Biossensor de metamaterial terahertz totalmente metálico para detecção de proteínas

Resumo

Neste artigo, um biossensor terahertz (THz) baseado em metamaterial totalmente metálico é investigado teoricamente e verificado experimentalmente. Este biossensor de metamaterial THz usa materiais de aço inoxidável que são fabricados por meio de tecnologia de perfuração a laser. Os resultados da simulação mostram que a sensibilidade máxima do índice de refração e a figura de mérito deste sensor de metamaterial são 294,95 GHz / RIU e 4,03, respectivamente. Em seguida, albumina de soro bovino foi escolhida como a substância de detecção para avaliar a eficácia deste biossensor. Os resultados do experimento mostram que a sensibilidade de detecção é 72,81 GHz / (ng / mm ² ) e o limite de detecção é 0,035 mg / mL. Este biossensor de metamaterial THz é simples, econômico, fácil de fabricar e tem grande potencial em várias aplicações de biossensor.

Introdução

Hoje em dia, os médicos costumam coletar soro de pacientes hospitalizados para vários exames. Tal como detecção de tumor [1,2,3] e detecção de vírus [4,5,6] etc. O método preliminar para detecção de tumor é a detecção de proteína, porque as proteínas são os componentes de muitos marcadores tumorais, e essas biomoléculas com muitos existem informações no soro. As albuminas séricas são as proteínas da fração hidrossolúvel total mais abundantes (52-62%) no plasma sanguíneo [7, 8]. Além disso, as funções nutricionais e fisiológicas das albuminas séricas as tornam bio-macromoléculas essenciais. Como uma das albuminas de soro mais populares, a albumina de soro bovino (BSA) é usada em muitos campos de pesquisa. Portanto, a pesquisa sobre a detecção de BSA é bastante importante. Existem muitos métodos para detectar e determinar a concentração de BSA, incluindo espectroscopia de impedância eletroquímica [9], eletroforese capilar [10] e técnicas de espalhamento de luz [11]. Mas todos eles têm algumas desvantagens, como procedimentos complicados, reprodutibilidade pobre ou demorados. Portanto, o desenvolvimento de novos biossensores é de considerável importância e bastante procurado.

A onda THz está entre a onda óptica de microondas e infravermelho e na região de transição da eletrônica para a fotônica. Em comparação com as ondas de luz, a energia dos fótons nesta banda é muito baixa. Isso significa que as ondas terahertz não causarão danos à ionização por radiação em moléculas biológicas. Muitas macromoléculas biológicas também têm impressões digitais únicas na banda terahertz [12,13,14,15]. Portanto, as ondas terahertz têm recebido considerável atenção no campo do biossensorio [16, 17].

Metamateriais são materiais eletromagnéticos artificiais compostos de estruturas de sub comprimento de onda. Sua ressonância eletromagnética única tem muitas características, como RI negativo [18, 19], transparência induzida eletromagneticamente [20, 21] e extrema sensibilidade ambiental [22, 23]. Metamateriais sensíveis ao ambiente circundante, especialmente aqueles compostos de estruturas metálicas de sub comprimento de onda [24,25,26], têm sido amplamente utilizados para detectar várias biomoléculas. A combinação de ondas terahertz e metamateriais fornece um novo método de detecção para as moléculas biomédicas, que não podem apenas atingir a detecção sem marcadores, mas também atualizar o limite de resolução dos sensores existentes. Além disso, a detecção pode ser concluída de forma simples e rápida usando uma pequena quantidade de analito sem reagentes químicos.

Nas frequências THz, a produção de metamateriais geralmente depende de métodos de processamento em nível de mícron. Fotolitografia [27] ou litografia por feixe de elétrons [28] é usada principalmente para transferir padrões de micro-nano do fotorresistor para a superfície dos materiais funcionais, e então molhado [29, 30] ou ataque seco [31, 32] é necessário para completar o processamento final dos metamateriais. Por meio das etapas acima, a construção de gráficos finos pode ser alcançada, mas, infelizmente, a maioria desses métodos exige equipamentos de processamento caros, ambientes de operação de alto padrão e procedimentos de processamento complicados. A perfuração a laser [33, 34] é a primeira tecnologia de processamento a laser prática e também um dos principais campos de aplicação do processamento a laser. O feixe de laser é altamente concentrado no espaço e no tempo. Ao focalizar com uma lente, o diâmetro do ponto pode ser reduzido ao nível de mícron e a densidade de potência do laser de 10 ⁵ –10 ¹⁵ W / cm ² pode ser obtido. Com essa densidade de alta potência, a perfuração a laser pode ser realizada em quase todos os materiais. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que se aplica a tecnologia de perfuração a laser na fabricação de biossensores de metamateriais, o que pode reduzir significativamente o custo de processamento de biossensores de metamateriais e promover suas aplicações práticas.

Neste estudo, um biossensor terahertz de alta sensibilidade para detecção de proteínas baseado em metamaterial totalmente metálico foi proposto, simulado teoricamente e demonstrado experimentalmente. O dispositivo era simples de fabricar, econômico e bastante estável. Ele era composto de material de aço inoxidável e fabricado com tecnologia de perfuração a laser. Inicialmente, este sensor de metamaterial foi simulado e analisado usando o método da integral finita, e a sensibilidade do índice de refração foi calculada. Em seguida, este biossensor de metamaterial THz foi fabricado e medido. Os experimentos confirmaram a alta sensibilidade deste senor ao ambiente externo. O BSA foi escolhido como a substância de detecção para avaliar a eficácia do biossensor. A fórmula de Hill foi usada para ajustar os dados experimentais. Sensibilidade de detecção de 72,81 GHz / (ng / mm ² ) e o limite de detecção (LOD) de 0,035 mg / mL foram obtidos. As medições foram repetidas três vezes para verificar a confiabilidade do biossensor.

Design

A Figura 1a mostra a estrutura do biossensor terahertz de metamaterial totalmente metálico proposto. Um padrão de haltere oco com um arranjo periódico ao longo das direções xey foi formado em uma placa de aço inoxidável de 50 μm de espessura (condutividade de 1,4 × 10 ⁶ S / m). Os tamanhos do período P _x e P _y da estrutura da unidade são 500 μm e 300 μm, respectivamente. O comprimento do halter oco L e lacuna H são 294 μm e 60 μm, respectivamente. O raio R de círculos em ambas as extremidades do haltere oco é 60 μm. O biossensor tinha um design estrutural todo em metal e nenhum substrato dielétrico tradicional. A onda terahertz é incidente perpendicular à superfície do biossensor metamaterial.

a Diagrama de matriz tridimensional e diagrama de estrutura celular do biossensor. Os parâmetros estruturais são P _x =500 μm, P _y =300 μm, L =294 μm, H =60 μm, R =60 μm. b Transmissão simulada do biossensor

Métodos e simulação

Em seguida, a simulação tridimensional do campo eletromagnético de onda completa por meio do método integral finito (software comercial CST) foi usada para as simulações a seguir. Condições de contorno periódicas foram aplicadas no x e y direções, e a camada perfeitamente combinada foi usada na direção de propagação da onda de z . Conforme mostrado no canto superior direito da Fig. 1a, o vetor de onda do campo eletromagnético incidente k _z era uma onda plana se propagando no z -eixo, e os campos elétricos e magnéticos foram polarizados ao longo do y -eixo e x -eixo, respectivamente. Conforme mostrado na Fig. 1b, houve um pico de transmissão em 0,48 THz.

Para estudar o mecanismo físico da geração deste pico de ressonância, a corrente de superfície do biossensor e o campo magnético na frequência de pico de ressonância foram simulados. Conforme mostrado no lado esquerdo da Fig. 2, as ondas eletromagnéticas incidentes foram polarizadas ao longo do y eixo, induzindo oscilações de carga em ambas as extremidades da abertura, resultando em um dipolo elétrico. As oscilações de carga eram acompanhadas por oscilações de corrente em contra-rotação ao longo das bordas dos dois orifícios circulares que formavam as aberturas. Isso levou a um par de dipolos magnéticos fora do plano contra-orientados. Conforme mostrado no lado direito da Fig. 2, havia um par de dipolos magnéticos opostos óbvios no z eixo conectado ponta a ponta para formar um dipolo toroidal. Portanto, a resposta do metamaterial foi dominada por uma combinação de dipolos elétricos e toroidais.

Diagrama de distribuição de corrente de superfície simulada e diagrama de distribuição magnética (y =0 μm) a 0,48 THz

Como o desempenho do sensor é afetado pelos parâmetros da estrutura, é necessário otimizar os parâmetros estruturais durante o procedimento de projeto. A Figura 3 mostra o efeito das mudanças de tamanho estrutural nos espectros de transmissão. Como mostrado na Fig. 3a, quando o comprimento do haltere oco aumentou de 290 para 298 μm, a frequência de pico do espectro de transmissão mudou para o vermelho de 0,48 THz. Conforme mostrado na Fig. 3b, quando a lacuna do haltere oco aumentou de 56 para 64 μm, a frequência de pico do espectro de transmissão mudou para o azul de 0,48 THz. Como L e H aumentado, o pico de ressonância começou a se mover em direção à frequência baixa e alta frequência, respectivamente. Quando o raio do círculo variou de 56 a 64 μm e a espessura do aço inoxidável variou de 40 a 60 μm, a posição do pico de ressonância mudou ligeiramente. Portanto, é mais fácil ajustar a frequência ressonante do biossensor de metamaterial ajustando o comprimento do haltere oco L e a lacuna do haltere oco H.

Espectros de transmissão de a comprimento diferente L , b lacuna H , c raio R , e d espessura da placa de aço inoxidável

Também é muito importante estudar a influência do ângulo de incidência e do ângulo de polarização nos espectros de transmissão. A onda eletromagnética foi incidente verticalmente e, em seguida, os ângulos de incidência e polarização foram alterados. A definição desses ângulos é mostrada na Fig. 4a. O ângulo de incidência significa θ _i no plano y – z, e a polarização é θ _p no plano x – y. Conforme mostrado na Fig. 4b, quando o ângulo de incidência mudou de 0 ° para 15 °, a diferença da frequência do pico de ressonância foi de apenas 9 GHz. Como mostrado na Fig. 4c, quando o ângulo de polarização aumentou de 0 ° para 15 °, a diferença na frequência do pico de ressonância foi quase 0 GHz, mas a amplitude do pico de ressonância diminuiu cerca de 0,1. Isso mostrou que o biossensor era quase insensível a mudanças nos ângulos de incidente e polarização, o que é benéfico para aplicações práticas de biossensores.

a Diagrama esquemático da mudança do ângulo de incidência θ _i e ângulo de polarização θ _p . Espectros de transmissão versus b o ângulo de incidência e c o ângulo de polarização

Para explorar o desempenho de detecção do biossensor, uma camada fina de 120 μm de analito foi adicionada a este biossensor de metamaterial como mostrado na Fig. 5a, então diferentes espectros de transmissão deste biossensor de metamaterial foram simulados quando o índice de refração do analito mudou, conforme mostrado na Fig. 5b. A sensibilidade do RI S foi definido como a razão das variações na posição de pico de transmissão para a unidade RI ( S =Δ f / Δ n ) Conforme o RI do analito aumentou, a frequência de pico de ressonância mudou para o vermelho. Em seguida, o desvio de frequência de pico de ressonância correspondente a cada RI foi coletado. Foi observada boa linearidade. O resultado do ajuste na Fig. 5c mostra que a sensibilidade ao RI foi de 294,95 GHz / RIU.

a Vista em corte transversal e vista superior do diagrama do modelo do biossensor de metamaterial com uma camada fina de 120 μm de analito. b Influência das mudanças no RI do analito nos espectros de transmissão do biossensor. c Ajuste linear correspondente da mudança de frequência do pico com o RI correspondente

O desempenho do sensoriamento também foi quantificado por meio da figura de mérito (FOM), que foi definida como:
$$ {\ text {FOM}} =\ frac {S} {{{\ text {FWHM}}}} $$ (1)
onde S é a sensibilidade e FHWM é a largura total na metade do máximo do pico de ressonância. O FOM deste biossensor era 4,03.

Para a maioria das estruturas de metamateriais, eles geralmente usam materiais dielétricos como substratos. No entanto, este biossensor de metamaterial proposto neste trabalho foi baseado em um metamaterial totalmente metálico com um design totalmente em aço inoxidável e o ar foi usado como substrato. Comparado com materiais dielétricos tradicionais, como tereftalato de polietileno (PET), quartzo e silício, o ar tem o RI mais baixo. Para avaliar o papel do substrato, esses biossensores de metamaterial foram simulados novamente usando diferentes substratos, e as sensibilidades do índice de refração e os valores de FOM foram calculados posteriormente. Conforme mostrado na Fig. 6, conforme o RI do substrato aumentou, a sensibilidade RI do sensor e FOM começaram a diminuir. Este resultado indicou que o biossensor com menor RI de substrato teve um melhor desempenho de detecção.

As sensibilidades e FOMs quando diferentes substratos são usados

Para investigar melhor o princípio de detecção do biossensor, os diagramas de distribuição do campo elétrico foram simulados, como mostrado na Fig. 7. As vistas superior e lateral da distribuição do campo elétrico simulado demonstraram que a energia do campo elétrico estava concentrada principalmente em parte do aço inoxidável buracos. Portanto, é crucial certificar-se de que o analito foi adicionado aos orifícios.

Distribuições de campo elétrico simulado. a Vista superior, b vista lateral ( y =0 μm)

A Tabela 1 resumiu a sensibilidade de RI e FOM do sensor proposto e os comparou com outros estudos relatados [35,36,37]. Os outros sensores THz são todos baseados em processos tradicionais de fotolitografia. Pode-se ver que o biossensor de metamaterial de aço inoxidável que projetamos tinha excelente desempenho de detecção usando tecnologia de perfuração a laser barata.

Experimento

Materiais e preparação de amostra

Então, a fim de demonstrar a capacidade de biossensor do sensor THz mmetamaterial proposto, a detecção de proteína foi realizada no experimento. Os tampões BSA e PBS foram adquiridos à Sigma-Aldrich. A solução de BSA foi formulada em tampão PBS (pH =7,4).

Uma imagem microscópica do biossensor de metamaterial fabricado é mostrada na Fig. 8. O tamanho total do biossensor de metamaterial era de 12 mm x 12 mm.

Micrografia da amostra fabricada do biossensor

As concentrações da solução de BSA formulada foram 0,2 mg / mL, 0,5 mg / mL, 2,0 mg / mL e 4,0 mg / mL. O analito foi adicionado à superfície do biossensor pelo método de deposição de líquido. Cada vez, 150 μL de solução de BSA foram transferidos para a superfície do biossensor com uma pipeta e o biossensor foi seco em uma mesa de aquecimento de 40 ℃. Quando o biossensor foi aquecido a 40 ℃, o filme de proteína se formou de maneira mais rápida e uniforme. Cada vez, antes de alterar diferentes concentrações de solução de BSA, a folha de aço inoxidável foi colocada em água desionizada e vibrada em um vibrador ultrassônico para garantir que o filme de proteína do processo anterior seja eliminado e a superfície deste biossensor de mmetamaterial esteja limpa. A Figura 9 mostra as fotos e as fotos microscópicas do processo de adição e secagem da proteína. Conforme mostrado na Fig. 9a, a folha de aço inoxidável estava limpa e, em seguida, conforme mostrado na Fig. 9b, a solução de BSA de uma concentração foi adicionada à superfície da folha de aço inoxidável e a solução permaneceu na superfície deste biossensor e não passar pelos furos devido ao efeito da tensão superficial da água. Após aquecimento e secagem, uma fina camada de filme BSA foi formada como mostrado na Fig. 9c.

Imagens do aço inoxidável em diferentes etapas de teste:o metamaterial biossensor após a limpeza e secagem ultrassônica, b adição de 150 μL de solução BSA (0,2 mg / mL) e c secagem; Fotos microscópicas da d da chapa de aço inoxidável parede lateral e e superfície antes de adicionar BSA; Fotos microscópicas da f da chapa de aço inoxidável parede lateral e g superfície após adicionar e secar a solução de BSA (0,2 mg / mL)

A fim de observar a situação dentro dos orifícios do aço inoxidável, um lado do aço inoxidável foi cortado, de modo que um lado dos orifícios fosse revelado e observado ao microscópio. Conforme mostrado na Fig. 9d-g, quando a solução de BSA foi gotejada e seca, uma fina camada de BSA foi adicionada aos orifícios do aço inoxidável, principalmente porque o diâmetro dos orifícios é muito maior do que o tamanho do Proteínas BSA. Isso prova que o analito a ser detectado pode entrar na região sensível de detecção de nosso biossensor, o que pode aumentar muito a sensibilidade desse biossensor de metamaterial.

Medições espectrais

Todas as medições espectrais foram realizadas usando um sistema de espectroscopia THz de onda contínua (TeraScan 1550, Toptica Photonics AG). O sistema consistia em eletrônicos inteligentes de controle de laser duplo (DLC), dois lasers de feedback distribuído (DFB), dois fotomixers InGaAs acoplados a fibra e quatro espelhos parabólicos fora do eixo de 90 °, conforme mostrado na Fig. 10. As ondas THz foram colimadas e focado na amostra através dos espelhos parabólicos fora do eixo de 90 °. Todos os espectros de transmissão foram obtidos por varredura entre 50 e 1220 GHz em passos de 40 MHz com um tempo de integração de 10 ms operando no modo de varredura rápida para reduzir o tempo de varredura. A polarização da onda terahertz foi ao longo da direção de abertura do haltere.

Diagrama esquemático do espectrômetro THz de onda contínua usado em nossos experimentos

Resultados do experimento e discussão

Os experimentos de detecção de proteínas do biossensor de metamaterial foram realizados com quatro concentrações das soluções de BSA. Ao longo dos experimentos, cada grupo de soluções de BSA foi adicionado em ordem crescente. Todas as medidas foram repetidas três vezes.

Conforme mostrado na Fig. 11a, conforme a concentração das soluções de BSA aumentava, a frequência de pico de ressonância mudou para o vermelho. Esta tendência é consistente com os resultados da simulação. A diminuição da intensidade da ressonância ocorreu devido à absorção da onda terahertz pela proteína BSA.

a Espectros medidos com diferentes concentrações de BSA. b Ajuste de colina do experimento BSA

A relação entre a mudança de frequência e a concentração das soluções de BSA não é linear, o que é comum em experimentos biológicos [38, 39]. O modelo de Hill pode caracterizar a capacidade de ligação entre nosso biossensor de metamaterial e biomoléculas. Portanto, o modelo de Hill [40] foi usado para ajustar os dados experimentais, conforme mostrado na Fig. 11b. A equação de Hill é descrita como segue:
$$ \ Delta f =\ Delta f _ {{\ max}} \ cdot \ frac {{[{\ text {BSA}}] ^ {n}}} {{\ left \ {{K _ {{\ text {D }}} + [{\ text {BSA}}] ^ {n}} \ right \}}} $$ (2)
onde o pico máximo de deslocamento de frequência Δ f _máximo é o valor de saturação, [BSA] é a concentração da solução de BSA, n é o coeficiente de Hill, e K _D é a constante de dissociação.

Usando a curva de ajuste conforme mostrado na Fig. 11b, o coeficiente de Hill n foi calculado em 0,83, e a constante de dissociação K _D foi calculado em 2,87 mg / mL. Além disso, Δ f _máximo era de aproximadamente 166 GHz, o que indicava o desvio máximo da frequência de pico na concentração de saturação. Os resultados de ajuste de Hill do pico de frequência ressonante confirmaram a confiabilidade e a precisão do experimento.

A sensibilidade S do biossensor foi deduzida da seguinte forma [41]:
$$ S =\ frac {{\ Delta f _ {{\ max}}}} {{\ delta _ {{\ max}}}} $$ (3)
onde Δ f _máximo é 166 GHz e δ _máximo é a densidade superficial do BSA. δ _máximo foi determinado por [41]:
$$ \ delta _ {{\ max}} =\ frac {{M _ {{{\ text {BSA}}}}}} {{N _ {{\ text {A}}} \ vezes P _ {{{\ text {BSA}}}} ^ {2}}} $$ (4)
onde M _BSA =66.430 g / mol é a massa molecular estimada de BSA [42], N _A =6,02 × 10 ²³ mol ⁻¹ é o número de Avogadro, e P _BSA =6,96 nm [43] é o comprimento médio de uma molécula de BSA. δ _máximo era 2,28 ng / mm ² e a sensibilidade de detecção de BSA do biossensor foi de 72,81 GHz / (ng / mm ² )

K _D obtido usando o modelo de Hill mostrou que a constante de dissociação estava fortemente relacionada ao BSA, e o limite de detecção (LOD) C _lim do BSA foi calculado usando a seguinte equação [44]:
$$ C _ {{\ lim}} =K _ {{\ text {D}}} \ times \ frac {{S _ {{\ text {f}}}}} {{\ Delta f _ {{\ max}} - S _ {{\ text {f}}}}} $$ (5)
onde S _f é a resolução espectral de 2 GHz. A equação (5) mostra que a constante de dissociação menor resultou em um limite de detecção mais baixo. Assim, C _lim foi calculado em 0,035 mg / mL.

A Tabela 2 mostra o desempenho de detecção de BSA do nosso biossensor em comparação com os estudos relatados. No experimento, a menor concentração da solução de BSA foi de 0,2 mg / mL e uma mudança de frequência de 10,8 GHz foi obtida. Comparado com Refs. [45,46,47], uma mudança de frequência relativamente maior foi alcançada na mesma concentração de BSA. A fórmula de Hill foi aplicada para analisar os dados do biossensor de metamaterial. O LOD calculado de 0,035 mg / ml foi significativamente melhor do que na Ref. [45]. Tudo isso prediz que nosso biossensor de metamaterial THz totalmente metálico proposto terá excelente desempenho em muitas aplicações biológicas e químicas.

Com base no excelente desempenho de detecção do biossensor de aço inoxidável, o biossensor de aço inoxidável pode ser modificado com anticorpo específico para alcançar a detecção de antígeno específico no futuro. E a espessura do biossensor de aço inoxidável é de apenas 50 µm. Com o desenvolvimento da tecnologia microfluídica e da espectroscopia terahertz, é esperançoso aplicar a medição em tempo real in vivo no futuro.

Conclusão

Em conclusão, um biossensor terahertz baseado em um metamaterial totalmente metálico foi usado para medir as concentrações de proteína. O biossensor foi feito de aço inoxidável e preparado por meio de tecnologia de perfuração a laser. A sensibilidade máxima de RI e FOM calculada usando o software de simulação eletromagnética CST são 294,95 GHz / RIU e 4,03, respectivamente. A amostra foi caracterizada usando um espectrômetro THz de onda contínua. Os resultados experimentais mostraram que, para a solução de analito BSA, a sensibilidade de detecção e o limite de detecção são 72,81 GHz / (ng / mm ² ) e 0,035 mg / mL, respectivamente. Este biossensor tem vantagens de formato pequeno, alta sensibilidade de detecção, baixos limites de detecção, capacidade de reutilização, fácil de fabricar e custo-benefício. Os resultados dessas pesquisas são de considerável importância para futuras aplicações na detecção biomolecular e no diagnóstico de doenças.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados estão totalmente disponíveis sem restrição.

Abreviações

THz:: Terahertz
RI:: Índice de refração
FOM:: Figura de mérito
BSA:: Albumina sérica bovina
PET:: Tereftalato de polietileno
DLC:: Controle de laser duplo
DFB:: Feedback distribuído
LOD:: Limite de detecção

Efeitos da energia acumulada na formação de nanopartículas na reidratação por laser pulsado de filmes finos AgCu Desenvolvimento de dose de hipertermia de nanopartículas Cs0.33WO3 irradiadas por NIR para células de câncer hepático HepG2

Nanomateriais

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