Nanolipossomas decorados com anticorpo monoclonal PD-L1 carregados com Paclitaxel e inibidor de transporte P-gp para a quimioterapia sinérgica contra cânceres gástricos resistentes a múltiplas drogas

Resumo

A resistência a múltiplas drogas (MDR) com base em transportadores de efluxo dependente de ATP (p-glicoproteína (p-gp)) continua sendo um grande obstáculo para o sucesso do tratamento quimioterápico. Aqui, investigamos o potencial do nanolipossoma conjugado com mAb PD-L1 para servir como uma plataforma de entrega direcionada para a coadministração de paclitaxel (PTX) e inibidor de transporte específico de p-gp (TQD, tariquidar) em cânceres gástricos resistentes a drogas . Duas drogas, PTX e TQD, foram carregadas em um único veículo em uma proporção precisa para aumentar a perspectiva do efeito quimioterápico da combinação. O estudo de captação celular indicou que PD-PTLP tinha maior eficiência de internalização no receptor PD-L1 com superexpressão de células SGC7901 / ADR do que PTLP não direcionado. A sinergia mais alta foi observada em uma fração de peso de 1 / 0,5 (PTX / TQD) e a combinação de PTX e TQD resultou em um efeito sinérgico óbvio em comparação com o de drogas individuais sozinhas. Nossos resultados in vitro mostraram que o TQD foi eficaz em reverter a multirresistência em células SGC7901 / ADR. O valor de IC50 de PD-PTLP foi de 0,76 μg / ml em comparação com 6,58 μg / ml e 7,64 μg / ml para PTX e TQD, respectivamente. PD-TPLP desencadeou níveis significativamente mais elevados de espécies reativas de oxigênio (ROS) e apoptose celular em comparação com a de PTX livre ou TQD. Além disso, o estudo antitumoral in vivo mostrou que a combinação de quimioterapia de PD-PTLP exibiu uma inibição significativa da carga tumoral de tumores de xenoenxerto resistentes a drogas com células positivas de rotulagem terminal de desoxinucleotidil transferase dUTP (TUNEL). Além disso, PTX livre resultou em aumento significativo nos níveis de AST e ALT, enquanto PD-PTLP insignificantemente diferente em comparação com aquele de controle indicando o índice de segurança. No geral, acreditamos que a combinação de medicamento anticâncer com um inibidor de p-gp pode fornecer uma direção potencial para o tratamento de tumores gástricos resistentes a medicamentos.

Introdução

Os atuais tratamentos quimioterápicos baseados em regime de medicamento único estão longe de ser perfeitos e sofrem graves efeitos adversos em doses mais elevadas e, simultaneamente, levam ao desenvolvimento de resistência aos medicamentos [1]. A década passada testemunhou a alta eficácia terapêutica do regime de drogas combinadas no tratamento do câncer [2]. A combinação de dois ou mais medicamentos demonstrou produzir eficácia anticâncer sinérgica devido à ação farmacológica diferente dos medicamentos combinados [3, 4]. No entanto, a escolha de uma combinação certa de drogas depende de vários fatores, incluindo o tipo de célula cancerosa, drogas hidrofílicas / hidrofóbicas, atividades bioquímicas e padrões farmacocinéticos das drogas. Entre todos, a combinação de drogas é seletiva para tipos específicos de câncer [5].

O câncer gástrico é um problema de saúde global e a segunda causa mais comum de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. A prevalência de câncer gástrico é alta no Leste Asiático, como Japão, Coréia e China, sendo que este último relata a maior taxa de mortalidade do mundo [6]. Em média, 400.000 novos casos são registrados a cada ano na China e a maioria dos casos são diagnosticados em estágios avançados / tardios [7, 8]. Um tremendo progresso foi feito nas estratégias de tratamento; no entanto, não melhorou a taxa de sobrevivência e resultou em falha na terapia. A falha do tratamento atribuída principalmente ao desenvolvimento de quimiorresistência e toxicidade grave da dose de quimioterapia e recorrência do episódio de câncer gástrico [9]. Portanto, há uma tarefa urgente para melhorar a eficácia terapêutica e superar a metástase e recorrência do câncer gástrico.

O paclitaxel (PTX) é um dos medicamentos importantes indicados no tratamento do câncer gástrico [10]. A PTX inibe a replicação celular ao interferir na degradação dos microtúbulos, levando à parada do ciclo celular. No entanto, a aquisição de resistência a múltiplas drogas (MDR) é um grande problema entre o sucesso da quimioterapia [11, 12]. O efluxo dependente de ATP mediado por transportadores transmembrana da família de cassetes de ligação de ATP (ABC) em que a p-glicoproteína (p-gp) é considerada o fator afluente é superexpressada em câncer gástrico [13]. Por outro lado, PTX serve como um substrato para receptores p-gp em que o efluxo da droga irá reduzir a concentração intracelular da droga levando a uma baixa eficácia e alta resistência [14]. A este respeito, Tariquidar (TQD) é um potente inibidor da p-gp de terceira geração e foi relatado para reverter a superexpressão de receptores p-gp em várias células cancerosas [15, 16]. No entanto, relatórios sugeriram que a administração de TQD deve ser interrompida precocemente, pois impede a função p-gp do sistema fisiológico normal. A expressão da P-gp é necessária para manter a barreira hematoencefálica (BBB) ​​e remover as toxinas dos tecidos normais [17]. Uma vez que a p-gp está presente nos tecidos normais e atua como uma barreira contra as toxinas celulares, a inibição não específica de PTX ou TQD poderia interferir potencialmente nas funções fisiológicas normais e levar a toxicidade adversa. Além disso, PTX e TQD são drogas altamente lipofílicas com solubilidade limitada em soluções aquosas e sangue sistêmico, necessitando de um sistema de entrega de drogas estável que seja direcionado para os cânceres gástricos no corpo [18].

O sistema de entrega de drogas (DDS) aumentou significativamente a concentração de drogas encapsuladas nos tecidos cancerígenos e ofereceu uma liberação sustentada da droga por um período de tempo prolongado [19]. A este respeito, o lipossoma é um dos transportadores de fármacos amplamente utilizados para melhorar a eficácia terapêutica em cancros. Os lipossomas ganharam importância crescente devido à sua biocompatibilidade, modificações estruturais da superfície, carga hidrofílica / lipofílica de fármaco e alta capacidade de carga de fármaco [20]. Os medicamentos podem ser incorporados de forma estável na bicamada lipídica do lipossoma e facilmente dotados de capacidade de longa circulação (PEGylation) por efeito de permeação e retenção (EPR) aprimoradas [21]. Recentemente, foi relatado que o lipossoma tem a capacidade de reter as múltiplas proporções de drogas após a administração intravenosa [22]. Essa ideia foi demonstrada em 2017 após a aprovação do FDA, Vyxeos® (formulação lipossomal) contendo proporções de citarabina:daunorrubicina no tratamento da leucemia [23]. Em comparação com as formulações não direcionadas, as formulações direcionadas ao ligante foram muito atraentes e prospectivas. A este respeito, PD-1 é um receptor de superfície celular conhecido pela regulação negativa do sistema imunológico e suprime a atividade inflamatória das células T. A expressão de PD-L1 foi relatada em 50% dos pacientes com câncer gástrico fazendo PD-L1 como um receptor de direcionamento para internalização de nanopartículas [24, 25]. O anticorpo monoclonal PD-L1 (mAb) pode se ligar especificamente ao domínio extracelular da proteína PD-L1 e pode ser uma excelente estratégia terapêutica para melhorar a eficácia anticâncer [26].

O objetivo principal do presente estudo foi melhorar a entrega de drogas combinatórias, PTX e TQD para aumentar a eficácia anticâncer contra o câncer gástrico. Para este propósito, PD-L1 / nanolipossomo carregado com PTX e TQD foi formulado e avaliado quanto à eficácia anticâncer em condições in vitro e in vivo. A eficácia in vivo foi avaliada em modelo de xenoenxerto baseado em células de câncer gástrico e imunohistoquímica (IHQ) foi realizada.

Conclusão

Em conclusão, nosso trabalho realizou terapia de combinação contra tumor MDR por estratégia de entrega programada. Demonstramos o potencial da combinação de PTX e inibidor de p-gp (TQD) na inibição da carga tumoral de tumores de xenoenxerto multirresistentes SGC7901 / ADR. A co-entrega de PTX e TQD em um nanocarreador multifuncional permitiu o controle raciométrico de drogas anticâncer co-carregadas, inibiu a bomba de efluxo p-gp e exibiu a eficácia anticâncer sinérgica. Acreditamos que a combinação de uma droga anticâncer com um inibidor de p-gp pode fornecer uma direção potencial para o tratamento de tumores resistentes a drogas.

Materiais e métodos

Formulação de nanolipossomas carregados com PTX / TQD conjugados com mAb PD-L1

O ovo fosfatidilcolina (EPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietilenoglicol) -2000] ( DSPE-PEG) e DSPE-PEG2000-maleimida (DSPE-PEG2000-Mal) misturados em uma solução de clorofórmio a uma razão molar de 3/2 / 0,5 / 0,25 juntamente com PTX e TQD e, em seguida, o solvente orgânico foi evaporado usando um evaporador rotativo seguido de liofilização por 3 h. O filme lipídico foi hidratado com uma solução de sulfato de amônio 250 mM mantida a pH 7,0. Os grandes lipossomas multilamelares foram sonicados por 30 min em um sonicador tipo banho (Branson ultrasonicbath, EUA) mantido a 65 ° C. Os lipossomas foram dialisados ​​contra grande volume de água destilada durante estritamente 1 h para trocar o fármaco livre e os componentes iniciais. Os lipossomas foram redispersos em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4). O mAb PD-L1 foi conjugado ao lipossoma por mistura na proporção de 8:1 (lipossoma:mAb) e incubado a 4 ° C durante 4 h. O mAb PD-L1 será conjugado ao DSPE-PEG2000-Mal pela interação entre resíduos sulfidrila nos anticorpos para os grupos maleimida C-terminal dos lipossomas. Os lipossomas conjugados com PD-L1 foram centrifugados a 10.000 rpm por 10 min e o sobrenadante foi removido e redisperso em um tampão PBS e armazenado a 4 ° C até análise posterior. A quantidade de PTX e TQD encapsulada no lipossoma foi avaliada pelo método HPLC. O sistema HPLC Agilent Technologies modelo 1260 Infinity equipado com um amostrador automático da Agilent Technologies e um detector de matriz de diodos G1315D foi usado no estudo. A fase móvel consiste na mistura de acetonitrila / água (70:30 v / v) mantida a uma vazão de 1 ml / min. Uma coluna C18 (5 μm, 150 × 60 mm, ODS-3) foi usada para eluir as amostras e detectada em 227 nm. Antes, o lipossoma carregado com PTX / TQD foi dissolvido em um acetonitrila e agitado em vórtice por 15 min, filtrado através de um filtro de 0,45 μm e 10 μl de alíquota foram injetados na coluna de HPLC.

Distribuição do tamanho e análise da morfologia das partículas

A distribuição de tamanho e o potencial zeta das formulações carregadas com o fármaco foram determinados por Malvern zetasizer (UK) a 25 ° C. Antes do experimento real, as dispersões de nanopartículas foram diluídas 10x com a água destilada e o experimento foi realizado em um ângulo de detecção de 90 ° em triplicata. A morfologia das nanopartículas foi avaliada por microscópio eletrônico de transmissão (TEM). As dispersões de nanopartículas foram diluídas 10x com a água destilada e colocadas em uma grade de cobre revestida com carbono e secas usando lâmpada IR e a amostra foi avaliada por TEM (CM 30, Philips (Eindhoven, Holanda)) após coloração com acetato de uranila (1% w / v).

Análise do perfil de versão

O perfil de liberação de PTX e TQD do nanolipossoma foi avaliado pelo método de diálise. Para este propósito, 15 mg de pó liofilizado de PD-L1 mAb-conjugado PTX e nanolipossomas carregados com TQD (PD-PTLP) foi dissolvido em 1 ml de água destilada e selado em uma membrana de diálise (MWCO 3,5 kDa) e imerso em um 30 ml do respectivo tampão de libertação mantido a 37 ° C. No tempo predeterminado, alíquotas de amostras foram retiradas e substituídas por igual quantidade de tampão de liberação. O estudo continuou por 72 horas. As amostras foram filtradas em filtro de seringa de 0,22 μm e injetadas na coluna de HPLC e avaliadas pelo método citado acima.

Estudos de captação celular

As células SGC7901 / ADR foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de FBS e 100 IU / ml de penicilina e 100 μg / ml de estreptomicina sob a condição de 5% de CO ₂ atmosfera a 37 ° C. Um microscópio de varredura a laser confocal (BX61WI; Olympus, Tóquio, Japão) foi usado para avaliar a distribuição celular e a captação celular de PTLP e PD-PTLP em células SGC7901 / ADR. Para atingir este propósito, 1 × 10 ⁵ as células foram semeadas em cada poço da placa de 12 poços e incubadas por 18 h. As células foram então expostas com PTLP e PD-PTLP e incubadas por 3 h. As células foram lavadas três vezes com PBS frio e fixadas com paraformaldeído (PFA) a 4% durante 10 min. As células foram novamente lavadas com PBS e coradas com 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min. Finalmente, as células foram cuidadosamente lavadas e observadas sob CLSM. O experimento competitivo na captação de PD-PTLP foi realizado por pré-tratamento das células com mAb PD-L1 livre por 30 min e lavadas. As células foram divididas em dois grupos, um tratado com mAb PD-L1 livre e outro não tratado com mAb PD-L1 livre. As células foram incubadas com PD-PTLP e incubadas por 3 h e o mesmo método foi seguido para a avaliação da análise de captação celular.

Expressão de proteína por ensaio de Western blot

As células SGC7901 / ADR foram semeadas em placa de 6 poços a uma densidade de semeadura de 3 × 10 ⁵ células / poço e incubadas por 18 h. As células foram tratadas com diferentes formulações (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) e incubadas por 24 h. As células foram lavadas e extraídas com tampão de separação e lisadas usando um tampão de lise padrão (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). As células foram centrifugadas a uma velocidade de 12.000 rpm por 15 min e o sobrenadante foi coletado e a quantificação da proteína foi realizada usando ensaio de proteína BCA (Beyotime). Quantidades iguais de proteínas foram carregadas em gel de SDS-PAGE a 8% e depois transferidas para uma membrana de nitrocelulose (EMD Millipore, Billerica, MA, EUA). A membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5% durante 1 h para inibir os locais de ligação não específicos. A membrana foi incubada com anticorpos primários (p-gp e GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, EUA) a 4 ° C durante a noite. A membrana foi lavada com TBST e novamente incubada com anticorpos secundários de anticorpos de cabra anti-coelho ou rato marcados com peroxidase de rábano (coelho ou camundongo, 1:10.000, Abcam, MA, EUA) à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas novamente com TBST. As manchas foram visualizadas sob um método de quimioluminescência aprimorada (EMD Millipore).

Análise de citotoxicidade in vitro

O efeito citotóxico de medicamentos e formulações individuais foi avaliado pelo ensaio MTT. Resumidamente, as células cancerosas foram colocadas em camadas com uma densidade de 1 × 10 ⁴ células / poço em uma placa de 96 poços e incubados por 18 h. As células foram então tratadas com PTX, TQD, PTLP e PD-PTLP livres, respectivamente, por 24 h. Em seguida, as células foram cuidadosamente lavadas e adicionadas com 15 μl de solução de MTT 5 mg / ml e submetidas por 3 h de incubação adicional e então 100 μl de DMSO foram adicionados para extrair o cristal de formazan. A absorbância resultante foi medida a 570 nm usando um leitor automático de microplacas. A viabilidade celular é calculada por DO do grupo de teste / DO do controle × 100%. O índice de combinação foi avaliado por Calcusyn ^TM Programas. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Apoptose in vitro e análise de espécies reativas de oxigênio

Para o ensaio de apoptose, as células cancerosas foram colocadas em camadas com uma densidade de 2 × 10 ⁵ células / poço em uma placa de 12 poços e incubadas por 18 h. As células foram então tratadas com PTX, TQD, PTLP e PD-PTLP livres, respectivamente, por 24 h. As células foram extraídas por stripping e centrifugadas e os pellets foram redispersos em 100 μl de tampão de ligação. As células foram co-coradas com uma combinação de 5 μl de anexina-V / FITC e 2,5 μl de solução de trabalho PI e incubadas por 15 min. As células coradas foram analisadas por citômetro de fluxo usando um BD FACS Calibur (BD Biosciences, CA, EUA). A anexina-V e o IP representam o indicador de apoptose precoce e o indicador de apoptose tardia com base nos componentes estruturais das células vivas e mortas, respectivamente.

O diacetato de 2,7-diclorofluorescina (DCFH-DA) foi utilizado como sonda para a análise das espécies reativas de oxigênio (ROS). Para análise quantitativa, 1 × 10 ⁴ células / poço foram semeadas em uma placa de fundo preto de 96 poços e incubadas por 18 h. As células foram então tratadas com PTX, TQD, PTLP e PD-PTLP livres, respectivamente, por 24 h. As células foram lavadas com tampão PBS e, em seguida, incubadas com 1 ml de solução DCFH-DA de acordo com as diretrizes do fabricante por 30 min. Seguido por células lisadas e centrifugadas a 10.000 rpm por 15 min. O sobrenadante resultante foi transferido para uma nova placa de 96 poços e a fluorescência foi medida a 485 nm usando um leitor de microplacas automatizado. Simultaneamente, um conjunto separado de células foi processado de maneira semelhante e as imagens foram observadas usando microscópio de fluorescência (Nikon A1, Japão).

Eficácia antitumoral de PD-PTLP em modelo de xenoenxerto

O estudo de eficácia antitumoral foi realizado em camundongos nus BALB / c e foi obtido de Laboratory Animal Center, The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os padrões nacionais de qualidade de animais de laboratório. Os experimentos foram realizados estritamente de acordo com as diretrizes do Comitê de Regulamentações para Animais Experimentais do The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin. Os animais foram injetados por via subcutânea com 1 × 10 ⁶ Células SGC7901 / ADR em 150 μl de meio de cultura no flanco direito dos camundongos. Os tumores foram autorizados a crescer até 100 mm ³ antes do experimento real. Os ratos foram divididos igualmente em cinco grupos com oito ratos em cada grupo. A dose individual de PTX e TQD foi fixada em 5 mg / kg, enquanto a combinação usou uma dose total de 5 mg / kg. A injeção na veia da cauda foi a cada três dias, no total, foram realizadas três injeções. Em dias pré-determinados, o volume do tumor e o peso corporal foram medidos. O volume do tumor foi calculado medindo o diâmetro mais longo e o diâmetro mais curto dos tumores usando um paquímetro digital. Volume do tumor ( V ) =½ × comprimento × largura (mm) ² . Os camundongos foram sacrificados no final do estudo e o tumor foi extraído e pesado. O tumor foi submetido à análise imunohistoquímica (IHQ). Os tumores foram extraídos, fatiados em pedaços finos e fixados em solução de formalina a 10%. Os tumores foram incluídos em uma cera de parafina e, em seguida, realizados o ensaio TUNEL de acordo com as orientações do fabricante.

Análise bioquímica do soro

Os ratos foram administrados com as respectivas formulações; 24 h depois, os camundongos foram sacrificados e amostras de sangue foram coletadas do controle, bem como dos grupos de animais tratados com teste. O soro é separado do sangue total e armazenado a -80 ° C até análise posterior. A análise bioquímica do soro foi conduzida para avaliar o desempenho do fígado. Aspartato transaminase (AST) e alanina transaminase (ALT) foram medidas para avaliar a função hepática. Todas as medidas foram realizadas de acordo com os procedimentos do ensaio do kit bioquímico.

Resultados e discussão

Preparação e caracterização de nanolipossomas conjugados com PD-L1 carregados com PTX / TQD

O PTX tem sido amplamente utilizado na clínica e principalmente indicado no tratamento de câncer gástrico. No entanto, a maioria dos pacientes aparentemente sofre de má resposta terapêutica devido à resistência a múltiplas drogas (MDR) dos cânceres gástricos. Um aumento na dose de PTX resultou em aumento da toxicidade sistêmica, portanto, a MDR se tornou um grande obstáculo no tratamento bem-sucedido da terapia do câncer. Entre a grande quantidade de mecanismos MDR, o efluxo de drogas mediado por p-gp é considerado o principal responsável pela resistência às drogas em células cancerosas [27]. Portanto, neste estudo, usamos uma segunda droga (TQD) como um inibidor da p-gp para superar o fenômeno MDR nas células cancerosas e melhorar a eficácia anticâncer da PTX. Estudamos cuidadosamente a fração de peso de duas drogas nas quais exibem o efeito sinérgico. A fim de maximizar o efeito anticâncer, é importante co-entregar os vários medicamentos em um único sistema de nanopartículas. A administração de duas drogas (PTX e inibidor da p-gp) simultaneamente permitirá a supressão eficiente do mecanismo de efluxo da droga e aumentará a perspectiva de aumento das concentrações intracelulares nas células cancerosas [28]. Para tanto, neste estudo, carregamos dois fármacos na bicamada lipídica dos nanolipossomos que são considerados extremamente estáveis ​​nas circulações sistêmicas (fig. 1). Para atingir o direcionamento específico do tumor intensificado, os nanolipossomas foram conjugados na superfície com o mAb PD-L1. O grupo maleimida presente no nanolipossoma se ligará ao grupo tiol do mAb PD-L1 e formará uma ligação covalente estável. Mas uma possível limitação da conjugação da maleimida é que a reação é reversível:o produto pode sofrer reações de adição retro-Michael com tióis biológicos no plasma, o que pode levar à liberação da maleimida. No entanto, superamos essa reação por conjugação máxima da superfície do anticorpo no lipossoma maleimida. Foi relatado que o ligante direcionado ao tumor entregará especificamente a carga terapêutica nos tecidos tumorais e evitará efeitos colaterais desnecessários nos tecidos normais. Anteriormente, Patel et al. relataram que a incorporação do inibidor de p-gp com PTX poderia superar o MDR na célula de câncer de ovário em condições in vitro [11]. Da mesma forma, Zou et al. e Zhang et al. relataram que a citotoxicidade de PTX contra células SKOV-3TR e A2780-Adr multirresistentes aumentou significativamente na presença de Tariquidar. No entanto, nesses estudos, a combinação física de PTX + TQD foi usada ou o portador não direcionado foi desenvolvido [29, 30]. É importante ressaltar que todos esses estudos foram realizados apenas em condições in vitro. O presente estudo se concentrou em projetar o nanocarreador direcionado usando uma classe relativamente nova de agente de direcionamento, o anticorpo PDL1. Além disso, o presente estudo demonstrou a eficácia da PTX + TQD no modelo tumoral de xenoenxerto e avaliou os parâmetros sanguíneos para relacionar com a toxicidade sistêmica.

Ilustrações esquemáticas de carregamento de paclitaxel e tariquidar em nanolipossomas conjugados de superfície com anticorpo monoclonal PD-L1 (mAb). O lipossoma foi preparado por hidratação de um filme de lipídio fino e sonicado para formar os nanolipossomas carregados com a droga

O tamanho médio de partícula de PTLP foi 135,6 ± 1,26 nm, enquanto aumentou para 168,59 ± 1,34 nm após a conjugação com PD-L1 mAb (PD-PTLP). O tamanho de partícula aumentou devido ao grande peso molecular do mAb PD-L1; no entanto, o tamanho total inferior a 200 nm e a forma esférica foi o ponto a ser observado (Fig. 2a). Nanopartículas de tamanho inferior a 200 nm permitirão maior acúmulo nos tecidos tumorais devido ao efeito de permeação e retenção (EPR) aprimorado. Além disso, a presença de PEG permitirá o tempo prolongado de circulação sanguínea na circulação sistêmica. O potencial zeta de PD-PTLP foi de 22,1 ± 1,21 mV, o que não permitirá qualquer ligação não específica aos componentes do sangue. PD-PTLP exibiu uma alta eficiência de aprisionamento de ~ 95% para ambas as drogas (PTX e TQD). PD-PTLP também exibiu uma alta carga de droga de 12-14% w / w para PTX e TQD, respectivamente (Fig. 2b).

Caracterização físico-química do nanolipossoma conjugado com PD-L1 carregado com PTX / TQD. a Análise da morfologia de PD-PTLP usando microscópio eletrônico de transmissão (TEM). b Capacidade de carga de drogas de PD-PTLP. c Liberação in vitro de PTX e TQD de PD-PTLP em condições de tampão de pH 7,4 e pH 5,0 a 37 ° C. ** p <0,01 é a diferença estatística na liberação do medicamento entre os tampões de pH 7,4 e pH 5,0

Liberação de medicamento in vitro

O comportamento de liberação de PTX e TQD de PD-PTLP foi estudado em condições de pH 7,4 e pH 5,0 a 37 ° C. Conforme mostrado na Fig. 2c, uma liberação controlada de drogas (PTX e TQD) foi observada a partir do PD-PTLP ao longo do período de estudo (72 h). A liberação do fármaco da bicamada espessa do nanolipossoma pode ser responsável pela liberação lenta e sustentada de dois fármacos do PD-PTLP. Deve-se notar que não foi observada diferença significativa no padrão de liberação de PTX e TQD em pH 7,4 e pH 5,0. Em um ponto de tempo mais longo, uma diferença significativa na liberação foi observada em diferentes condições de pH. É importante notar que nenhum elemento responsivo ao pH foi adicionado ao nanolipossoma e a maior liberação do fármaco em condições ácidas pode ser atribuída à maior difusão em pH mais baixo. Por exemplo, ~ 85% do PTX liberado em condições de pH 5,0 em comparação com ~ 55% da liberação do medicamento em ambiente de pH fisiológico. Um padrão semelhante de liberação rápida de pequenas moléculas em condições ácidas e liberação mais lenta em condições básicas de pH foi demonstrado por outros pesquisadores. No entanto, a liberação relativamente baixa do fármaco em condições de pH 7,4 pode reduzir os efeitos colaterais sistêmicos desnecessários e prolongar a circulação sistêmica, enquanto a liberação mais alta do fármaco em pH 5,0 pode beneficiar a maior eficácia terapêutica nos tecidos tumorais.

Análise de captação celular in vitro

A eficiência de entrega de nanolipossomas direcionados (PD-PTLP) e não direcionados (PTLP) foi testada em SGC7901 / ADR. A captação celular foi avaliada usando rodamina-B como rastreador de fluorescência. A rodamina-B é o fluoróforo comumente usado sem interações biológicas celulares. O núcleo foi corado com DAPI de cor azul e cor vermelha originada das nanopartículas. Os dados CLSM revelam claramente que PD-PTLP exibiu uma forte fluorescência vermelha nas células cancerosas em comparação com a de PTLP não direcionada. Uma maior fluorescência vermelha em células cancerosas tratadas com PD-PTLP atribuída à maior internalização de nanopartículas (Fig. 3a). O resultado dos dados CLSM indica que o receptor PD-L1 expresso na membrana celular foi reconhecido pelo mAb PD-L1 conjugado na superfície do nanolipossoma. Um mecanismo de captação não específico ou passivo foi evidente nas células cancerosas tratadas com PTLP. A especificidade do alvo PD-L1 foi ainda confirmada pelo experimento de pré-tratamento com mAb PD-L1. As células SGC7901 / ADR foram pré-tratadas com PD-L1 mAb e incubadas por 30 min. As células foram então expostas com PD-PTLP e PTLP e incubadas por 3 h. Como mostrado (Fig. 3b), as células pré-tratadas com o mAb PD-L1 mostraram significativamente menos fluorescência vermelha em comparação com as células não tratadas, indicando que o mAb PD-L1 foi consumido pelos receptores expressos na superfície e nenhum receptor adicional estava disponível para ligação e internalização resultando em menos absorção de nanopartículas e menos internalização. Este CLSM revelou claramente a especificidade de direcionamento de PD-PTLP em células cancerígenas SGC7901 / ADR.

a Imagens de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) de células SGC7901 / ADR após incubação com PTLP e PD-PTLP por 3 h; Imagens CLSM de células SGC7901 / ADR pré-tratadas com / sem mAb PD-L1 após incubação com PD-PTLP por 3 h. Rodamina B foi usada como um rastreador fluorescente e DAPI foi usado para corar o núcleo das células cancerosas

Nanolipossomas carregados com drogas duplas aumentam o efeito antiproliferativo

Para a terapia de combinação, diferentes proporções de duas drogas (PTX e TQD) foram usadas para estabelecer a extensão do efeito sinérgico ou aditivo nas células cancerosas gástricas resistentes. Para calcular o isobolograma e o índice de combinação (IC), foi usado o software CalcuSyn (Biosoft, versão 2.1). O gráfico de isobolograma pode ser explicado com base na equação de Chou-Talalay. Os valores de IC são caracterizados por sinérgicos (IC <0,9), aditivos (IC =1) e antagônicos (IC> 1). Como mostrado, todas as proporções de combinação de PTX e TQD revelaram um valor de IC de <1, significando um mecanismo de ação sinérgico (Fig. 4a). Para ser específico, a maior sinergia foi observada em uma fração de peso de 1 / 0,5 (P / T), enquanto o nível de sinergia diminuiu com o aumento na fração de peso TQD indicando a importância da presença de duas drogas na fração de peso específica. Uma concentração muito baixa e muito alta de TQD em um regime de combinação não produziu o melhor efeito sinérgico. Para todos os experimentos in vitro, usamos a relação P / T =1 / 0,5 no estudo.

a Índice de combinação (CI) de diferentes frações de peso de PTX e TQD em células SGC7901 / ADR. O índice de combinação foi avaliado por Calcusyn ^TM Programas. b Viabilidades celulares in vitro de células SGC7901 / ADR após tratamento com várias concentrações de PTX, TQD, PTLP e PD-PTLP livres por um período de incubação de 24 horas. c Análise de Western blot da expressão de p-gp em células SGC7901 / ADR após tratamento com as respectivas formulações. ** p <0,01 e *** p <0,001 é a diferença estatística entre o grupo tratado com PTX livre e PD-PTLP

O efeito citotóxico in vitro de fármacos individuais e combinacionais foi determinado pelo protocolo MTT após 24 horas de incubação. Conforme mostrado na Fig. 4b, o NP em branco não teve nenhum efeito sobre a viabilidade celular, descartando a possibilidade de qualquer interferência nos resultados finais. A monoterapia com PTX e TQD, entretanto, mostrou um efeito citotóxico dependente da concentração nas células cancerosas gástricas resistentes; ficou aquém de uma eficácia apreciável no tratamento. O efeito antiproliferativo do agente único foi notavelmente melhorado quando combinado com o segundo fármaco encapsulado em um nanolipossoma. A combinação de PTX e TQD resultou em efeito sinérgico óbvio em comparação com os medicamentos individuais isoladamente. Além disso, o nanolipossoma conjugado com mAb PD-L1 (PD-PTLP) exibiu o efeito antiproliferativo mais forte, indicando a influência do ligante de direcionamento na superfície das nanopartículas. Esta morte celular aumentada no grupo de tratamento direcionado a PD-L1 pode ser atribuída à alta internalização celular de nanolipossomas direcionados a PD-L1 por células SGC7901 / ADR consistente com a análise de absorção celular. O valor de IC50 de PD-PTLP foi de 0,76 μg / ml em comparação com 6,58 μg / ml e 7,64 μg / ml para PTX e TQD, respectivamente. Uma diminuição de dez vezes no valor de IC50 de PD-PTLP indica claramente que a resistência a PTX em p-gp que superexpressa SGC7901 / ADR foi revertida por TQD. Nossos resultados in vitro mostraram que o TQD foi eficaz em reverter a multirresistência em células SGC7901 / ADR. Os resultados também mostraram que os nanolipossomas retêm as ações farmacológicas dos fármacos encapsulados e liberam o fármaco de forma controlada nas células cancerosas. A terapia combinada com PTX e TQD aumentou a eficácia anticâncer com aumento da atividade sinérgica, superando as vantagens mínimas da monoterapia e possíveis efeitos colaterais associados. No geral, o tratamento combinado de PTX com um inibidor eficaz da p-gp no nanolipossoma pode ser uma estratégia promissora para superar a MDR e tratar o câncer gástrico.

A fim de avaliar o mecanismo molecular, a análise de Western blot foi realizada em SGC7901 / ADR. Como mostrado (Fig. 4c), PTX não teve nenhum efeito na expressão da proteína p-gp enquanto, pelo contrário, TQD regulou negativamente a expressão de p-gp, confirmando seu papel farmacológico como um inibidor de p-gp. Curiosamente, a combinação de PTLP e PD-PTLP à base de drogas mostrou uma diferença insignificante na expressão da proteína em comparação com as células cancerosas tratadas com TQD. O resultado demonstrou a vantagem de carregar PTX e TQD (inibidor de P-gp) juntos em um único sistema nanocarreador. O resultado do Western blot pode ser corroborado com os resultados de viabilidade celular, onde a combinação de PTX + TQD reverteu o MDR e exibiu maior eficácia anticâncer em células de câncer gástrico.

Análise de apoptose por citômetro de fluxo

A análise de apoptose da formulação individual foi avaliada pelo método de coloração com Anexina V-FITC / PI usando citômetro de fluxo. Os resultados da apoptose são apresentados na Fig. 5a. A mostrado, as células de controle não mostraram qualquer sinal de apoptose, enquanto PTX e TQD livres exibiram aumento óbvio nas células de apoptose. A combinação de PTLP à base de droga mostrou apoptose duas vezes maior em comparação com a de drogas individuais, indicando o efeito anticâncer sinérgico das formulações. Mais importante, PD-PTLP mostrou a maior apoptose de células cancerosas com cerca de 60% na região de apoptose. O efeito de apoptose aprimorado de PD-PTLP foi atribuído à maior internalização de nanocarreadores carregados com drogas duplas e potencial sinérgico de PTX e TQD de uma maneira raciométrica. O efeito de silenciamento da p-gp de TQD em regime combinacional aumentou o efeito anticâncer de PTX nas células cancerosas. A taxa de apoptose do fármaco individual estava na faixa entre 20 e 25%, enquanto cerca de 60% das células de apoptose foram observadas para células tratadas com PD-PTLP. O PD-PTLP induziu mais apoptose do que drogas livres e lipossomas não direcionados, sugerindo que o PD-L1 poderia entregar PTX / TQD de forma mais eficiente para induzir apoptose das células SGC7901 / ADR.

a Ensaio de apoptose de células SGC7901 / ADR após coloração com anexina V / PI combo usando citômetro de fluxo. As células foram tratadas com uma concentração fixa de 2 μg / ml. b Análise de espécies reativas de oxigênio (ROS) de células SGC7901 / ADR usando diacetato de 2,7-diclorofluorescina (DCFH-DA) como uma sonda. *** p <0,001 é a diferença estatística entre o grupo tratado com PTX livre e PD-PTLP

Determinação do nível de ROS intracelular

Exploramos a capacidade do medicamento individual e do medicamento duplo de afetar o estado redox das células cancerosas, avaliando o nível de espécies reativas de oxigênio (ROS) nas células cancerosas gástricas. Os níveis de ROS em células cancerosas foram avaliados por DCFH-DA (fluorescência verde). Os dados quantitativos de ROS são apresentados na Fig. 5b. Como mostrado, as células não tratadas não tinham nenhum sinal de ROS; no entanto, PTX ou TQD induziu níveis apreciáveis ​​de geração de ROS. É importante ressaltar que TPLP e PD-TPLP desencadearam níveis significativamente mais elevados de ROS em comparação com PTX livre ou TQD ou células de controle não tratadas. Um ROS notavelmente mais alto indica o potencial de PD-TPLP para promover uma apoptose mais alta. As imagens microscópicas corroboram com os resultados quantitativos com fluorescência verde mais brilhante e de maior intensidade em comparação com PTX livre ou não tratada ou células cancerosas tratadas com TQD. A maior intensidade de fluorescência verde é uma indicação de maior produção de ROS. O estresse oxidativo, como ROS, é considerado um importante indicador de citotoxicidade celular. Estudos demonstraram que a indução de ROS induz uma série de eventos fisiológicos, incluindo danos ao DNA, inflamação e apoptose celular.

A combinação de PTX e TQD inibiu o crescimento em tumores resistentes a medicamentos

Finalmente, a eficácia terapêutica e os parâmetros de toxicidade das formulações foram investigados no modelo de tumor de xenoenxerto SGC7901 / ADR resistente a drogas (Fig. 6a). Os medicamentos foram administrados por via intravenosa em dose fixa de 5 mg / kg a cada 3 dias, com um total de três injeções. O PTX / TQD foi administrado em uma fração de peso fixo de 1 / 0,5. Na linha esperada, PTX e TQD livres não apresentaram efeito inibitório sobre o crescimento de tumores MDR, sugerindo o fato de as células SGC7901 / ADR manifestarem tolerância ao fármaco na proliferação de tumores MDR. O inibidor de P-gp (TQD) embora eficiente na inibição das bombas de efluxo de drogas, não se converte em melhor resultado terapêutico. Em comparação, a combinação de PTX + TQD (PTLP) exibiu uma inibição significativa do crescimento de tumores resistentes a drogas. A melhor eficácia antitumoral foi observada com PD-PTLP que foi três vezes mais eficaz em comparação com o controle, 2,5 em comparação com medicamentos livres e aproximadamente duas vezes mais eficaz na redução da carga tumoral em comparação com formulações não direcionadas ( p <0,05; p <0,001). O volume final do tumor de controle, PTX livre, TQD, PTLP e PD-PTLP foi de aproximadamente 2.000 mm ³ , ~ 1650 mm ³ , 1625 mm ³ , ~ 1000 mm ³ e ~ 650 mm ³ , respectivamente. Os medicamentos gratuitos foram ligeiramente eficazes durante o ponto de tempo inicial; no entanto, eles cresceram igual ao do grupo de controle não tratado. Os resultados revelam claramente o potencial da combinação de inibidor de PTX + p-gp como uma estratégia única para controlar eficazmente a carga tumoral. A extensa supressão tumoral em PD-PTLP sugere claramente a maior eficácia antitumoral do grupo de formulações direcionadas. Os tumores foram extraídos e pesados; os pesos do tumor eram consistentes com os dados do volume do tumor (Fig. 6b). O grupo de camundongos tratados com PD-PTLP mostrou o menor tumor em comparação com qualquer outro grupo tratado com formulação ( p <0,001). Para verificar ainda mais o efeito inibidor de tumores individuais, os tumores foram submetidos ao ensaio TUNEL (Fig. 6c). Como mostrado, PD-PTLP mostrou grandes faixas de coloração de apoptose em comparação com controle não tratado ou drogas livres. PD-PTLP mostrou traços de apoptose aparentes com arranjos celulares desorganizados. O proeminente efeito de morte do tumor de PD-PTLP exibe a maior inibição de células cancerosas em células tumorais resistentes a drogas. A excelente eficácia de PD-PTLP foi atribuída principalmente à presença de ligante direcionado (PD-L1 mAb) que se liga aos respectivos receptores e aumenta as concentrações intracelulares. A presença de regime de combinação e liberação de forma controlada por tempo prolongado também contribuiu para sua eficácia aumentada. Além disso, a coroa de superfície de PEG hidrofílico densa pode oferecer excelente estabilidade física às partículas e pode potencialmente evitar a absorção de proteína desnecessária e evitar a eliminação rápida. A longa circulação e o tamanho nanoescalado, por sua vez, beneficiam o maior acúmulo de partículas nos tecidos tumorais [31,32,33].

Eficácia antitumoral in vivo de diferentes formulações contra tumores SGC7901 / ADR multirresistentes (MDR); a volume do tumor, b análise de peso do tumor e c Ensaio TUNEL de tecidos tumorais. Os camundongos foram administrados com uma dose fixa de 5 mg / kg com duração de três vezes para três administrações. Os poços das células apoptóticas foram avaliados pelo ensaio TUNEL. * p <0,05 e ** p <0,05 (PTLP vs. PD-PTLP), *** p Grupo tratado <0,001 (PTX vs. PD-PTLP).

Análise de toxicidade sistêmica

A mudança no peso corporal é um bom indicador de toxicidade sistêmica. Como mostrado (Fig. 7a), os camundongos tratados com PTX livre perderam ~ 20% do peso corporal no dia 10, o que diminuiu gradualmente para recuperar o peso corporal original no final do estudo. A perda de mais de 5% do peso corporal é considerada causa grave de toxicidade interna e 20% da perda de peso corporal é considerada um efeito adverso significativo dos medicamentos gratuitos [31]. Pelo contrário, PTLP ou PD-PTLP não causou qualquer perda de corpo e os camundongos permaneceram saudáveis ​​durante todo o período de estudo, indicando o índice de segurança dos nanolipossomas. O sistema de entrega sem toxicidade sistêmica e eficácia antitumoral aumentada é considerado altamente eficaz no tratamento de tumor. A segurança das nanopartículas foi estudada posteriormente através da medição dos níveis plasmáticos de enzimas. Os níveis plasmáticos de aminotransferases (AST e ALT) são medidos após a administração de 24 horas das respectivas formulações (Fig. 7b, c). Conforme mostrado, PTX livre resultou em aumento significativo ( p <0,01) nos níveis de AST e ALT enquanto PD-PTLP e PTLP foram insignificantemente diferentes em comparação com o controle não tratado. A AST é liberada no soro mediante lesão de órgãos, como coração, rim ou fígado, enquanto a ALT é especificamente liberada em caso de lesão hepática [34]. Os níveis de AST e ALT servem como um indicador específico de lesão de órgãos e, nesse aspecto, o PD-PTLP mostrou-se um portador seguro.

Análise de toxicidade sistêmica de formulações individuais em tumores SGC7901 / ADR; a análise de peso corporal de camundongos; b , c avaliação bioquímica sanguínea dos níveis séricos de AST e ALT como parâmetros de toxicidade sistêmica. * p <0,05 e ** p <0,01 é a diferença estatística entre o grupo tratado com PTX livre e PD-PTLP

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados gerados ou analisados ​​durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e seus arquivos de informações complementares.

Abreviações

EPR:

Maior permeação e efeito de retenção

PD-PTLP:

PTX conjugado com mAb PD-L1 e nanolipossomas carregados com TQD

P-gp:

Glicoproteína P

PTLP:

PTX e nanolipossomas carregados com TQD

PTX:

Paclitaxel

TQD:

Tariquidar

Biossensores de glicose sem enzimas baseados em nanocompósitos MoS2 Um modulador delta-Sigma de intervalo dinâmico de 80 dB com largura de banda de 100 Mhz e taxa de clock de 2,4 Ghz