A liberação sucessiva de inibidores de metaloproteinase-1 através do sistema de administração à base de óxido de grafeno pode promover a regeneração da pele

Resumo

O objetivo deste estudo foi atestar a hipótese de que o óxido de grafeno (GO) poderia atuar como um veículo adequado para a liberação de inibidores teciduais da proteína metaloproteinase-1 (TIMP-1) no contexto de reparo cutâneo. As características do GO foram observadas por microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica e análise térmica gravimétrica. Depois de TIMP-1 absorver GO, os perfis de liberação de várias concentrações de TIMP-1 de GO foram comparados. A biocompatibilidade do GO com a viabilidade do fibroblasto foi avaliada por meio da medição do ciclo celular e da apoptose. Ensaios de cicatrização de feridas in vivo foram usados ​​para determinar o efeito de TIMP-1-GO na regeneração da pele. A maior intensidade do GO foi de 1140 nm, e o volume de maior intensidade foi de 10.674,1 nm (nanômetro). O TIMP-1 foi mostrado para ser lançado continuamente por pelo menos 40 dias a partir de GO. A proliferação e viabilidade de fibroblastos de rato cultivados com TIMP-1-GO não foram significativamente diferentes em comparação com as células cultivadas em GO ou TIMP-1 sozinho ( p > 0,05). Defeito de pele de ratos tratados com TIMP-1 e TIMP-1-GO mostrou diferenças significativas nas pontuações histológicas e imunohistoquímicas ( p <0,05). GO pode ser controlado para liberar materiais de transporte. A combinação de TIMP-1 e GO promoveu a progressão da regeneração do tecido cutâneo no defeito cutâneo.

Histórico

Lesões de pele podem ser causadas por vários fatores, como acidentes, complicações diabéticas, queimaduras ou cirurgia superficial [1]. O transplante autógeno de pele, ou biopolímeros usados ​​para a fabricação da pele artificial, representa a abordagem mais comum usada para o fechamento de feridas [2]. Esses substitutos podem incluir uma limitação do tecido mole do doador disponível, especialmente em pacientes gravemente queimados [3], infecção [4], dor e necrose do retalho cutâneo [5], retardando a cicatrização e a biocompatibilidade do material.

O inibidor de tecido da metaloproteinase-1 (TIMP-1) evita que a matriz extracelular (ECM) seja decomposta formando um complexo inibitório com as metaloproteinases da matriz (MMPs) [6, 7]. As proteínas TIMP também controlam o turnover orientado por MMP e o processamento de fatores de crescimento, bem como citocinas ligadas ao reparo e regeneração de feridas [8]. TIMPs e MMPs são regulados durante a cicatrização normal de feridas, e seu desequilíbrio tem sido implicado em defeitos de reparo da pele, queloides e fibrose [9]. O TIMP-1 derivado do epitélio pode regular a epitelização em diferentes estágios, direta ou indiretamente. Uma fase importante do reparo da ferida excisional e regeneração da pele é a reepitelização, que é o novo crescimento do epitélio sobre uma superfície traumática [10]. A reepitelização ocorre quando as células na margem da ferida afrouxam seus contatos célula-célula e célula-ECM e começam a migrar pela ferida. Esses processos têm sido associados à biologia do TIMP-1 [11].

Um sistema de administração TIMP-1 regional ideal para a restauração da pele depende do veículo de entrega usado. Alguns veículos de entrega projetados para liberar citocinas foram desenvolvidos [12]. Os transportadores incluem PLGA (poli (ácido lático-co-glicólico)) [13], quitosana [14], nanoesferas de PLGA [15] e hidrogéis. O uso de um veículo de entrega ajudaria a reduzir a dosagem de TIMP-1 para regeneração da pele e permitiria uma entrega regional do agente. O grafeno é composto por átomos de carbono com uma monocamada plana e uma estrutura bidimensional semelhante a um favo de mel [16]. O óxido de grafeno (GO) tem sido usado como um veículo de entrega de drogas de pequenas moléculas na literatura, pois tem carga (absorção) eficiente, é biocompatível e tem baixa toxicidade [17,18,19]. As características essenciais do GO incluem π hidrofóbico domínios no núcleo da estrutura com regiões ionizadas ao longo das bordas. O característico π - π a interação de empilhamento torna o GO eficiente com solubilidade em água, com uma grande área de superfície específica para alta capacidade de carregamento [20, 21].

No presente estudo, investigamos se a proteína TIMP-1 humana recombinante pode ser emparelhada com GO como um veículo de entrega para melhorar a regeneração da pele. Para investigar o efeito na regeneração da pele, o TIMP-1 foi carregado em flocos GO e sua liberação e toxicidade são medidas in vitro por meio de fibroblastos de rato. Os resultados são finalmente testados em ratos onde um modelo de ferida na pele é usado.

Materiais e métodos

Cultura de células

Fibroblastos de rato foram adquiridos do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular, CAS (Shanghai, China), e cultivados em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, EUA) contendo 10% ( v / v ) soro fetal bovino (FBS, Gibco). O meio foi trocado a cada 2 dias. Todas as células foram mantidas a 37 ° C.

Caracterização GO

Os flocos GO foram adquiridos de Chengdu Organic Chemicals Co., Ltd. Chinese Academy of Science (Chengdu, China) e caracterizados usando microscopia eletrônica de varredura (SEM, JSM-6701F, JEOL, Tóquio, Japão) após revestimento de platina. As amostras foram digitalizadas em um microscópio eletrônico de varredura (Hitachi S3000N) a 15 kV de voltagem de aceleração. A distribuição do tamanho dos flocos GO foi determinada com um espectrofotômetro baseado em potencial elétrico zeta (Zetasizer 3000 HSA, Malvern, Reino Unido). A morfologia dos flocos de GO foi determinada por microscopia de força atômica (AFM, MultiMode, VEECO, EUA) acoplada a um microscópio invertido (microscópio invertido IX71, Olympus, Tóquio, Japão). A análise térmica gravimétrica e a calorimetria diferencial de varredura foram realizadas usando um analisador termogravimétrico TGA / DSC (Pyris 1 TGA, Perkin-Elmer, EUA) colocando as amostras em recipientes de alumina e aplicando uma rampa de aquecimento de 25 a 1100 ° C a 10 ° C / min.

Adsorção TIMP-1 em GO

Os flocos GO foram marcados com perclorato de 1,1-dioctadecil-3,3,3,3-tetram-etilindocarbocianina (DiI, vermelho, Sigma) antes da adsorção de TIMP-1 recombinante humano (Huaan Co., Hangzhou, China). Para a adsorção de TIMP-1, isotiocianato de fluoresceína (FITC, verde, Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) -conjugado TIMP-1 (Huaan Co., Hangzhou, China) e GO marcado com DiI foram adicionados a solução salina tamponada com fosfato (PBS ) e incubado durante 4 h a 4 ° C. A proporção de GO para TIMP-1 recombinante foi de 1:1 em peso. Para determinar o carregamento de TIMP-1 no GO, o TIMP-1 (1 μg) foi adicionado a 20 μl de PBS contendo GO e incubado por 4 h a 4 ° C. O TIMP-1 adsorvido ao GO foi visualizado usando um microscópio confocal de varredura a laser (microscópio invertido IX81-FV1000, Olympus). Para confirmar a adsorção de TIMP-1 em GO, a espectroscopia infravermelha transformada de Fourier (FTIR) foi realizada usando uma espectroscopia Nicolet 5700 (ThermoFisher Co., SGE, Austrália) em pelotas (10 mm de diâmetro) preparadas pela mistura de 2 mg de GO com 100 mg KBr e prensagem para produzir o pellet a ser analisado. Os espectros foram analisados ​​após a correção da linha de base pelo software EZ OMNIC (Nicolet).

Cinética de liberação da proteína TIMP-1

Os perfis de liberação de TIMP-1 de várias concentrações de GO (10, 20 e 30 μg / ml) foram determinados usando um ensaio imunoenzimático comercial específico para TIMP-1 humano (ELISAs, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, EUA). Após incubação por 4 h a 4 ° C, um ELISA do sobrenadante mostrou que virtualmente todo o TIMP-1 foi adsorvido no GO. O GO carregado com TIMP-1 foi suspenso em placas de cultura de 60 mm contendo 1,5 ml de PBS. As placas foram então incubadas a 37 ° C. Em vários pontos de tempo, o sobrenadante foi coletado após agitação contínua e tampão fresco foi adicionado às placas de cultura. A concentração de TIMP-1 humano no sobrenadante foi determinada por ELISA.

Ensaio de biocompatibilidade GO

Vinte microgramas por mililitro de flocos de GO carregados com uma concentração de 20 μg / ml de TIMP-1 foram adicionados a culturas de fibroblastos de rato e as células foram cultivadas por 6, 24, 48 e 72 h. A viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio de contagem de células-8 (CCK8), conforme descrito nas instruções do fabricante. A absorbância da amostra foi expressa como valor de absorbância a 450 nm ( n =5 para cada grupo).

Caracterização citométrica de fluxo

Os fibroblastos foram colhidos por tripsinização e marcados com Hoechst 33258 e Anexina-V-FITC / PI. A atividade do ciclo celular e a apoptose celular foram subsequentemente determinadas pelo kit de análise de citometria de fluxo (Lianke, Hangzhou, China). A marcação foi realizada por 30 min a 4 ° C na presença de reagente de bloqueio (Lianke, Hangzhou, China), seguido por duas etapas de lavagem usando PBS. Após a lavagem e fixação, pelo menos 10 ⁴ células foram adquiridas e analisadas. A análise de citometria de fluxo foi realizada usando um Becton Dickinson FACSCanto II.

Experiência In Vivo

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do NIH nos EUA. Os animais para procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Zhejiang. Ratos Sprague-Dawley machos com quatro semanas de idade foram administrados com cirurgia de defeitos de pele (SDS) conforme descrito anteriormente (Fig. 4a) [22]. O tamanho da defecção da pele era de 10 mm × 10 mm. Após a cirurgia, os animais foram devolvidos às suas gaiolas individuais. Quatorze dias após o SDS, os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos e a terapia foi iniciada. Injeções locais de agente de controle (4 ml de PBS apenas), agente GO (4 ml de GO com PBS, 1:20), agente TIMP-1 (4 ml TIMP-1 com PBS 1:20) ou agente TIMP-1-GO (4 ml GO com TIMP-1, 1:1 v / w ) foram administrados por via subcutânea. As injeções foram feitas todas as semanas em torno do defeito da pele (um total de 4 pontos, 1 ml cada) para um total de dois tratamentos durante um período de 2 semanas. Os ratos foram sacrificados 4 semanas após a cirurgia (Fig. 4a). A pele regenerada foi dissecada, incluída em parafina e investigada por coloração com hematoxilina-eosina e coloração de Masson.

Análise histológica e imunohistoquímica

As películas regeneradas foram fixadas em formalina 4% por 72 h. Em seguida, as amostras foram descalcificadas em ácido fórmico a 9% por 2 semanas em temperatura ambiente. As amostras de pele foram desidratadas por etanol graduado. As seções consecutivas foram coradas com hematoxilina-eosina (HE) e Masson. A expressão de CD34 no defeito cutâneo foi analisada por coloração imunohistoquímica. As seções foram desparafinadas em xileno e hidratadas em álcoois graduados. Após bloqueio com soro de cabra a 1% (diluição 1:100, Sigma), as seções foram incubadas com anticorpos primários contra CD34 (Abcam, Cambridge, UK) durante a noite a 4 ° C. Após lavagem com PBS por três vezes, as seções foram incubadas com anticorpo secundário por 1 h a 37 ° C. A coloração foi desenvolvida com solução de 3,3′-diaminobenzidina (DAB) (Dako, Hamburgo, Alemanha). A pele regenerada foi observada por três observadores treinados. Os cortes imunohistoquímicos foram estadiados pelo percentual de DBA.

Análise estatística

Todos os experimentos foram repetidos três vezes, e os dados apresentados como média ± desvio padrão. A ANOVA de uma via e o teste post hoc de Student-Newman-Keuls determinaram o nível de significância. p os valores inferiores a 0,05 e 0,01 foram considerados, respetivamente, significativos e altamente significativos. A análise estatística foi realizada com SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, EUA).

Resultados

Caracterização GO

A representação 2D das imagens GO é mostrada no AFM (Fig. 1a). Um SEM mostrou que os flocos GO eram folhas de formato irregular (Fig. 1b). A distribuição do tamanho dos flocos GO foi medida por um espectrofotômetro baseado em potencial elétrico. A maior intensidade de distribuição de tamanho foi de 1140 nm, e o volume de maior intensidade do GO foi de 10.674,1 nm (Fig. 2a).

Absorção de GO. a Representação 2D de imagens GO mostradas no AFM. b SEM mostra que os flocos GO são folhas de formato irregular. Os flocos GO eram folhas de formato irregular. c A distribuição do tamanho dos flocos GO. A maior intensidade foi de 1140 nm e o volume de maior intensidade foi de 10.674,1 nm

Caracterização de GO e TIMP-1-GO. a O TIMP-1 foi absorvido pelo GO. A análise revelou que 75 ± 1,2% do GO foi absorvido pelo TIMP-1. b Os perfis de liberação cumulativa de TIMP-1 foram registrados. O TIMP-1 incorporado no GO representa um sistema adequado para o lançamento prolongado do TIMP-1 por cerca de 40 dias. c A composição química entre o GO e o TIMP-1-GO foi investigada por espectroscopia FTIR. A forma de onda e o pico da onda do GO foram significativamente diferentes daqueles do TIMP-1-GO. d A curva de análise gravimétrica térmica não mostra grandes diferenças entre GO e TIMP-1-GO de 50 a 800 ° C. A curva de análise gravimétrica térmica não mostrou diferenças apreciáveis ​​entre o controle GO e o TIMP-1-GO

Adsorção TIMP-1 em GO

A seguir está a incubação de TIMP-1 conjugado com FITC (verde) e GO marcado com DiI (vermelho) em PBS por 4 h; O TIMP-1 foi adsorvido no GO. A análise revelou que 75 ± 1,2% do GO foi absorvido pelo TIMP-1 após 4 h, o que sugeriu que o GO se liga de forma eficiente à proteína TIMP-1 (Fig. 1c). Nós investigamos a composição química do TIMP-1-GO usando espectroscopia FTIR (Fig. 2b). A forma de onda e o pico da onda do GO foram significativamente diferentes daqueles do TIMP-1-GO. Investigamos ainda mais a análise gravimétrica térmica entre o controle GO e o TIMP-1-GO (Fig. 2d). A curva de análise gravimétrica térmica não mostrou diferenças apreciáveis ​​entre o controle GO e o TIMP-1-GO.

Lançamento TIMP-1

Várias concentrações de TIMP-1 (grupo 1 3 μg / ml, grupo 2 2 μg / ml e grupo 3 10 μg / ml) foram carregadas no GO. Os perfis de liberação cumulativa de TIMP-1 são mostrados na Fig. 2c. A liberação de 2 μg / ml de TIMP-1-GO atingiu 50% da liberação cumulativa mais rapidamente em comparação com a dose de 10 e 30 μg / ml de TIMP-1. O TIMP-1 foi lançado continuamente por cerca de 40 dias. Isso sugere que a aplicação de TIMP-1 incorporado em GO pode representar um sistema adequado para liberação prolongada de TIMP-1 (Fig. 2c).

Proliferação celular e viabilidade em TIMP-1-GO

A proliferação e viabilidade de fibroblastos de rato cultivados no controle, GO e TIMP-1, não foram significativamente diferentes das células cultivadas nas diferentes amostras de TIMP-1-GO ( p > 0,05). O ciclo celular e a apoptose dos fibroblastos cultivados no controle, GO e TIMP-1, não foram significativamente diferentes do que as células cultivadas nas amostras de TIMP-1-GO ( p > 0,05) (Fig. 3a – c).

O efeito de TIMP-1-GO na proliferação e viabilidade de células de fibroblastos de rato. a A viabilidade de fibroblastos cultivados em diferentes grupos não mostra diferenças significativas em diferentes pontos de tempo ( p > 0,05). b O ciclo celular do fibroblasto não foi significativamente diferente do das células cultivadas em grupos diferentes ( p > 0,05). c A apoptose celular de fibroblasto não foi significativamente diferente daquela de células cultivadas em grupos diferentes ( p > 0,05)

Eficácia do TIMP-1-GO no modelo de lesão cutânea excisional

O TIMP-1-GO foi administrado por via subcutânea a ratos para determinar se ele poderia promover a cicatrização da ferida experimental. Quatro semanas após a cirurgia, em comparação com o grupo de controle, defeitos de pele tratados com TIMP-1-GO mostraram diferenças significativas no ponto terminal ( p <0,05), enquanto os defeitos da pele tratados com TIMP-1 mostraram diferenças significativas com o grupo controle e o grupo GO no ponto terminal ( p <0,05). Além disso, o grupo TIMP-1-GO exibiu um efeito terapêutico aprimorado na regeneração dos folículos capilares ( p <0,05). Defeitos cutâneos tratados com TIMP-1 mostraram diferenças significativas com o grupo controle e o grupo GO no ponto terminal ( p <0,05) (Fig. 4b).

Experiência in vivo. a Esquema e SDS e modelo. b Análise histológica e imunohistoquímica in vivo (1 cm). A fibra de colágeno contínua é visível no grupo TIMP-1-GO. c A avaliação quantitativa revelou diferenças significativas entre o controle e o GO em comparação com o TIMP-1 e o TIMP-1-GO ( p <0,05). Os folículos capilares de diferentes grupos eram significativamente diferentes ( p <0,05). Defeitos cutâneos tratados com TIMP-1 mostraram diferenças significativas com o grupo controle e o grupo GO por semiquantitativo ( p <0,05)

Análise histológica e imunohistoquímica

As características histológicas da regeneração da pele após o tratamento com PBS são exibidas na Fig. 4b. As características nos grupos de controle após o defeito cutâneo mostram fibras de colágeno rompidas visíveis nas amostras 4 semanas após o tratamento. Em contraste, a fibra de colágeno contínua é visível nos grupos TIMP-1-GO no mesmo ponto de tempo e mostra uma diferença estatística em comparação com o grupo de controle. As características imunohistoquímicas de vascularização após o tratamento de TIMP-1-GO são exibidas na Fig. 3c. As células subcutâneas CD34 + são visíveis nas amostras após 4 semanas nos grupos tratados com TIMP-1-GO. A avaliação quantitativa revelou diferenças significativas entre os grupos de controle e o grupo de tratamento TIMP-1-GO ( p <0,05) (Fig. 4c).

Discussão

No presente estudo, analisamos uma nova abordagem potencial para melhorar o reparo de feridas excisionais combinando a proteína TIMP-1 recombinante com a liberação controlada de GO. GO mostrou boa biocompatibilidade in vitro. E o TIMP-1 é mostrado para ser continuamente liberado do veículo GO por até 40 dias. A combinação de TIMP-1 com GO mostrou promover a vascularização e regeneração do colágeno em um modelo experimental de defeito cutâneo.

Uma variedade de materiais biomédicos foi avaliada como veículos de terapia para a entrega de agentes na regeneração de tecidos. Veículos como colágeno, seda, titânio, cimento de fosfato de cálcio e ácido polilático-ácido poliglicólico tendem a produzir uma liberação rápida de agente biológico que pode ser indesejado em alguns ambientes de terapia [23]. Portanto, a capacidade de um vetor biomédico de fornecer uma liberação lenta e contínua de moléculas biológicas pode ser vista como uma característica importante. Um requisito para essa qualidade é um flexível utilizado para carregar o medicamento com o auxílio de uma carga elétrica [24]. O óxido de grafeno (GO) fornece um efeito “inicial” que se mostrou útil para a liberação lenta de vários agentes biológicos in vitro e in vivo [25,26,27]. Aqui, mostramos que GO pode ser usado para exercer uma liberação sustentada de proteína TIMP-1 humana recombinante. A interação entre hidrofóbicos π Os domínios do GO e a interação eletrostática podem ativar os domínios carregados negativamente do GO e permitir a absorção eficiente da proteína TIMP-1 para o GO através das regiões hidrofóbicas internas. A longa liberação de TIMP-1 de GO é idealmente adequada para a revascularização necessária no reparo de feridas dérmicas.

Sugere-se que partículas de carbono com concentração de mais de 50 mg / ml possam ser depositadas nos tecidos [28]. Wang et al. sugeriram que isso pode causar reações inflamatórias devido ao seu diâmetro extremamente pequeno, mas uma grande área de superfície funcional do GO [29]. Em contraste com estudos anteriores, a deposição de GO não foi detectada em nosso estudo. Dada a falta de um efeito colateral óbvio visto aqui, o potencial negativo das nanopartículas GO não pode ser suportado. Outros estudos sugeriram no grafeno, incluindo resposta biológica e teste de segurança [30].

A pesquisa sobre o efeito da interação do óxido de grafeno nas células é uma questão importante. O grafeno é um material biomédico recentemente desenvolvido, cujas propriedades sugerem seu uso em muitas aplicações biológicas. No entanto, a biologia potencial da estrutura bidimensional do carbono / toxicologia do grafeno e as interações biológicas gerais não são totalmente compreendidas, o que exigirá extensos estudos adicionais.

Conclusão

O óxido de grafeno (GO) mostra biocompatibilidade sustentada quando usado como um veículo para a entrega lenta de TIMP-1 recombinante. Demonstrou-se que o TIMP-1 é liberado continuamente do GO por até 40 dias, e a combinação de TIMP-1 com o GO promove a revascularização e regeneração do colágeno em um modelo de regeneração da pele.

Gravador de divisão de carga in situ (CSIR) para exame em tempo real do efeito de carregamento de plasma em processos FinFET BEOL Controlando o crescimento de seleneto de índio de alta uniformidade (In2Se3) Nanofios por meio do processo de recozimento térmico rápido em baixa temperatura