliar a captação celular de HFNDs. Para avaliar sua eficiência de absorção celular por células HeLa, os HFNDs e as nanagulhas carregadas com HCPT (NDs; carga de droga =64,7%) foram incubados com células HeLa por 8 h a 37 ° C (os NDs foram preparados por HCPT e quitosana via o mesmo método que os HFNDs). Como mostrado na Fig. 8, uma emissão de fluorescência muito mais intensa de HCPT foi detectada a partir das células expostas aos HFNDs do que aquelas expostas a NDs após 8 h de incubação, ilustrando que o FA na superfície das partículas poderia aumentar muito a captação celular.

Administração intracelular do fármaco por 8 h a 37 ° C. Imagens de microscopia de varredura a laser confocal de células HeLa incubadas com a HFNDs e b NDs

Para confirmar ainda mais que a taxa de internalização celular dos HFNDs foi mais rápida, medições de fluorescência foram realizadas para quantificar a diferença de intensidade de emissão de fluorescência de HCPT nas células HeLa. Consistente com as observações do CLSM, os HFNDs foram muito mais favorecidos do que os NDs no processo de internalização celular (Fig. 9). Isso validou ainda mais a propriedade de segmentação dos HFNDs.

Medições de fluorescência das células HeLa incubadas com HFNDs ( a ) e NDs ( b ) ao longo de um período de incubação de 8 h a 37 ° C; P <0,05

Ensaios de citotoxicidade

Para investigar mais a possibilidade de utilizar os HFNDs para entrega local de drogas, testamos a capacidade de matar os HFNDs de células cancerosas. A citotoxicidade de HFNDs foi avaliada usando o ensaio MTT com células HeLa. O HCPT livre e os NDs contendo concentrações equivalentes de HCPT foram usados como controle. As concentrações de HCPT foram 0,50, 1,00, 2,00, 4,00, 8,00 e 16 μg / mL. Como é mostrado na Fig. 10, a citotoxicidade do HCPT foi maior do que a dos NDs, principalmente por causa da taxa de liberação do fármaco de HCPT muito mais rápida do que a dos NDs. No entanto, a citotoxicidade dos HFNDs foi maior do que a do HCPT. Isso provavelmente se deveu à propriedade de direcionamento do FA na superfície dos HFNDs, que poderia ajudar as partículas a entrar nas células e matá-las. Assim, os HFNDs apresentaram capacidade surpreendentemente boa de matar as células cancerosas. Esses resultados confirmam que o FA na superfície dos HFNDs pode aumentar a absorção celular das partículas e, assim, aumentar sua capacidade de matar as células cancerosas pela ligação com os receptores de FA.

Viabilidade celular in vitro de células HeLa tratadas com ( a ) HCPT grátis, ( b ) NDs, e ( c ) HFNDs após incubação de 24 h. P <0,05

Biodistribuição

Para avaliar a capacidade de alvo tumoral de nanagulhas de dupla droga, DiR foi usado como uma sonda de fluorescência no infravermelho próximo a ser encapsulada em HCPT, NDs e HFNDs livres na concentração DiR equivalente. NaCl a 0,9%, DiR-NDs e DiR-HFNDs foram injetados por via intravenosa em tumores portadores de camundongos derivados de células HeLa de carcinoma cervical humano, e suas biodistribuições in vivo foram investigadas.

Conforme representado na Fig. 11a, enquanto nenhum sinal fluorescente foi detectado em locais de tumor no grupo de DiR-NDs, um forte sinal fluorescente foi visualizado no grupo DiR-HFND. Quando as contagens de fluorescência total foram reduzidas o tempo todo, a intensidade do sinal no local do tumor aumentou de 1 para 12 h, indicando que os HFNDs estavam se acumulando nos tumores durante esse tempo. Após 24 h, os camundongos foram sacrificados e os tecidos tumorais, bem como os tecidos normais, foram isolados para imagem e análise ex vivo (Fig. 11b, c). A intensidade de fluorescência no tecido tumoral de camundongos tratados com DiR-HFNDs foi significativamente mais alto do que os outros ratos. Foi validado que a introdução de AF ofereceu às nanagulhas uma excelente eficácia de direcionamento de tumor, levando a um tratamento de câncer mais altamente eficiente.

a Distribuição e acúmulo de tumor de nanopartículas DiR em camundongos com tumor HeLa recebendo injeção intravenosa das formulações indicadas. b Imagem de fluorescência ex vivo do tumor e tecidos normais colhidos de camundongos nus portadores de tumor HeLa sacrificados. As imagens foram obtidas 24 horas após a injeção. H, Li, Lu, K, S e T representam o coração, fígado, pulmão, rim, baço e tumor, respectivamente. c Intensidade de fluorescência DiR em tecidos tumorais coletados 24 horas após a injeção sistêmica. P <0,05. ( a ) 0,9% NaCl, ( b ) DiR-NDs e ( c ) DiR-HFNDs

Inibição de tumor in vivo

Para avaliar os efeitos antitumorais in vivo, geramos xenoenxertos de tumor HeLa em camundongos Kunming e avaliamos o crescimento do tumor após a administração intravenosa de NaCl a 0,9%, HCPT livre, NDs e HFNDs com a mesma concentração de HCPT. Em comparação com os camundongos tratados com NaCl a 0,9% como controle, a taxa de crescimento dos tumores em camundongos que receberam HCPT livre ou NDs diminuiu gradualmente (Fig. 12a), indicando a inibição do crescimento tumoral significativamente eficaz. Digno de nota, os HFNDs levaram à inibição mais pronunciada do crescimento do tumor. No final do experimento, os tumores foram excisados e pesados. Conforme mostrado na Fig. 12c, verificou-se que as nanagulhas de fármaco duplo tinham eficácia terapêutica superior em comparação com os outros grupos ( P <0,05). Uma evidência adicional do efeito anticâncer intensificado das nanagulhas de fármaco duplo foi mostrada nas imagens histológicas (Fig. 12d). Para qualquer sistema de entrega de drogas, a toxicidade sistêmica que geralmente é encontrada no tratamento mediado pelo HCPT gratuito deve ser considerada para garantir a segurança e a eficácia. Neste trabalho, a administração do HCPT livre resultou em apatia / preguiça e severa perda de peso corporal de camundongos (Fig. 12b), indicativo dos indesejáveis efeitos colaterais da quimioterapia. Pelo contrário, nenhum efeito colateral óbvio foi mostrado nos camundongos tratados com NDs e HFNDs. No geral, foi indicado que os HFNDs com efeitos anticâncer superiores, bem como toxicidade mais baixa, melhorariam muito a eficácia da terapia de qualidade de vida.

Efeitos anticâncer de diferentes (nano) formulações. a Alteração de volume do tumor em camundongos durante o tratamento. b Mudança de peso dos camundongos com tumor durante o tratamento. c Pesos de tumores HeLa após serem tratados por diferentes formulações. d Corte histológico do tumor dos camundongos após o tratamento. ( a ) Solução aquosa de NaCl a 0,9%, ( b ) HCPT grátis, ( c ) NDs, e ( d ) HFNDs. Todas as formulações usaram a mesma concentração de HCPT em tumor HeLa portador de camundongos. P <0,05

Conclusões

O estudo aqui apresentado apresenta uma abordagem completamente ecológica para obter nanagulhas carregadas com HCPT modificadas por FA para a quimioterapia altamente eficiente com alta carga de droga, propriedade de direcionamento e capacidade de imagem. O perfil de liberação da droga revelou que os HFNDs mostraram uma liberação sustentada e prolongada. O CLSM demonstrou a internalização celular mais eficaz de HFNDs do que NDs. O experimento MTT indicou que os HFNDs não apenas mostraram uma citotoxicidade muito maior do que os medicamentos e NDs individuais. Isso ilustrou a boa propriedade de direcionamento dos HFNDs. Este trabalho abre uma porta para projetar novas dosagens de nanopartículas com o método completamente verde, que podem ter um efeito poderoso na proteção ambiental no futuro.

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