Avaliação da eficiência de captação celular de acordo com vários inibidores de nanopartículas de Fe3O4-Au Core-Shell:possibilidade de controlar a endocitose específica em células cancerosas colorretais

Resumo

Magnetita (Fe ₃ O ₄ nanopartículas de núcleo-casca (NPs) de ouro (Au) têm propriedades magnéticas e ópticas únicas. Quando combinados com frações biológicas, esses NPs podem oferecer novas estratégias para aplicações biomédicas, como entrega de drogas e direcionamento de câncer. Aqui, apresentamos um método eficaz para a absorção celular controlável de sistemas NP núcleo-casca magnéticos combinados com frações biológicas. A vimentina, que é a proteína estrutural, foi bioquimicamente confirmada por afetar a fagocitose de forma potente. Além disso, a vimentina afeta a internalização de materiais exogênicos nas células, embora sob inibições múltiplas de porções biológicas. Neste estudo, demonstramos o desempenho de internalização celular de Fe ₃ O ₄ -Au núcleo-shell NPs com modificação de superfície usando uma combinação de porções biológicas. A fotofluorescência de NPs marcados com vimentina permaneceu inalterada em vários testes de inibição, indicando que os NPs foram minimamente influenciados por nistatina, dinassoro, citocalasina D e até mesmo o anticorpo Muc1 (Ab). Consequentemente, este resultado indica que o Muc1 Ab pode ter como alvo moléculas específicas e pode controlar a endocitose específica. Além disso, mostramos a possibilidade de controlar a endocitose específica em células de câncer colorretal.

Introdução

Os nanomateriais abriram novos caminhos para diagnósticos clínicos e terapêuticos. Especialmente, as nanopartículas (NPs) são uma das ferramentas mais importantes e têm sido usadas em aplicações como biossensores [1, 2], diagnósticos [3, 4] e sistemas de entrega de drogas direcionados [5, 6]. Para aplicações biomédicas, NPs geralmente compostos de materiais orgânicos ao redor da superfície dos materiais do núcleo [7,8,9]. Os materiais do núcleo, que consistem em materiais magnéticos, materiais semicondutores ou outros tipos de materiais, têm propriedades físico-químicas úteis e a superfície orgânica externa fornece estabilidade química e funcionalidade aos NPs. Para aplicações em sistemas de direcionamento biológico, não apenas as propriedades físico-químicas, mas também a superfície orgânica externa, que são biofuncionalizadas para direcionamento, são parâmetros críticos. Exemplos de frações de direcionamento para funcionalização são anticorpos ou ligantes que são específicos para um alvo. Dependendo dos materiais biofuncionalizados na superfície externa, os mecanismos de endocitose dos NPs são determinados. O mecanismo que permite que os NPs entrem nas células tem sido o assunto de muitos trabalhos de pesquisa recentes devido à sua importância nas aplicações da nanomedicina [10,11,12,13,14,15].

Em particular, NPs magnéticos têm sido amplamente utilizados em muitas aplicações específicas de direcionamento de sites, incluindo classificação de células [16, 17], MRI [18], isolamento de DNA [19], distribuição de drogas [20], tratamento de hipertermia [21] e câncer segmentação [22]. Entre vários NPs magnéticos, os nanocristais de magnetita têm sido mais amplamente usados em aplicações biomédicas devido à sua biocompatibilidade e estabilidade química. Embora muitos esforços tenham sido dedicados a aplicações biomédicas usando NPs magnéticos, ainda existem alguns problemas críticos, como boa dispersibilidade em solução aquosa, funcionalidade e biocompatibilidade. Para superar esses problemas, muitos estudos se concentraram na modificação da superfície de NPs usando uma variedade de grupos funcionais (por exemplo, grupos carboxila e amina) [23]. No entanto, a fixação dos grupos funcionais à superfície de NPs de magnetita é um processo demorado e trabalhoso. Dado este fato, NPs magnéticos revestidos com Au do tipo núcleo-casca são atraentes porque a superfície de Au pode se ligar facilmente a biomoléculas e materiais orgânicos.

Especialmente, as propriedades magnéticas dos NPs de núcleo magnético-Au shell permitem a separação magnética, aumentam a resolução em imagens de ressonância magnética e podem ser aplicadas à terapia de hipertermia. Além disso, as propriedades de ligação química superiores do ouro são vantajosas para a construção de sistemas de entrega mediada por receptor para o direcionamento específico do câncer [24,25,26].

Nas últimas décadas, muitos pesquisadores relataram sistemas de entrega mediada por receptor para o direcionamento do câncer [27,28,29].

O direcionamento de células cancerosas mediado por receptor é uma forma de direcionamento ativo. A escolha do alvo é a chave para um direcionamento ativo eficaz, e os alvos devem ser superexpressos na membrana extracelular. A maioria dos pesquisadores tem usado anticorpos monoclonais para o tratamento do câncer, e o efeito terapêutico pode ser muito aumentado quando as terapias com anticorpos monoclonais são combinadas com a quimioterapia convencional [30]. Apesar do sucesso da terapia com anticorpos monoclonais, os anticorpos monoclonais apresentam várias limitações no direcionamento do câncer. Seu grande tamanho (aproximadamente 150 kDa) é um grande obstáculo para a penetração do tumor [31, 32], e sua baixa estabilidade e baixa solubilidade impedem seu uso generalizado [33]. A direção não homogênea de sua fixação no portador de direcionamento também é considerada um obstáculo à ligação não específica. Para produzir anticorpos com penetração tumoral melhorada, uma ampla gama de formatos de anticorpos foi projetada e testada [34]. Além dos anticorpos clássicos, um formato de anticorpo único está presente em espécies da família Camelidae. Os chamados anticorpos de cadeia pesada (HCAbs) ocorrem naturalmente no sangue periférico e no leite dessas espécies. Os fragmentos de ligação ao antígeno de tais HCAbs são compostos por um único domínio, o domínio variável da cadeia pesada (VH) do camelídeo HCAb (VHH). O VHH, obtido de forma recombinante após clonagem e expressão em bactérias ou fungos, é denominado nanocorpo. Ele tem um peso molecular de 11-15 kDa e é o menor anticorpo entre todos os mAbs [35,36,37]. Não apenas seu pequeno tamanho os torna potencialmente adequados como sondas de direcionamento contra antígenos em locais isolados, mas também sua extremidade terminal facilmente modificável é atraente para aplicação no direcionamento de câncer.

A entrega eficiente de NPs com direcionamento adequado e internalização de células também são fatores importantes no sistema de entrega. Foi relatado que a vimentina desempenha um papel importante como um componente da ligação do patógeno e das vias de entrada intracelulares. O silenciamento da expressão do gene da vimentina inibe a fagocitose [38], enquanto a vimentina clivada é um sinal que aumenta significativamente a fagocitose [39]. Portanto, a neutralização da resistência à fagocitose celular causada pela vimentina na superfície da célula é importante para a entrega eficiente de nanopartículas.

Neste estudo, investigamos as vias de endocitose de Fe ₃ marcado com nanocorpo O ₄ -Au núcleo-shell NPs modificados com espaçadores PEG (polietilenoglicol) com comprimentos diferentes. Vimentin, que é conhecido por ter um forte efeito na fagocitose por experimentos bioquímicos [39], foi comparado como um controle, e foi confirmado que atua efetivamente na internalização celular de NPs. Além disso, o Muc1, que é uma glicoproteína de superfície celular e superexpressa em vários tipos de câncer, como o de pâncreas, mama, pulmão e estômago, é utilizado como um biomarcador direcionado ao câncer. Confirmamos a internalização eficiente de Fe ₃ O ₄ NPs de núcleo-casca de Au e os métodos de direcionamento controlável para células cancerosas por meio da via de endocitose mediada pelo receptor Muc1 em células do cólon.

Materiais e métodos

Materiais

O acetato de ouro (III) (Au (OOCCH3) 3, 99,9%) foi obtido na Alfa Aesar. Outros produtos químicos, incluindo acetilacetonato de ferro (III) (Fe (acac) ₃ , 99,9%), 1,2-hexadecanodiol (C14H29CH (OH) CH2 (OH), 90%), poli (etilenoglicol) -bloco-poli (propilenoglicol) -bloco-poli (etilenoglicol) (PEG-PPG- PEG) e éter octil (C8H17OC8H17, 99%) foram adquiridos da Sigma-Aldrich e usados como recebidos. O poli (etilenoglicol) do éster alfa-piridil-2-dissulfeto-ômega-carboxi succinimidílico (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K e 10K) foi adquirido na Nanocs. Bicarbonato de sódio, WST-1, clorpromazina, nistatina, citocalasina D, dinassoro, brefeldina A (BFA), monensina e azul de tripano foram adquiridos na Sigma-Aldrich. Cy3 e Cy7.5 foram adquiridos da Lumiprobe. O Ab anti-Muc1 foi adquirido da Abcam Inc. (Cambridge, MA). Solução salina tamponada com fosfato (PBS), meio de Eagle modificado por Dulbecco e soro bovino fetal foram adquiridos da Invitrogen Corp.

Síntese de Fe ₃ O ₄ -Au Core-Shell NPs

The Fe ₃ O ₄ -Au core-shell NPs foram sintetizados por meio de um método de nanoemulsão. O processo sintético para NPs core-shell consiste em duas etapas:(1) formação do Fe ₃ O ₄ NPs do núcleo e (2) revestimento da camada de Au nas NPs magnéticas. Na primeira etapa, o Fe ₃ O ₄ NPs foram preparados a partir de uma solução mista de Fe (acac) ₃ (0,1766 g ou 0,5 mmol), 1,2-hexadecandiol (0,6468 g ou 2,5 mmol) e copolímero de bloco (poli (óxido de etileno) -poli (óxido de propileno) -poli (óxido de etileno); PEO-PPO-PEO) ( 0,4 ~ 1,2 g) em éter octil. A solução misturada foi aquecida a 300 ° C para reduzir o precursor de Fe. A formação de Fe ₃ O ₄ Núcleos NPs foram concluídos por resfriamento da solução aquecida. O segundo processo foi conduzido continuamente sem qualquer processo de purificação após a formação do núcleo magnético. Precursores de Au (0,2338 g ou 0,62 mmol) e 1,2-hexadecandiol (0,88 g, 3,4 mmol) foram adicionados à emulsão que consiste em Fe ₃ O ₄ NPs e, em seguida, a solução misturada foi aquecida a 230 ° C. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a emulsão foi precipitada por centrifugação e os NPs núcleo-casca foram separados.

Construção do vetor de expressão recombinante anti-Muc1-VHH 5-24 K10

A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada usando o iniciador direto 5′-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3 ′ e o iniciador reverso 5′-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3 ′. O produto de PCR foi digerido com EcoRI e XhoI e purificado em gel usando o kit QIA quick Gel Extraction (QIAGEN, Valencia, CA, EUA). O produto de PCR purificado foi clonado em pET-23a digerido com EcoRI / XhoI (Novagen, Darmstadt, Alemanha). Escherichia coli ( E. coli ) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) foi transformado com o construto resultante por choque térmico e selecionado em placas de ágar LB contendo 100 μg / mL de ampicilina (Duchefa Biochemie, Haarlem, Holanda).

Expressão e purificação da proteína recombinante

Para expressar e purificar a proteína recombinante anti-Muc1-VHH 5-24 K10, E. coli As cepas BL21 (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) foram transformadas com pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. As bactérias foram então cultivadas em caldo LB contendo ampicilina (100 μg / mL). A expressão da proteína foi induzida por isopropil β-d-tiogalactosídeo (IPTG) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Holanda) a uma concentração final de 0,4 mM por 5 h a 37 ° C. Pelotas bacterianas foram ressuspensas em tampão de lise (50 mM NaH ₂ PO ₄ , pH 8,0; NaCl 300 mM) seguido de sonicação em gelo durante 10 min. Os lisados sonicados foram centrifugados a 20.000 × g por 20 min a 4 ° C e submetido a resina Ni-NTA His · Bind (Peptron, Daejeon, Coréia). Proteínas marcadas com His que foram ligadas à resina foram eluídas com tampão de eluição (50 mM NaH ₂ PO ₄ , pH 8,0; NaCl 300 mM; Imidazol 150 mM). A proteína purificada foi separada em gel de SDS-PAGE a 15%.

Modificação do Core-Shell Fe ₃ O ₄ -Au NPs

OPSS-PEG-NHS em vários comprimentos (2, 5 e 10 K) foi dissolvido em bicarbonato de sódio 0,1 M para ativação dos grupos tiol. O OPSS-PEG-NHS ativado foi adicionado à solução de núcleo-shell sintetizado Fe ₃ O ₄ -Au NPs e agitado durante 12 h a 4 ° C. Os grupos tiol de OPSS-PEG-NHS ativado foram covalentemente ligados à superfície Au dos NPs núcleo-casca. Em seguida, uma solução de nanocorpo (0,25 mg / mL) foi adicionada ao Fe PEGuilado ₃ O ₄ -Au core-shell NPs por 12 h a 4 ° C. Os grupos amina das dez caudas de lisina (K) no terminal foram covalentemente ligados aos grupos NHS de OPSS-PEG-NHS a pH 8,3. Cy3 e Cy7.5 foram marcados com os grupos de amina residual do nanocorpo.

Curva de internalização

As células CT26 foram semeadas em 5 × 10 ³ células por poço em uma placa de 96 poços de fundo transparente e incubadas em 250 μL de meio de cultura por 24 h a 37 ° C em 5% de CO ₂ no escuro. O meio foi removido e 250 μL de meio de cultura fresco contendo 50 μg / mL de Fe marcado com Cy3 ₃ O ₄ NPs -Au e NPs marcados com PEG-Cy3 ou PEG-nanocorpo-Cy3 foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas adicionalmente por diferentes períodos (0, 10, 20, 30, 60, 120 e 360 min). As células foram então lavadas três vezes com PBS para remover NPs livres, e a fluorescência de cada poço foi medida com azul de tripano como um inibidor de fluorescência impermeável à membrana por SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, EUA). Cada experimento foi realizado com quantidades iguais de NPs (50 μg / mL) e repetido três vezes [40].

Teste de Inibição

As células CT26 foram semeadas em 5 × 10 ³ células por poço em uma placa de 96 poços de fundo transparente e incubadas em 250 μL de meio por 24 h a 37 ° C em 5% de CO ₂ no escuro. O meio foi removido e 250 μL de meio de cultura fresco contendo 20 μg / mL de clorpromazina (CPZ), 50 μg / mL de nistatina, 20 μg / mL de citocalasina D, 25 μg / mL de dinassoro, 20 μg / mL de BFA, 140 μg / mL de monensina ou 5 μM de Ab anti-Muc1 foram adicionados e as células foram incubadas por 1 h.

O meio foi removido novamente e 250 μL de meio de cultura contendo 50 μg / mL de Fe marcado com Cy3 ₃ O ₄ -Au NPs, NPs marcados com PEG-Cy3, NPs marcados com PEG-nanocorpo-Cy3 ou NPs marcados com vimentina-Cy3 foram adicionados.

Após 1 h a 37 ° C e 5% CO ₂ , as células foram lavadas três vezes com PBS para remover NPs livres e a fluorescência foi medida com azul de tripano como um inibidor de fluorescência impermeável à membrana por SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, EUA). Cada experimento foi realizado com quantidades iguais de NPs (50 μg / mL) e repetido quatro vezes.

Resultados e discussão

Os NPs core-shell foram sintetizados por um método publicado [16, 17]. As observações de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) na Fig. 1a, b mostram que o Fe ₃ O ₄ -Au core-shell NPs eram esféricos com um diâmetro médio de 13,5 nm e distribuição de tamanho estreita.

O aumento de ~ 8,5 nm do núcleo NP (Fe ₃ O ₄ ) decorre do revestimento de camada de Au de ~ 2,5 nm de espessura na superfície do núcleo, resultando em uma camada de núcleo NP. Uma imagem TEM de alta resolução com a análise de transformação rápida de Fourier (FFT) do Fe ₃ O ₄ -Au core-shell NP está incluído nas Informações Suplementares Fig. S1.

O produto fabricado em solvente orgânico foi purificado por separação magnética e transferido para a água.

Os NPs de núcleo-casca estavam bem dispersos e estáveis em água sem qualquer modificação de superfície, devido aos copolímeros de blocos residuais que estavam presentes nos NPs.

As Figuras 1c ed mostram os NPs em solução aquosa antes e depois da aplicação de um campo magnético externo. Sob um campo magnético externo, o núcleo-casca NPs mudou rapidamente de uma dispersão homogênea (Fig. 1c) para uma solução límpida e transparente (Fig. 1d).

A banda de absorção dos NPs núcleo-casca foi investigada usando espectrometria UV-Vis. Como mostrado na Fig. 1e, um pico de absorbância apareceu em ~ 530 nm, indicando a presença de Au na superfície dos NPs (Informações Suplementares A Fig. S2 inclui o resultado dos dados de EDX para Fe ₃ O ₄ -Au core-shell NPs). Como a amostra foi purificada, os resultados ópticos demonstraram a formação da estrutura núcleo-casca.

Os loops de histerese magnética foram obtidos a partir de medições de amostras vibratórias para investigar as propriedades magnéticas do Fe ₃ O ₄ núcleo e os NPs do núcleo-shell. Ambos os NPs mostraram comportamento superparamagnético com uma coercividade próxima de 0 Oe em temperatura ambiente (Fig. 1f).

Conforme relatado em trabalhos anteriores, a suscetibilidade de NPs de núcleo-casca foi maior do que a de NPs de magnetita, o que pode ser parcialmente devido a efeitos de proximidade e configurações espaciais únicas [41, 42]. Além disso, as magnetizações de saturação do núcleo NPs e do núcleo-shell NPs são ~ 37 emu / ge ~ 21 emu / g a 10 kOe, respectivamente. A diferença no Ms decorre da existência de um componente não magnético (Au) nas NPs do núcleo-casca.

O gene VHH 5-24 K10 foi clonado in-frame para produzir pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 após amplificação por PCR (Fig. 2a). A proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21 que foi transformado com pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 após indução com IPTG e purificado por resina Ni-NTA His · Bind. O anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinante foi prontamente expresso em E. coli como uma proteína solúvel de 18 kDa. A partir de uma cultura de 1 L, obtivemos 1 ± 0,5 mg de anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinante purificado.

A proteína purificada foi verificada por gel de SDS-PAGE 15%. A coloração com azul de Coomassie da proteína purificada revelou que ela era> 95% pura (Fig. 2b). O Fe sintetizado ₃ O ₄ -Au NPs foram modificados em três etapas, nomeadamente PEGylation, marcação de anticorpo e marcação de corante (Fig. 2c). Após cada etapa de modificação, o potencial zeta foi medido para confirmar o sucesso da modificação. A Tabela 1 mostra o efeito da modificação nos potenciais zeta correspondentes. O potencial zeta de NPs de casca nua era - 19,8 ± 6,68 mV. A PEGilação de NPs foi realizada usando OPSS-PEG-NHS. Para produzir uma série de nanocomplexos com diferentes tamanhos, OPSS-PEG-NHS com vários comprimentos (2 K, 5 K e 10 K) foi usado.

Após a PEGuilação, os potenciais zeta foram reduzidos (- 44,9 ± 8,19 mV, - 40,7 ± 7,88 mV e - 39,6 ± 8,74 mV para 2 K, 5 K e 10 K, respectivamente).

Curiosamente, após a marcação de nanocorpo, os potenciais zeta aumentaram claramente (- 38,5 ± 5,61 mV, - 23,3 ± 8,61 mV e - 31,8 ± 7,37 mV para 2 K, 5 K e 10 K, respectivamente).

Após a marcação com corante, os potenciais zeta também aumentaram (- 12,5 ± 7,25 mV, - 17,7 ± 3,94 mV e - 10,6 ± 4,72 mV para 2, 5 e 10 K, respectivamente).

O potencial zeta do puro Fe ₃ O ₄ -Au core-shell NPs era - 19,8 ± 6,68 mV. Após a PEGuilação, o potencial zeta foi reduzido para perto de - 40 mV. Estes resultados indicam que as moléculas de PEG estavam bem ligadas covalentemente à camada de Au dos NPs da camada do núcleo porque as moléculas de PEG têm grupos funcionais N-hidroxisuccinimida carregados negativamente. Enquanto isso, o potencial zeta aumentou após marcação de corante para o nanocorpo (-38,5 ± 5,61 mV para nanocorpo NP-PEG2 K e - 12,5 ± 7,25 mV para nanocorpo NP-PEG2 K-corante). Este resultado é razoável porque o nanocorpo recombinante tem dez caudas de lisina na extremidade terminal. Cada tipo de nanocorpo foi categorizado pela medição do potencial zeta e, para determinar a ligação do anticorpo no nanocorpo, medimos a fluorescência para cada tipo de nanocorpo.

Como mostrado na Fig. 3, confirmamos que todos os tipos de nanopartículas e nanocorpos têm bem absorção e internalização celular na ausência de restrições de inibidor. Uma curva de internalização celular foi obtida a partir de células incubadas na presença de Fe ₃ marcado com Cy3 50 μg / mL O ₄ NPs -Au, NPs marcados com PEG-Cy3 e NPs marcados com PEG-nanocorpo Cy3 por diferentes períodos (entre 0 e 360 min) após a remoção da mídia, lavagem de NPs livres e, finalmente, medição da fluorescência total das células com tripano azul (Fig. 3).

De acordo com o resultado da medição da intensidade de fluorescência, podemos determinar que os NPs foram internalizados nas células em 1 h (Fig. 3a). A intensidade de fluorescência de NP atingiu um máximo em 1 h, e a intensidade de fluorescência diminuiu gradualmente após atingir um estado estacionário. Mesmo que haja uma ligeira diferença de tempo dependendo da presença de Ab, a intensidade de fluorescência por tempo de cultivo não foi significativamente diferente do resultado de NPs nus (Fig. 3b). Como mostrado na Fig. 3c, foi confirmado que o efeito do Ab, usando Ab heterogêneo de Muc1 e vimentina, foi desprezível na captação celular e internalização de NP.

Com o ensaio WST-1, a viabilidade (%) de células de mucina CT26 dependendo da concentração e modificação da superfície de Fe ₃ O ₄ NPs de núcleo-shell -Au foram estimados após vários tempos de exposição (Fig. 4a, b). A viabilidade das células CT26 não apresentou diferenças significativas após 24 he 48 h de exposição, seja com doses variáveis ou após modificação da superfície das NPs. A viabilidade celular era superior a 90% em Fe ₃ puro O ₄ -Au NPs (Fig. 4a) e os NPs de superfície modificada (Fig. 4b).

A Figura 5 indica que os NPs entraram nas células da mucina CT26 através de várias vias de endocitose (mediada por clatrina, mediada por caveolae e vias de fagocitose / macropinocitose). Curiosamente, a Fig. 5b mostra que o Ab anti-Muc1 também afetou principalmente a endocitose de NPs marcados com PEG-nanocorpo-Cy3. Para compreender a via de internalização de NP, tentamos inibir as vias de endocitose com inibidores químicos específicos (Fig. 5). As vias de endocitose eram bem conhecidas por serem divididas em três tipos:mediada por clatrina, mediada por caveolae e macropinocitose / fagocitose.

Neste estudo, os inibidores foram usados como uma primeira abordagem para investigar a internalização de NPs marcados com nanocorpo. CPZ (inibidor de endocitose mediada por clatrina), nistatina (inibidor de endocitose mediada por caveolae), dinassoro (inibidor de dinamina), citocalasina D (inibidor de fagocitose / macropinocitose), BFA (destruidor de aparelho de Golgi), monensina (inibidor de lisossoma), ou anti-Muc1 Ab (competidor específico de receptor / transportador) foram incubados com células por 1 h. CPZ, nistatina, dinassoro e citocalasina D afetaram a endocitose de NPs (Fig. 5a).

A porção de direcionamento é a chave para o sucesso do direcionamento do câncer, que é excepcionalmente importante na terapia do câncer. Para o direcionamento, a modificação de superfície eficaz é muito importante para aumentar a eficiência terapêutica e limitar os efeitos colaterais. Fe ₃ marcado com nanocorpo O ₄ -Au core-shell NPs foram feitos com sucesso a partir de NPs sintetizados e nanocorpo recombinante. A Tabela 1 mostra claramente que cada etapa de modificação foi realizada com sucesso.

A viabilidade celular é um dos elementos essenciais para a aplicação biológica de nanomateriais. As viabilidades das células eram maiores do que 90% nos NPs de casca nua e NPs modificados (Fig. 4a, b). Esses resultados implicam que Fe ₃ simples O ₄ -Au NPs e NPs modificados não causaram citotoxicidade dependente de concentração e modificação significativa e que os NPs modificados eram adequados para aplicação biológica.

Os estudos da eficiência de internalização e do efeito inibidor dos NPs fornecem informações importantes para entender os mecanismos pelos quais os NPs entram nas células. NPs PEGuilados foram internalizados relativamente lentamente nas células em comparação com NPs nus, mas NPs marcados com nanocorpo foram internalizados em células ligeiramente mais rápido do que NPs nus (Fig. 3a, b). Como a PEGuilação é um método de modificação de superfície bem conhecido para prevenir a internalização de NPs, a tendência de internalização de NPs PEGuilados é facilmente explicada. Além disso, o nanocorpo induziu a endocitose de NPs. Para verificar a especificidade do nanocorpo, confirmamos a taxa de internalização de NPs marcados com vimentina Ab. Curiosamente, os NPs marcados com vimentina Ab não promoveram a internalização celular (Fig. 3c).

Esses resultados indicam que o nanocorpo pode efetivamente induzir a internalização de nanomateriais em células mucinas CT26 e implica que a tendência de internalização pode ser controlada com modificação específica da membrana externa dos NPs. Além disso, os mecanismos de endocitose de NPs marcados com nanocorpo foram claramente mostrados por meio de testes de inibição e imagens de microscopia confocal. A fotofluorescência de ambos os NPs marcados com nanocorpo e os NPs não marcados mostraram valores decrescentes semelhantes quando cultivados com CPZ, nistatina ou dinassoro (Fig. 5a, b). CPZ, nistatina e dinassoro desempenham um papel na inibição, respectivamente, da endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por caveolae e dinamina, que é uma grande GTPase implicada no brotamento e cisão de vesículas nascentes das membranas parentais. Desse modo, os valores de fotofluorescência em ambos os casos diminuíram rapidamente porque a dinamina está intimamente relacionada à produção de vesículas para endocitose mediada por clatrina e caveolae. Como mostrado na Fig. 5a, ambos não marcados (Fig. 5a) e NPs marcados com nanocorpo (Fig. 5b) mostraram diminuições rápidas na fotofluorescência.

Em particular, os NPs marcados com nanocorpo exibiram valores de fotofluorescência significativamente mais baixos em CPZ, nistatina e dinassoro. Além disso, confirmamos que os NPs não marcados foram mais fortemente afetados do que os NPs marcados por nanocorpo quando aplicados à citocalasina D, que é uma toxina permeável às células que bloqueia a polimerização dos filamentos de actina para fagocitose [43]. Esses resultados implicam que NPs não marcados foram internalizados por meio de vários mecanismos, como endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por caveolae e fagocitose. Consequentemente, a internalização celular de NPs marcados com nanocorpo depende da endocitose mediada por clatrina e caveolae. Além disso, a quantidade de captação celular de NPs marcados com nanocorpo foi reduzida consideravelmente quando as células foram cultivadas com o anticorpo Muc1 (Fig. 5b). Este resultado indica que o anticorpo Muc1 livre desempenha um papel como um competidor do nanocorpo nos NPs modificados na ligação à membrana da célula CT26 e que o anticorpo Muc1 desempenha um papel importante na internalização celular dos NPs modificados. Curiosamente, NPs marcados com vimentina Ab mostraram diferenças óbvias em comparação com NPs marcados com nanocorpo em termos de capacidade de inibição. A fotofluorescência de NPs marcados com vimentina permaneceu inalterada sob vários testes de inibição, indicando que os NPs foram minimamente influenciados por nistatina, dinassoro, citocalasina D e até mesmo Muc1 Ab. Este fenômeno pode ser evidência da eficácia da vimentina, que foi bioquimicamente confirmada por afetar potentemente a fagocitose [39]. Consequentemente, este resultado indica que o Muc1 Ab pode ter como alvo moléculas específicas e pode controlar a endocitose específica.

Como mostrado na Fig. 6, resultados análogos foram obtidos quando as células foram tratadas com NPs de núcleo vazio marcados com Cy7.5 e NPs marcados com PEG-nanocorpo, indicando absorção celular semelhante em ambos os casos na ausência de inibição do dinassoro. A inibição do Dynasore induziu internalização celular distintamente inferior dos NPs marcados com nanocorpo de PEG em comparação com NPs nus (Fig. 6b, linha inferior). Estes resultados implicam que existem dois mecanismos de endocitose, que são endocitose não específica de NPs nus e endocitose restrita de NPs marcados com nanocorpo através da molécula de dinamina. Uma vez que o nanocorpo se liga à membrana celular externa, os NPs marcados com nanocorpo poderiam facilmente passar através da membrana celular devido à ativação simultânea dos mecanismos mediados por clatrina e caveola. Consequentemente, poderíamos supor que os principais mecanismos são a endocitose mediada por clatrina e caveola para a internalização de NPs marcados com nanocorpo em células de mucina CT26.

Conclusões

Nanomateriais para direcionamento ao câncer e inserção controlável de materiais exogênicos, como drogas, genes e peptídeos, são avanços críticos em aplicações biomédicas. Esses conceitos familiares, mas criativos, podem oferecer estratégias para novos métodos terapêuticos. Neste artigo, demonstramos absorção celular aprimorada de Fe ₃ O ₄ -Au núcleo-shell NPs após PEGylation com o anticorpo Muc1. Os principais mecanismos de endocitose de NPs marcados com nanocorpo foram demonstrados, mostrando a possibilidade de endocitose específica controlável em células de câncer colorretal. Essas descobertas fornecem informações sobre o direcionamento entre NPs marcados com nanocorpo e células de câncer colorretal para auxiliar no projeto de transportadores de direcionamento de alta eficiência.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.

Abreviações

Fe ₃ O ₄ :: Magnetita
Au:: Ouro
NPs:: Nanopartículas
Ab:: Anticorpo
HCAbs:: Anticorpos de cadeia pesada
VHH:: VH do camelídeo HCAb
PEG:: Polietileno glicol)
PPG:: Poli (propilenoglicol)
PCR:: Reação em cadeia da polimerase
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
PEO-PPO-PEO:: Poli (óxido de etileno) -poli (óxido de propileno) -poli (óxido de etileno)
OPSS-PEG-NHS:: Ortopiridil dissulfeto PDP PEG succinimidil éster
BFA:: Brefeldin A
CPZ:: Clorpromazina