Quimioterapia Direcionada: Nanopartículas de Sílica Mesoporosa Funcionalizadas com Aptâmero Entregam Doxorrubicina Diretamente a Células Leucêmicas

Resumo

Como entregar fármacos quimioterápicos eficiente e seletivamente a células tumorais para melhorar eficácia terapêutica permanece problema difícil. Construímos aqui sistema eficiente de entrega de fármaco direcionado a células (Sgc8-MSN/Dox) baseado em nanopartículas de sílica mesoporosa modificadas com aptâmero que conta com habilidade direcionamento tumoral do aptâmero Sgc8 para entregar doxorrubicina (Dox) a células leucêmicas de forma direcionada, melhorando eficácia terapêutica e reduzindo toxicidade. Neste trabalho, Sgc8-MSN/Dox mostrou liberação sustentada de Dox, e direcionaram e mataram eficientemente células leucêmicas linfócitos T agudas humanas CCRF-CEM, sugerindo potencial como terapia contra câncer.

Introdução

Leucemia linfoblástica aguda (LLA) é tumor maligno heterogêneo que seriamente ameaça saúde humana. Cerca de 6000 casos LLA diagnosticados anualmente nos EUA, especialmente em crianças e adolescentes. LLA é câncer mais comum entre crianças e causa mais comum morte por câncer antes dos 20 anos.

Quimiorradioterapia e transplante células-tronco hematopoiéticas medula óssea são tratamentos padrão para LLA. Radioterapia associada a efeitos colaterais sistêmicos substanciais e locais ótimos exposição incertos. Transplante medula óssea frequentemente não viável por custo, idade paciente, e falta medula doadora. Quimioterapia pode ser eficaz eliminando focos distantes e prevenindo recorrência, mas apenas fração da maioria fármacos anti-tumor atinge tumores via circulação. Isso resulta em baixa biodisponibilidade fármaco e pobre seletividade para células doentes sobre normais, aumentando risco reações adversas sérias e resistência fármaco.

Sistemas nano-entrega fármaco podem fornecer entrega muito mais eficaz e direcionada fármacos anti-tumor que fármacos sozinhos, incluindo liberação fármaco gatilhada por condições específicas microambiente tumoral. Entre tais sistemas, nanopartículas sílica mesoporosa (MSNs) atraíram atenção por sua grande superfície modificável; seu volume poro ajustável, capaz carregar diferentes quantidades e tipos fármacos; e sua boa biocompatibilidade. Modificações superfície com grupos funcionais responsivos permitem criação MSNs que liberam fármaco sob condições específicas, enquanto modificações com moléculas direcionamento levam MSNs entregar fármaco seletivamente tecido desejado.

Um tipo molécula direcionamento compatível com MSNs são aptâmeros, que são DNA ou RNA fita simples atuando como "anticorpos químicos" para ligar específica e firmemente a alvos. Aptâmeros são menores e mais fáceis preparar e modificar que anticorpos monoclonais, penetram tecido melhor e mostram menor toxicidade e imunogenicidade. Portanto, aptâmeros amplamente usados para detecção tumor e quimioterapia direcionada. Método SELEX usado identificar aptâmero Sgc8 que liga especificamente a células CEM leucemia linfócitos T agudas humanas. Sgc8 reconhece proteína tirosina quinase-7 (PTK-7) na membrana celular CEM. Adicionar Sgc8 a fármacos quimioterápicos e certos nanomateriais pode melhorar direcionamento e morte células leucêmicas.

Projetamos sistema nanopartículas sílica fluorescentes modificadas aptâmero Sgc8 (Sgc8-FSNPs) para detectar células leucêmicas com alta sensibilidade e especificidade, que provam úteis não só diagnóstico leucemia mas também entrega direcionada fármacos anti-leucemia. Baseado neste trabalho, presente estudo encapsulou doxorrubicina (Dox) em MSNs, que decoramos com Sgc8 (Fig. 1). Resultante Sgc8-MSN/Dox mostrou boa morfologia e tamanho para entrega fármaco, e nanopartículas foram captadas seletivamente por células leucêmicas em cultura, levando a morte efetiva células tumorais. Objetivo este estudo tentar revelar que aptâmero-modificado nanopartículas sílica mesoporosa podem não só direcionar diagnóstico tumores, mas também matar tumores carregando fármacos, fornecer ideias para teranósticos direcionamento tumor.

Ilustração esquemática nanopartículas sílica mesoporosa modificadas aptâmero Sgc8 para sistema eficiente entrega fármaco direcionado células. Célula CEM, células leucêmicas linfócitos T agudas humanas CCRF-CEM; Dox, doxorrubicina; MSN, nanopartícula sílica modificada; PTK-7, proteína tirosina quinase-7

Materiais e Métodos Experimentais

Reagentes e Materiais

Cloridrato doxorrubicina (Dox) adquirido Beijing Huafeng United Technology (Beijing, China). Tetraetilortossilicato (TEOS) grau analítico e 3-Trimetoxissililpropilamina (APTES) adquiridos Shanghai Chemical Reagent Factory I (Shanghai, China), e brometo cetil-trimetilamônio (CTAB, 99% pureza) de Shanghai Jizhi Biochemical Technology (Shanghai, China). Todos outros reagentes grau analítico. Aptâmero Sgc8 carboxil-modificado (5′-ATCTAACTGCCGCCGCGGGAAAATGTACGGTTAG(T)₁₀-COOH-3′) sintetizado por Shanghai Bioengineering (Shanghai, China).

Linhas Celulares

Seguintes linhas celulares adquiridas Banco Células Academia Chinesa Ciências (Shanghai, China): linha celular leucemia linfócitos T agudas humanas CCRF-CEM, linha linfoma Burkitt B humana Ramos, linha hepática normal humana L02, e linha renal embrionária humana 293T. Todas linhas celulares cultivadas a 37 °C sob 5% CO₂ em DMEM suplementado 10% soro bovino fetal (FBS, Hyclone) e penicilina-estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EUA).

Preparação Sgc8-MSN/Dox

MSNs preparadas conforme descrito dissolvendo 0,50 g CTAB em 240 mL água ultrapura, adicionando 1,75 ml solução 2 M NaOH, e aquecendo a 80 °C em banho óleo. Sob agitação forte, 2,50 mL TEOS adicionado lentamente gota a gota, e mistura agitada continuamente 2 h até precipitado branco obtido. Então mistura centrifugada 10.000 rpm por 10 min, sobrenadante removido, precipitado lavado três vezes alternadamente água ultrapura e etanol anidro, e então precipitado seco em estufa vácuo 60 °C durante noite para obter MSNs.

Sgc8-MSN/Dox obtido misturando 0,2365-g MSNs em balão três gargalos com 23,65 mL etanol absoluto, adicionando 710-µL APTES gota a gota, e refluxando 24 h. Mistura lavada três vezes alternadamente solução metanol-HCl (4:1) e água desionizada, então seca render MSNs-NH₂. Temperatura ambiente, material MSNs-NH2 colocado em tubo centrifugação 10-mL e disperso quantidade adequada tampão fosfato salino (PBS), então Dox (5 mg/mL) adicionado gota a gota, e mistura agitada 24 h. Finalmente, aptâmero Sgc8 carboxil-modificado (100 nM/mL) adicionado, e mistura agitada 1 h, centrifugada, e lavada com PBS até ficar incolor, resultando Sgc8-MSN/Dox.

Caracterização Sgc8-MSN/Dox

Padrões difração raios X (DRX) nanopartículas medidos por difratômetro XRD D4 (Bruker Inc., Alemanha). Isotermas adsorção-dessorção N2 medidas por analisador área superficial específica e tamanho poro (TriStar 3000, GA Inc., EUA). Áreas superficiais BET calculadas a partir gráfico BET. Distribuição tamanho poro estimada ramo adsorção isotermas pelo método BJH. Tamanho partícula e potencial eletrostático medidos usando analisador espalhamento luz dinâmico Nano S (Malvern Instruments, UK). Medidas realizadas três vezes cada amostra e médias. Tamanho partícula e morfologia também avaliados por microscopia eletrônica transmissão (H-7650, Tokyo, Japão) voltagem aceleração feixe elétron 100 kV. Enquanto isso, conjugação aptâmero Sgc8 superfície MSN avaliada por espectroscopia FT-IR (Nicolet-5700, EUA). Para detectar eficiência aptâmero-modificado MSN/Dox, coletamos sobrenadante lavagem processo preparação Sgc8-MSN/Dox e medimos valor absorção ultravioleta 260 nm, e então usando método curva padrão determinar quantidade aptâmero não ligado. Assim quantidade modificação aptâmero pode ser calculada subtraindo quantidade não ligado quantidade total adicionada.

Liberação Dox de Sgc8-MSN/Dox

Liberação Dox de Sgc8-MSN/Dox medida in vitro da seguinte forma. Sgc8-MSN/Dox (10 mg) dissolvido em 10 mL tampão pH 5,0 ou 7,4 a 37 °C e agitado 100 rpm. Tempos predeterminados, amostras removidas, centrifugadas 5000 rpm por 10 min, e sobrenadante dosado Dox usando espectrofotometria conforme descrito Thermo Scientific Microplate Reader (81 Wyman Street, Waltham, EUA) a 482 nm.

Habilidade Direcionamento Sgc8-MSN/Dox

Células CEM ou Ramos (3 × 10⁶) em PBS adicionadas tubos centrifugação 15-mL e misturadas com Sgc8-MSN/Dox ou MSN/Dox (concentração aptâmero, 200 nM). Tubos incubados 37 °C por 20–30 min, e então células coletadas centrifugação, lavadas 3 vezes PBS, fixadas 4% paraformaldeído 30 min, e lavadas 3 vezes PBS. Células incubadas 5 min com 1 mg/ml DAPI, lavadas 3 vezes PBS e centrifugadas. Pelota celular ressuspensa PBS e colocada lâminas para análise microscopia fluorescência confocal (Nikon DS-Ri1; Tokyo, Japão).

Experimentos separados, células CEM e Ramos (3 × 10⁵) fase crescimento logarítmico ressuspensas mistura 50 µL PBS, 45 µL tampão ligação [PBS suplementado 5 mM MgCl2, 4,5 g/L glicose e 1 mg/ml albumina soro bovino (BSA)], e 10 µL FBS [PBS suplementado 1 mg/ml albumina soro bovino (BSA)] contendo materiais indicados concentração aptâmero 200 nM. Mistura agitada escuro 30 min a 4 °C. Células lavadas tampão lavagem, centrifugadas 1000 rpm 5 min, então lavadas outra 3 vezes. Finalmente, células ressuspensas 500 µL tampão lavagem e analisadas citometria fluxo (Beckman Coulter Epics X L; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EUA).

Citotoxicidade MSNs

Citotoxicidade MSNs sem Dox ou aptâmero avaliada usando método MTT. Células CEM, Ramos, 293T, e L-02 fase crescimento logarítmico adicionadas placas 96-poços (1,5 × 10⁴/poço). MSNs (100 µL) adicionados cada poço, e placas cultivadas incubadora 5% CO₂ a 37 °C por 24 ou 48 h. MTT (20 µL) adicionado cada poço, placas incubadas 37 °C por outro 30 min, então placas centrifugadas 1500 rpm 10 min, e sobrenadantes cultura descartados. DMSO (200 µL) adicionado cada poço, placas agitadas escuro 10 min, e então densidade óptica (OD) a 570 nm medida usando leitor microplacas automatizado. Cada amostra testada seis replicatas, e resultados expressos média ± DP.

Morte Celular por Sgc8-MSN/Dox

Células CEM, Ramos, 293T, e L-02 em placas 96-poços (1 × 10⁵ células por poço) incubadas 24 h com Dox livre, MSN/Dox, ou Sgc8-MSN/Dox em concentrações Dox 1, 5, 10, 15, ou 20 µg/mL. Para confirmar que Sgc8-MSN/Dox de fato direcionado matar células CEM através receptor aptâmero, primeiro incubamos suficiente aptâmero Sgc8 com células CEM 2 h, então incubamos com sgc8-MSN/Dox em concentração Dox 20 µg/ml por 24 h. Viabilidade comparada usando ensaio MTT descrito seção "Citotoxicidade MSNs".

Análise Estatística

Resultados analisados estatisticamente usando teste t Student e análise variância unidirecional com teste diferença menor significância. Todas análises realizadas com GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

Resultados e Discussão

Caracterização Sgc8-MSN/Dox

Dados difração raios X mostram nanopartículas sintetizadas têm pico difração típico poros mesoporosos hexagonais faixa X (Fig. 2a), confirmando estrutura MSN. Para estudar ainda área superficial específica, distribuição tamanho poro, e parâmetros mesoporosos MSN, realizamos teste adsorção-dessorção nitrogênio em MSN. Isotermas adsorção-dessorção N2 MSN (Fig. 2b) exibem isotermas tipo IV característica, indicando características mesoporosas. Área superficial calculada modelo BET 1389 m²/g. Curva BJH mostra distribuição tamanho poro partículas estreita (Fig. 2b, inset). Tamanho poro 5,23 nm, e volume poro 2,51 cm³/g. Grande área superficial específica e volume poro e ricos mesoporos tornam possível ter capacidade carga fármaco mais forte e potencial ser excelente carreador fármaco. Microscopia eletrônica mostrou Sgc8-MSN/Dox ter boa dispersibilidade e tamanho uniforme, com forma esférica ou elíptica (Fig. 3a). Potencial zeta médio MSN/Dox em PBS foi −26,53 mV, que diminuiu para −33,87 mV em Sgc8-MSN/Dox (Fig. 3b), refletindo carga negativa aptâmero Sgc8. Canais poro na superfície silício mesoporoso observados. Em PBS, MSN/Dox mostrou tamanho partícula hidratação médio 98,35 nm, que aumentou para 103,24 nm após ligar aptâmero Sgc8 fazer Sgc8-MSN/Dox (Fig. 3 c, d). Para confirmar conjugação bem-sucedida Sgc8-MSN/Dox, análise espectroscopia FT-IR realizada. Espectro infravermelho mostrado Fig. 3 e. Picos 3400 cm⁻¹, 1100 cm⁻¹, e 500 cm⁻¹ picos característicos sílica. Pico ~2400 cm⁻¹ pico agente template CTAB. Pico ~1600 cm⁻¹ pico NH₂. Pico aparecendo ~1700 cm⁻¹ considerado pico estiramento ligação C=O característico base cluster Dox carregado MSNs. Novo pico 1650 cm⁻¹ devido base Schiff (–C=N–) gerada reação Sgc8 com NH2-MSN/Dox. Estas evidências provam sistema entrega fármaco Sgc8-MSN/Dox preparado com sucesso. Para detectar eficiência aptâmero-modificado Sgc8-MSN/Dox, usamos espectrofotômetro ultravioleta medir densidade absorção (OD) aptâmero 260 nm, e calculamos eficiência modificação aptâmero nanopartícula baseada mudança valor OD antes e depois modificação aptâmero superfície nanopartícula. Espectros absorção ultravioleta-visível (UV-Vis) solução aptâmero e sobrenadante mostrados Fig. 3e. Segundo cálculo, quantidade modificação aptâmero Sgc8 Sgc8-MSN/Dox cerca 6,87 nmol mg^–1 Sgc8-MSN/Dox.

a DRX e b isotermas sorção nitrogênio MSN; (inset) Volume poro e gráficos distribuição tamanho poro MSN

Caracterização nanomateriais. a Micrografia eletrônica Sgc8-MSN/Dox. b Diagrama potencial nanopartículas. Distribuição tamanho partícula c MSN/Dox e d Sgc8-MSN/Dox. e Espectros FT-IR nanomateriais: a MSN, b MSN/Dox, e c Sgc8-MSN/Dox. f Espectros UV-Vis a solução aptâmero Sgc8, b sobrenadante lavagem processo preparação Sgc8-MSN/Dox

Liberação Dox de Sgc8-MSN/Dox In Vitro

MSN/Dox e Sgc8-MSN/Dox liberaram carga fármaco lentamente a pH 7,4: não mais 50% fármaco liberado dentro 96 h (Fig. 4). Isso indica MSNs podem suportar liberação fármaco lenta durando 96 h, provavelmente porque fármaco espalha através canais internos silício mesoporoso. Liberação muito mais rápida pH 5,0, com taxas liberação atingindo 60% por 48 h e >80% por 96 h. Curvas liberação Dox quase idênticas Sgc8-MSN/Dox e MSN/Dox, sugerindo ligação aptâmero não afeta estrutura nanopartícula. Maior liberação pH ácido útil porque células tumorais em ambiente levemente ácido e nanopartículas revestidas Sgc internalizadas endossomos. Nossos resultados apoiam ideia silício mesoporoso pode acelerar liberação fármaco ambiente ácido.

Liberação doxorrubicina Sgc8-MSN/Dox e MSN/Dox in vitro pH 5,0 ou 7,4

Direcionamento Células Leucêmicas por Sgc8-MSN/Dox In Vitro

Examinamos captação nanopartículas por células leucêmicas linfócitos T CEM como células-alvo e células linfoma B Ramos como não-alvo. Baseado citometria fluxo, não-alvo internalizaram MSN/Dox extensão similar Sgc8-MSN/Dox, enquanto alvo internalizaram nanopartículas revestidas aptâmero extensão muito maior que MSN/Dox (Fig. 5a). Consistente estes resultados, microscopia fluorescência confocal mostrou forte fluorescência Dox (vermelho) dentro células CEM expostas Sgc8-MSN/Dox, mas não dentro células Ramos tratadas mesma forma (Fig. 5b). Estes resultados refletem habilidade estabelecida aptâmero Sgc8 direcionar células leucêmicas. Sgc8 reconhece PTK-7 superfície células CEM, recrutando nanopartículas superfície e tornando captação mais eficiente. Nossos resultados sugerem Sgc8-MSN/Dox pode direcionar células câncer expressando PTK-7 sítios primários bem como secundários ou em circulação, tornando útil controle metástase. Pode ser possível expandir abordagem MSN outros aptâmeros com outras especificidades direcionamento.

Direcionamento in vitro células leucêmicas Sgc8-MSN/Dox analisado usando a citometria fluxo e b microscopia fluorescência. Células CCRF-CEM e Romas incubadas MSN/Dox ou Sgc8-MSN/Dox, e então coradas DAPI (azul). Dox apareceu vermelho. Barra escala, 100 µm

Citotoxicidade MSNs

Dada importância biossegurança sistemas nano-entrega fármaco, primeiro examinamos toxicidade MSNs em branco contra CEM, Ramos, 293T, e L-02 células. Viabilidade todas linhas celulares permaneceu acima 90% mesmo após incubação 48-h até 100 µg/mL MSNs (Fig. 6). Isso sugere MSNs mostram citotoxicidade quase insignificante.

Citotoxicidade in vitro MSNs. a CEM, b Ramos, c 293T, e d L-02 células tratadas concentrações indicadas MSN, e viabilidade celular medida

Em seguida, investigamos habilidade Sgc8-MSN/Dox matar células tumorais alvo (células CEM) e não-alvo (Ramos, 293T, e L-02). Células incubadas diferentes concentrações Dox livre, MSN/Dox, ou Sgc8-MSN/Dox por 24 h, e então viabilidade avaliada usando ensaio MTT. Contra células CEM alvo, Dox livre mostrou toxicidade ligeiramente maior que duas formulações MSN, enquanto Sgc8-MSN/Dox foi significativamente mais tóxica que MSN/Dox mesma concentração fármaco (Fig. 7). Contra Ramos, 293T, e L-02, Dox livre mostrou toxicidade significativamente maior que formulações MSN, que mostraram toxicidade similar com ou sem Sgc8. Para confirmar que Sgc8-MSN/Dox de fato direcionado matar células CEM através receptor aptâmero PTK-7, primeiro incubamos suficiente aptâmero Sgc8 com células CEM 2 h bloquear sítio ligação e então co-incubamos com Sgc8-MSN/Dox. Ensaio MTT mostrou aptâmero livre sem toxicidade células CEM, e após suficiente aptâmero Sgc8 bloqueou sítio ligação, Sgc8-MSN/Dox mostrou toxicidade significativamente menor que grupo Sgc8-MSN/Dox livre (Fig. 7e). Estes resultados destacam habilidade aptâmero direcionar entrega fármaco e aumentar morte células alvo. Tal direcionamento pode ajudar reduzir captação fármaco por não-células alvo bem como permitir uso doses menores; ambos efeitos podem reduzir risco efeitos colaterais tóxicos.

Habilidade Dox livre, MSN/Dox, e Sgc8-MSN/Dox matar a células CEM, b células Ramos, c células 293T, e d células L-02. e Habilidade morte células CEM aptâmero livre, bloqueio (células CEM primeiro incubam suficiente Sgc8 2 h, então incubadas com sgc8-MSN/Dox), e Sgc8-MSN/Dox

Aptâmeros podem ser usados como moléculas guia para entrega fármacos e várias macromoléculas ou nanocarreadores a células tumorais, às vezes aptâmero também pode trabalhar como terapêutico. Por exemplo, aptâmero AS1411 pode ligar nucleolina especificamente, e nucleolina expressa em e na superfície células tumorais envolvidas diferenciação celular, sobrevivência, inflamação, angiogênese, e desenvolvimento tumor. Aptâmero AS1411 pode induzir inibição crescimento modelos xenoenxerto (câncer renal, câncer pulmão, câncer mama MX1, e câncer pancreático) ligando nucleolina. Além, lipossomos carregados doxorrubicina funcionalizados aptâmero AS1411 (Apt-Dox-Lip) testados câncer mama, resultados mostraram grande potencial aplicação. Aptâmeros bem-sucedidos ampla gama ensaios clínicos devido excelentes propriedades. Primeiro aptâmero aprovado FDA 2005, desde então, mais aptâmeros alcançaram ensaios clínicos. Aptâmeros aplicados ensaios clínicos anti-tumor, incluindo câncer próstata, câncer pulmão, leucemia mieloide aguda, e assim por diante. Não dúvida que estes ensaios clínicos aptâmero-relacionados dão nova esperança mudar estilo convencional terapia.

Anos recentes, aptâmeros combinados diferentes nanomateriais terapia direcionada tumores. Vê-se aptâmeros têm capacidades extraordinárias reconhecimento molecular e direcionamento. Contudo, ainda alguns problemas não podem ser ignorados desenvolvimento aplicação aptâmeros, como se nuclease afeta estabilidade aptâmeros in vivo, se aptâmeros substâncias pequenas moleculares entram corpo e fáceis removidos rapidamente sistema renal, e se desempenho direcionamento real in vivo viável. Para explorar pleno potencial nanomateriais baseados aptâmero direcionados, mais testes in vivo e experimentos clinicamente relevantes permanecem foco pesquisa atual. Ao mesmo tempo, teranósticos tumores direção importante desenvolvimento futuro, e design e preparação mais materiais biológicos multifuncionais são indubitavelmente tendência desenvolvimento.

Conclusão

Construímos sistema entrega MSN modificado aptâmero que pode eficientemente direcionar células leucêmicas e promover captação Dox. Este direcionamento, acoplado com habilidade MSNs liberar carga fármaco lenta e preferencialmente sob condições ácidas, pode ajudar sistema entrega acumular sítios tumorais e matar células continuamente. Pode ser possível direcionar quase qualquer tipo células tumorais com esta abordagem MSN selecionando aptâmeros adequados. Mas não pode ser ignorado que Sgc8-MSN/Dox também pode ter problemas mencionados acima, e sua estabilidade in vivo e direcionamento ainda precisam estudo adicional. Próximo, combinaremos pesquisa prévia carregar sistema entrega fármaco com reagentes diagnóstico e fármacos, dando função teranóstica diagnóstico direcionado e tratamento direcionado.

Abreviações

MSN:

Nanopartículas sílica mesoporosa

Dox:

Doxorrubicina

Sgc8-MSN/Dox:

Sistema entrega fármaco sílica mesoporosa modificado aptâmero

PTK-7:

Proteína tirosina quinase-7

TEOS:

Tetraetilortossilicato

APTES:

3-Trimetoxissililpropilamina

CTAB:

Brometo cetil-trimetilamônio

CEM:

Células CCRF-CEM

PBS:

Salina tamponada fosfato