Biossensor Capacitivo Avançado de Nanocompósito Zeólita-Óxido de Ferro para Detecção Rápida de IL-3 em Sepse

Resumo

A sepse é uma condição extrema envolvendo uma resposta física a infecção microbiana grave e causa problemas fatais e ameaçadores à vida. A sepse gera durante a liberação de substâncias químicas com o sistema imunológico na corrente sanguínea para combater uma infecção, o que causa inflamação e leva à emergência médica. Um nanocompósito complexado longitudinal de zeólita e óxido de ferro foi extraído de cinza volante de mina de carvão e utilizado para melhorar as características de superfície do biossensor capacitivo para identificar ataques de sepse. Anticorpo anti-interleucina-3 (anti-IL-3) foi anexado à superfície do eletrodo capacitivo complexado zeólita-óxido de ferro através de um ligante amina para interagir com o biomarcador de sepse IL-3. Os componentes morfológicos e químicos do nanocombinado foram investigados por análises FESEM, FETEM e EDX. Em aproximadamente 30 nm, o nanocompósito longitudinal zeólita-óxido de ferro auxiliou na obtenção do limite de detecção de IL-3 de 3 pg/mL na curva linear, com coeficiente de regressão (R²) de 0,9673 [y = 1,638x − 1,1847]. Um limite de detecção mais baixo foi alcançado na faixa dependente de dose (3–100 pg/mL) devido à maior quantidade de imobilização de anticorpo na superfície de detecção devido aos nanomateriais e à corrente de superfície melhorada. Além disso, experimentos de controle com biomoléculas relevantes não mostraram mudanças de capacitância, e IL-3 adicionado em soro humano aumentou a capacitância, indicando a detecção específica e seletiva de IL-3. Este estudo identifica e quantifica IL-3 via métodos potencialmente úteis e ajuda no diagnóstico de ataque de sepse.

Introdução

A sepse é uma condição fatal que ocorre quando o corpo responde severamente a uma infecção. Devido ao ataque de sepse, o corpo produz um nível mais alto de biomoléculas de sinalização chamadas 'citocinas', que atraem células imunes. Números crescentes destas células secretam mais citocinas, e a tempestade de citocinas recruta mais células imunes. Em vez de controlar a infecção inicial, fatores imunes atacam órgãos e tecidos do corpo. Além disso, esta infecção desencadeia uma reação em cadeia no corpo todo e causa falência de órgãos e danos teciduais. Em particular, a sepse começa nos pulmões, pele, trato urinário e trato gastrointestinal e se espalha amplamente para outros órgãos, o que leva a lesão orgânica. Portanto, é necessário interromper o processo mais cedo para prevenir ataques a outros órgãos. A identificação de sepse em seus estágios iniciais com um biomarcador adequado ajuda a fornecer tratamento rápido aos pacientes e salvar vidas. Pesquisadores descobriram que o fator inflamatório interleucina-3 (IL-3) é um preditor independente de ataque de sepse e morte produzido por células B ativadoras de resposta inata (IRA) após ativação do receptor do tipo Toll. Além disso, descobriu-se que um nível mais alto de IL-3 estava associado a uma taxa mais alta de mortalidade em pacientes com sepse e confirmou que IL-3 desempenha um papel importante na regulação imune e respostas mais altas a corticosteroides durante sepse. Esta pesquisa visou quantificar o nível de IL-3 usando um sensor eletroquímico capacitivo modificado com nanocompósito zeólita-óxido de ferro (zeólita-ferro).

A detecção de biomoléculas com biossensores é altamente dependente da imobilização da molécula alvo ou de detecção na superfície do eletrodo transdutor. Um número maior de sondas de captura imobilizadas com orientação adequada leva a limites de detecção de alvo mais baixos. Na maioria dos casos, a imobilização de sonda de captura foi conduzida através de adsorção física, interação eletrostática, ligação covalente e aprisionamento de biomoléculas com polímeros. Pode ser difícil alcançar reprodutibilidade e biocompatibilidade de biomoléculas imobilizadas pelos métodos de imobilização acima. Em particular, a fixação de moléculas de captura menores como RNA, DNA, aptâmeros e peptídeos em superfícies de detecção é complicada. Vários pesquisadores usaram diferentes técnicas para imobilização eficiente. Recentemente, nanomateriais têm sido altamente atrativos para uso no processo de imobilização biomolecular em superfícies de detecção. Nanopartículas de ouro têm sido eficientemente imobilizadas em várias superfícies de detecção, como substratos ELISA de poliestireno e eletrodos de alumínio, e capturaram moléculas potenciais, incluindo anticorpos, proteínas, DNA e aptâmeros. Além de sílica, alumínio e grafeno são materiais comumente usados para imobilização de biomoléculas. Estes nanomateriais melhoram o número de moléculas de captura e rendem a biocompatibilidade e estabilidade das biomoléculas em superfícies de detecção, o que ajuda a melhorar a estratégia de detecção. Recentemente, materiais inorgânicos como zeólita, argila e sol-gel têm atraído a atenção de pesquisadores para resolver estes problemas. Além disso, a síntese de nanomateriais por abordagens mais verdes tem sido altamente encorajada devido às grandes vantagens associadas, como não envolver materiais perigosos e ser menos dispendiosa. Além disso, abordagens personalizadas podem ser usadas para alcançar tamanhos e formas desejados de nanomateriais. O estudo atual estava alinhado com esta abordagem e produziu um nanomaterial de zeólita combinado com ferro isolado para criar um nanocompósito.

A zeólita é um aluminossilicato microporoso cristalino composto de tetraedros TO₄ e átomos O. É um material promissor para imobilização biomolecular devido à sua maior área de superfície, capacidade de troca iônica, hidrofobicidade/hidrofilicidade controlável, e alta condutividade mecânica e térmica. Portanto, vários estudos no campo de biossensores têm sido estabelecidos usando material de zeólita para o processo de imobilização biomolecular e alcançaram limites de detecção mais baixos para desenvolver biossensores como sensores de glicose e ureia. Similarmente, nanomateriais de ferro melhoram o efeito de propriedades de troca de cátions e dão respostas rápidas a mudanças de corrente após interações com biomoléculas. O nanocompósito zeólita-óxido de ferro com composição única usado neste estudo melhora o alto desempenho do sensor, fornecendo ainda sensibilidade melhorada devido à melhoria na condutividade. Este estudo focou em nanomateriais zeólita-ferro extraídos de cinza volante de mina de carvão e os utilizou como substratos para eletrodos capacitivos para imobilizar a sonda de captura, que foi anticorpo anti-IL-3. Comparado a detecções anteriores mediadas por nanomateriais de diferentes interleucinas, o atual sistema de detecção fornece melhorias de várias formas. Por exemplo, sua maior adequação para sensores eletroquímicos requer menos etapas experimentais, e exibe adequação para funcionalização química de superfície e alta capacidade anti-incrustação.

Um biossensor capacitivo é um sensor eletroquímico criado pelo registro da atração entre a sonda e alvo interagindo na superfície do eletrodo. Um biossensor capacitivo ajuda a medir mudanças na camada dielétrica na interface do eletrodo quando uma biomolécula alvo está se ligando com a sonda imobilizada na superfície de detecção. A capacitância entre o eletrodo e o eletrólito é descrita por C = (2nε₀εA)/d, onde ε: constante dielétrica, A: área de superfície da placa, ε₀: permitividade do espaço livre, n: número de dedos repetitivos, e d: espessura da camada isolante. Um biossensor capacitivo não-farádico ajuda a evitar desnaturalização de proteína causada por metalização e melhora a interação de ligação alvo-sonda. Vários estudos utilizaram biossensores capacitivos para identificar várias moléculas alvo, incluindo nucleotídeos, metais pesados, proteínas e moléculas orgânicas. Nesta pesquisa, um experimento de biossensor capacitivo não-farádico foi conduzido em uma superfície de eletrodo modificada com zeólita-ferro. Zeólita-ferro foi anexada ao eletrodo capacitivo através de (3-aminopropil)-trimetoxissilano como ligante amina, e então anti-IL-3 foi anexado à superfície através da atração entre a superfície amina e o grupo carboxílico (COOH) do anticorpo. Um eletrodo modificado com anticorpo anti-IL-3 foi usado para quantificar IL-3 e diagnosticar ataque de sepse.

Materiais e Métodos

Aparelhos e Reagentes

Cinza volante foi recebida de uma usina termelétrica na Índia. Hidróxido de sódio e ácido sulfúrico foram comprados da Sigma Aldrich (Missouri, EUA). (3-Aminopropil)-trimetoxissilano (APTMS) foi recebido da Merck (NJ, EUA). Papel filtro Whatman foi obtido da Thermo Fisher Scientific (Massachusetts, EUA). IL-3 e anticorpos anti-IL-3 foram recebidos da Santa Cruz Biotechnology (Texas, EUA). Microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (FESEM; Hitachi, S-4300 SE, Japão) e microscopia eletrônica de transmissão de emissão de campo (FETEM; JEM-2100F, JEOL, Japão) foram usadas para analisar o nanomaterial zeólita-ferro por métodos descritos anteriormente.

Síntese do Nanomaterial Zeólita-Ferro

Nanomateriais zeólita-ferro foram sintetizados usando ferro, sílica e alumina extraídos de cinza volante. Os seguintes três passos principais foram envolvidos neste procedimento: (1) separação de partículas de ferro; (2) extração de aluminossilicato de sódio; e (3) preparação de nanopartículas zeólita-ferro pelo método de síntese sol-gel.

Separação de Ferro da Cinza Volante

Uma alíquota de 25 g de cinza volante foi misturada com 500 µL de água destilada e agitada por 30 min usando um agitador magnético. As partículas de ferro grudadas no agitador magnético foram separadas, e então 1 g das partículas separadas foi misturado com 25% de ácido sulfúrico e agitado por 1 h a 50 °C. Então, a solução contendo ferro e as partículas de ferro foram separadas por papel filtro Whatman e utilizadas como base para óxido de ferro para sintetizar o nanomaterial zeólita-ferro.

Extração de Aluminossilicato de Sódio da Cinza Volante

O método de extração alcalina foi usado para extrair aluminossilicato de sódio da cinza volante pelo método de extração alcalina. Primeiro, 25 g de cinza volante separada de ferro foi misturada com 500 µL de hidróxido de sódio 2 M e aquecida a 100 °C com agitação por 6 h. Após resfriar a solução, aluminossilicato de sódio (a solução na mistura) foi separado por papel filtro Whatman. A solução filtrada foi usada como base para sintetizar uma zeólita.

Nanomaterial Zeólita-Ferro Sintetizado pelo Método Sol-Gel

O ferro extraído e o aluminossilicato de sódio foram usados como base para sintetizar nanomateriais zeólita-ferro pelo método sol-gel. No primeiro passo, um béquer contendo 200 mL de aluminossilicato de sódio a pH 12 foi colocado em placa quente sob agitação. Então, a solução foi titulada com solução de ferro a pH 1 adicionando quantidades gota a gota de solução de ferro até atingir pH 7. No pH 7, um gel branco foi formado, e este gel foi continuamente agitado durante a noite para obter nanopartículas zeólita-ferro distribuídas uniformemente. No dia seguinte, o gel foi separado por centrifugação (10.000×g por 10 min) e então lavado com 25% de etanol e água destilada. O produto final foi seco a 100 °C por 1 h para obter um pó consistindo de nanomateriais zeólita-ferro. A superfície do nanomaterial zeólita-ferro foi caracterizada por FETEM e FESEM. Análise de raios-X por dispersão de energia (EDX) também foi conduzida para identificar os elementos no zeólita-ferro.

Modificação Amina de Zeólita-Ferro e Funcionalização da Superfície do Eletrodo Capacitivo

Amina foi revestida na superfície do zeólita-ferro pelo agente de acoplamento silano APTMS. Para isso, 1 g de zeólita-ferro foi misturado com 1% KOH por 10 min, e então o excesso de KOH foi removido por água destilada. Posteriormente, o zeólita-ferro tratado com KOH foi misturado com 1% APTMS, e a mistura foi colocada em um agitador aquecido durante a noite. No dia seguinte, o nanomaterial foi lavado com etanol e separado por centrifugação (10.000×g por 10 min). Este APTMS-zeólita-ferro foi anexado à superfície do eletrodo capacitivo para identificar IL-3. Para esta imobilização, APTMS-zeólita-ferro foi pingado no eletrodo hidroxilado e mantido a RT por 3 h. A ligação entre o nanocompósito zeólita-óxido de ferro, APTMS e superfície de detecção foi devido a acoplamento silano com os grupos óxido gerados. Em geral, o acoplamento silano ocorre com múltiplos braços disponíveis para os grupos óxido, resultando em ligações entre o nanocompósito zeólita-óxido de ferro, APTMS e superfície de detecção. Devido a estas múltiplas ligações, um arranjo espacial na superfície de detecção é formado. Após lavar a superfície com etanol seguido por água, um processo de imobilização de anticorpo anti-IL-3 foi realizado para interagir com IL-3.

Determinação de IL-3 na Superfície do Eletrodo Capacitivo Modificado com Anti-IL-3

A superfície descrita acima foi formada por ancoragem amina, que permite reação com grupos COOH disponíveis quando o anticorpo se anexa. IL-3 foi identificado em uma superfície de eletrodo capacitivo imobilizada com anti-IL-3. Para isso, IL-3 a 100 pg/mL foi diluído em tampão PBS e pingado em uma superfície de eletrodo modificada com anticorpo. Após imobilização do anticorpo, a superfície não ligada restante foi bloqueada por PEG-COOH (1 mg/ml). Uma reação similar à anticorpo-APTMS ocorre quando PEG-COOH é anexado. O valor de capacitância foi registrado antes e após interagir com IL-3. Diferenças no valor foram consideradas para a ligação de IL-3 com seu anticorpo. Além disso, para calcular o limite de detecção, IL-3 foi titulado de 3 a 50 pg/mL e pingado independentemente em superfícies modificadas com anticorpo. O outro procedimento experimental foi realizado como descrito anteriormente. A diferença no valor de capacitância para cada concentração de IL-3 foi calculada e plotada para calcular a detecção de IL-3 pelo valor de R². Quando IL-3 é anexado à superfície imobilizada com anticorpo, haverá uma interação genuína.

Incrustação Biológica e Determinação Seletiva de IL-3 na Superfície do Eletrodo Capacitivo Modificado com Zeólita-Ferro

Um experimento de incrustação biológica foi conduzido sob três diferentes condições de biomoléculas, incluindo a presença de um anticorpo não imune ou uma proteína de controle e a ausência de anticorpo IL-3. No primeiro caso, em vez de anticorpo IL-3, um anticorpo não imune foi usado; no segundo experimento, em vez de IL-3, uma proteína de controle foi usada; e o último experimento foi conduzido sem anticorpo IL-3. Os valores de capacitância foram comparados para a interação específica de anticorpo IL-3 com IL-3. Um experimento seletivo foi conduzido adicionando IL-3 em uma diluição 1:100 de soro humano e pingando gota a gota em uma superfície de eletrodo modificada com anti-IL-3. As mudanças na capacitância foram registradas para cada concentração de IL-3 para identificar a identificação seletiva de IL-3. A reprodutibilidade foi confirmada repetindo os experimentos três vezes (em triplicata) com dispositivos similares feitos da mesma fabricação em lote. A vida útil de armazenamento e estabilidade da superfície imobilizada com sonda também foram determinadas.

Resultados e Discussão

A sepse é a condição com muitas substâncias químicas liberadas no sistema imunológico, e desencadeia uma inflamação generalizada com o dano final dos órgãos. A Figura 1a mostra uma ilustração esquemática da identificação de IL-3 em uma superfície de detecção capacitiva modificada com anti-IL-3 para determinar a condição associada com sepse. Zeólita-ferro modificada com APTMS foi usada para anexar o anticorpo de captura à superfície do eletrodo de detecção. APTMS na superfície do zeólita-ferro foi imobilizado na superfície do eletrodo através da interação entre amina no nanomaterial e grupos OH na superfície do eletrodo. O anticorpo foi ligado à superfície através de COOH e amina do zeólita-ferro. Zeólita-ferro ajuda a anexar um número maior de APTMS no eletrodo de detecção, o que ajuda a capturar mais anticorpos na superfície do eletrodo capacitivo. Vários estudos indicaram que a imobilização de sonda de captura na superfície de detecção desempenha um papel crucial na redução do limite de detecção da molécula alvo. Nesta pesquisa, o nanomaterial zeólita-ferro foi usado para anexar anticorpo anti-IL-3 à superfície do eletrodo de detecção. Maior imobilização de anticorpo anti-IL-3 com orientação adequada ajuda a alcançar limites de detecção mais baixos de IL-3.

Análise Morfológica do Nanomaterial Zeólita-Ferro por FESEM e FETEM

A Figura 1c, d (inseto) exibe a imagem morfológica do nanomaterial zeólita-ferro obtida por FESEM em diferentes ampliações e a análise elementar EDX. O nanomaterial zeólita-ferro obtido foi liso e distribuído uniformemente, com uma nanoestrutura longitudinal densamente empilhada. O tamanho desta nanoestrutura era ~30 nm, e a imagem obtida mostra que o nanocompósito foi arranjado com formas uniformes e bem distribuído à distância adequada. A imagem FETEM também provou uma forma similar à obtida por FESEM para os nanocompósitos zeólita-ferro formados. O resultado EDX confirmou a presença de Fe, Al, Si e O no nanocompósito zeólita-ferro sintetizado. As porcentagens atômicas elementares principais de Si, Al, Fe e O foram encontradas como 3,46, 0,78, 2,13 e 24,39%, respectivamente. Este resultado FESEM e EDX confirma a formação de nanomateriais zeólita-ferro.

Preparação do Eletrodo de Detecção para Determinação de IL-3

A imobilização de anticorpo anti-IL-3 no biossensor capacitivo foi confirmada pela alteração do nível de capacitância após cada imobilização biomolecular. A Figura 3a mostra as mudanças de capacitância durante o processo de fixação do anticorpo na superfície modificada com zeólita-ferro. Como mostrado na Fig. 3a, a superfície do eletrodo capacitivo ancorada com KOH mostra um valor de capacitância de 1,74 × 10⁹ nF, e após adição gota a gota do APTMS-zeólita-ferro, aumentou para 2,02 × 10⁹ nF. Este aumento de capacitância confirmou a fixação dos nanomateriais ao eletrodo de detecção. Além disso, ao adicionar anticorpo anti-IL-3, o valor de capacitância aumentou drasticamente para 3,42 × 10⁹ nF. Este incremento maior foi notado devido à maior quantidade de imobilização de anticorpo no zeólita-ferro modificado com APTMS. Adicionalmente, os nanomateriais mostraram um arranjo adequado com maior número de APTMS na superfície do eletrodo de detecção, atraindo finalmente mais anticorpos. Finalmente, PEG-COOH foi adicionado para fins de bloqueio, e a capacitância foi encontrada aumentada para 3,64 × 10⁹ nF. O sensor funciona baseado em mudanças na carga de superfície e, finalmente, mudanças na capacitância. As mudanças de carga de superfície variam com fixações/interações moleculares. Cada molécula carrega cargas diferentes e influencia a capacitância do sensor. Portanto, a diferença na capacitância foi considerada para as medições. Maiores mudanças na capacitância foram notadas devido à maior ocupação de anticorpos IL-3 na superfície do eletrodo de detecção. PEG-COOH ajuda a reduzir ligação não específica de IL-3 na superfície do eletrodo de detecção e elimina resultados falso-positivos. Vários estudos provaram que polímeros baseados em PEG em superfícies de detecção melhoram a biocompatibilidade, reduzem a relação sinal-ruído e fornecem orientação adequada de biomoléculas imobilizadas em superfícies de detecção, o que leva a um limite de detecção mais baixo do sensor. Como a superfície APTMS atrai outras biomoléculas eletrostaticamente, PEG-COOH foi usado para cobrir a superfície APTMS em excesso no nanomaterial zeólita-ferro, o que ajuda a reduzir incrustação biológica. Esta superfície modificada com anti-IL-3 foi utilizada para identificar IL-3.

Determinação e Quantificação de IL-3 na Superfície do Anticorpo Anti-IL-3

IL-3 foi quantificado em uma superfície de eletrodo capacitivo de detecção modificada com anti-IL-3. Inicialmente, uma concentração mais alta de IL-3 (100 pg/mL) foi testada na superfície modificada com anticorpo, e o valor de capacitância aumentou de 3,74 × 10¹⁰ nF para 13 × 10¹⁰ nF. Este aumento confirma a interação de IL-3 com anticorpo anti-IL-3. Um experimento similar foi conduzido com concentrações de IL-3 de 3 a 50 pg/mL. Como mostrado na Fig. 4b, os valores de capacitância aumentaram para 4,56 × 10¹⁰ nF, 5,84 × 10¹⁰ nF, 6,64 × 10¹⁰ nF, 8,39 × 10¹⁰ nF e 12 × 10¹⁰ nF. Notou-se que com o aumento das concentrações de IL-3, os valores de capacitância aumentaram gradualmente. A diferença nos valores de capacitância foi calculada e plotada em uma planilha Excel, e a detecção de IL-3 foi calculada como 3 pg/mL com valor R² de 0,9673. Uma resposta linear dependente de dose com diferentes concentrações de IL-3 (3–100 pg/mL) foi encontrada quando interagindo com anti-IL-3. No entanto, quando titulado em concentrações maiores, as amostras foram saturadas.

Incrustação Biológica/Anti-incrustação no Eletrodo Capacitivo Modificado com APTES-Zeólita-Ferro

Incrustação biológica é o maior problema em qualquer tipo de biossensor, que leva a identificação falso-positiva do alvo na superfície de detecção. Agentes de bloqueio como BSA, etanolamina e polímeros baseados em PEG são moléculas comuns que reduzem incrustação biológica em superfícies de detecção. Aqui, PEG-COOH foi usado como agente de bloqueio, e o efeito de incrustação biológica foi confirmado em três diferentes experimentos de controle, nomeadamente, sem anticorpo IL-3, com anticorpo não imune e com proteína de controle (IL-8). Como mostrado na Fig. 6a, todos os três experimentos de controle falharam em aumentar o valor de capacitância, indicando a identificação específica de IL-3 sem qualquer incrustação biológica.

Adição de IL-3 em Soro Humano e Estabilidade

Diferentes concentrações de IL-3 foram adicionadas em soro humano e submetidas ao mesmo procedimento experimental para identificar IL-3 em situações reais. Como exibido na Fig. 6b, IL-3 adicionado em soro humano claramente produziu valores de capacitância aumentados com concentrações aumentadas de IL-3. Este resultado confirma a identificação seletiva de IL-3 pelo eletrodo capacitivo modificado com anti-IL-3.

Considerando a reprodutibilidade, a superfície de detecção comporta-se bem, com valores mínimos de erro. A vida útil operacional da superfície de detecção fabricada com nanomaterial anexado pode ser prolongada por três meses com armazenamento adequado em dessecador. No entanto, após anexar a sonda, a superfície foi estável por 2 semanas e tendia a perder 19% da estabilidade, e a perda de estabilidade tornou-se acentuada a partir da 3ª semana. Para provar o alto desempenho do sensor atual, um estudo de comparação foi realizado com sensores atualmente disponíveis, e os resultados indicam que é comparável e comporta-se melhor em várias instâncias.

Conclusão

A sepse é ameaçadora à vida, envolve uma reação imune avassaladora, é extremamente perigosa e afeta todo o corpo. Este estudo demonstrou a identificação de um biomarcador de sepse (IL-3) em um eletrodo capacitivo. Nanomaterial zeólita-ferro foi extraído de cinza volante de carvão modificada com eletrodo capacitivo para aumentar o fluxo de corrente após ligação de biomoléculas ao eletrodo de detecção. Modificação amina foi realizada para anexar anticorpo anti-IL-3 ao zeólita-ferro. Detecção de IL-3 foi conduzida em eletrodo modificado com anticorpo e alcançou o limite de detecção de IL-3 a 3 pg/mL. Experimentos de controle adicionais falharam em mostrar aumento no valor de capacitância, confirmando a detecção específica de IL-3, e experimentos seletivos com IL-3 adicionado em soro humano exibiram um claro aumento na capacitância. Este método experimental quantifica níveis de IL-3 e ajuda a diagnosticar ataques de sepse.