Eficácia de Soluções In-situ de Nanopartículas de Quitosana-Prata contra Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA)

Resumo

Contexto: Desenvolver novos terapêuticos contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um desafio médico premente. Antissépticos, ao contrário de antibióticos, podem alvejar cepas resistentes enquanto preservam a microbiota normal.

Materiais e Métodos: Avaliamos a potência antibacteriana de soluções de nanopartículas de quitosana-prata (Ag NP) preparadas in-situ, variando a razão quitosana/Ag. Ag NPs foram sintetizadas via rota de química verde usando extrato de rizoma de gengibre e ácido ascórbico; modificação de superfície com brometo de cetrimônio (CTAB) também foi explorada para melhorar dispersibilidade. As nanopartículas resultantes e misturas quitosana-Ag NP foram caracterizadas por difração de raios-X (DRX), microscopia eletrônica de transmissão (MET), espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia UV-Vis.

Resultados e Conclusões: DRX, FTIR, UV-Vis e MET confirmaram alta pureza e composição esperada de quitosana e Ag NPs. Soluções quitosana-Ag NP demonstraram eficácia antimicrobiana superior comparada aos seus componentes individuais. Em contraste, preparação in-situ de soluções quitosana-Ag NP/CTAB levou a precipitação e não pôde ser avaliada. Estes achados sugerem que misturas quitosana-Ag NP são estratégia promissora para combater bactérias resistentes a fármacos.

Introdução

Infecções permanecem causa líder de morbidade e mortalidade global, impulsionada em parte pelo uso generalizado de antibióticos que seleciona organismos resistentes como MRSA. Infecções por MRSA abrangem espectro desde lesões cutâneas superficiais até condições fatais como pneumonia, endocardite e septicemia, impondo ônus econômico substancial (≈$3-4 bilhões anualmente). Novas estratégias antibacterianas são urgentemente necessárias. Antissépticos oferecem atividade sustentada contra cepas resistentes sem desequilibrar microbiota do hospedeiro. Combinar mecanismos antibacterianos distintos — por exemplo, metais e polímeros naturais — via nanomateriais híbridos apresenta abordagem inovadora para derrotar bactérias resistentes.

Prata é há muito reconhecida por suas propriedades antimicrobianas, e nanopartículas de prata (Ag NPs) exibem potentes efeitos antibacterianos e antifúngicos. Elas podem atuar sinergicamente com antibióticos convencionais mas também podem sofrer de agregação, liberação descontrolada de íons e citotoxicidade. Incorporar Ag NPs em biopolímeros como quitosana pode melhorar estabilidade e atividade antimicrobiana. Quitosana, derivada de quitina, é biocompatível, bacteriostática e adequada para aplicações médicas. Modificação de superfície de Ag NPs com CTAB pode melhorar estabilidade de dispersão, embora seu impacto na eficácia antibacteriana não seja totalmente compreendido.

O objetivo deste estudo foi identificar a razão ideal quitosana-Ag NP que produza atividade máxima contra isolados clínicos de MRSA.

Métodos

Materiais

Nitrato de prata, ácido L-ascórbico e CTAB (C16H33N(CH3)3Br) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Rizoma de gengibre foi obtido localmente. Quitosana (200 kDa, 82% desacetilação) foi obtida da Bioprogress. Água ultrapura (resistividade > 17 MΩ cm⁻¹) e meios microbiológicos padrão foram usados throughout.

Preparação In-situ de Soluções Quitosana/Ag NP

Ag NPs foram primeiro sintetizadas reduzindo nitrato de prata com extrato de gengibre e ácido ascórbico sob refluxo a 60 °C por 1,5 h. As partículas resultantes foram lavadas por centrifugação até pH neutro. Para Ag NPs modificadas com CTAB (Ag/CTAB NPs), 3 ml de dispersão de Ag NP a 76,4 mg ml⁻¹ foi misturada com 20 ml de solução de CTAB a 6,7 mg ml⁻¹ e sonicada por 3 h. Carga de CTAB foi quantificada por UV-Vis a 190 nm.

Soluções de quitosana (1% p/v) foram preparadas dissolvendo 1 g de quitosana em 100 ml de ácido acético 2% por 24 h à temperatura ambiente. Soluções quitosana/Ag NP foram então formadas adicionando volumes variados de quitosana a dispersões de Ag NP, gerando uma gama de concentrações de quitosana e Ag NP (Tabela 1).

Caracterização Físico-Química

DRX foi realizado em difratômetro Empyrean (Cu Kα, 1,54 Å). Imagens MET usaram JEM-ARM-200F a 200 kV. Espectros FTIR foram registrados em espectrômetro Tensor 27 com pastilhas de KBr (1 mg amostra / 200 mg KBr). Absorção UV-Vis foi medida em espectrômetro Lambda 950 (200-800 nm). Todas as medições foram replicadas pelo menos três vezes.

Testes Microbiológicos

Setenta swabs de pacientes (nasal e garganta) foram cultivados em ágar sangue. Cinquenta cepas de Staphylococcus aureus foram isoladas e confirmadas por testes bioquímicos padrão. Suscetibilidade a antibióticos foi avaliada pelo método de difusão em disco Kirby-Bauer em ágar Mueller-Hinton para azitromicina, levofloxacino, claritromicina, ciprofloxacino e meticilina. Cepas MRSA foram definidas segundo diretrizes CLSI.

Concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de quitosana, Ag NPs e soluções quitosana-Ag NP foram determinadas por macrodiluição em caldo. Sete diluições seriadas de duas vezes de cada preparação de nanopartículas foram preparadas em caldo nutriente, e 1, 2 ou 3 ml de quitosana 1% foi adicionado a cada tubo. Após inoculação com 100 µl de suspensão bacteriana padronizada (≈1,5 × 10⁸ UFC ml⁻¹) e incubação de 24 h a 37 °C, a menor concentração prevenindo crescimento visível foi registrada como CIM.

Resultados

Caracterização de Ag NPs e Quitosana

Adsorção de CTAB em Ag NPs resultou em adsorvidade de 70,0 mg g⁻¹, correspondendo a teor de CTAB de ~6,5%. Padrões de DRX exibiram picos característicos de prata a 38,15°, 44,33°, 64,48°, 77,47° e 81,54° 2Θ, confirmando Ag cristalino. Pico largo (12,00-21,06°) indicou material orgânico residual. Quitosana exibiu picos semicristalinos próximos a 9° e 20° 2Θ. Espectros FTIR revelaram grupos funcionais esperados para quitosana (alargamento O-H/N-H 3450-3200 cm⁻¹, amida I a 1652 cm⁻¹) e Ag NPs (dobramento CO/CH, estiramento C=C/C=O). Espectros UV-Vis de Ag NPs mostraram pico de ressonância de plasmon de superfície em ~387 nm, deslocando para ~417 nm após modificação com CTAB, indicando estabilidade de dispersão melhorada. Imagens MET revelaram Ag NPs predominantemente esféricas de 10-12 nm.

Atividades Antibacterianas

Ag NPs puras e Ag/CTAB NPs exibiram CIMs de 9,6 µg ml⁻¹ contra todas as 10 cepas MRSA. Quitosana sozinha exibiu CIM de 6 µg ml⁻¹, com 60% das cepas inibidas a 3,3-5 µg ml⁻¹. A mistura quitosana-Ag NP alcançou CIMs tão baixas quanto 1,2 µg ml⁻¹ para Ag NPs e 3,3 µg ml⁻¹ para quitosana, representando reduções de 2 a 4 vezes comparadas aos componentes individuais. Tentativas de preparar mistura quitosana-Ag/CTAB resultaram em precipitação e não puderam ser avaliadas.

Discussão

Nossos achados confirmam que mistura in-situ de quitosana com Ag NPs aumenta sinergicamente atividade antibacteriana contra MRSA. As CIMs reduzidas sugerem interação melhorada com células bacterianas, potencialmente através de mecanismos combinados: liberação de íons prata e superfície policatiónica da quitosana desestabilizando membranas. CTAB, embora estabilizando as nanopartículas, diminuiu eficácia antibacteriana e induziu precipitação, indicando que química de superfície criticamente influencia potencial terapêutico. Estudos futuros devem avaliar citotoxicidade da formulação quitosana-Ag NP para determinar dosagem clínica segura.

Conclusões

Soluções in-situ de quitosana-Ag NP exibem atividade marcadamente superior contra MRSA, reduzindo concentrações requeridas até quatro vezes relativo aos seus constituintes individuais. Esta estratégia oferece abordagem promissora, potencialmente personalizada, para combater infecções resistentes a antibióticos. Avaliação adicional de toxicidade esclarecerá aplicabilidade clínica.

Abreviações

Ag NPs

Nanopartículas de prata

CTAB

Brometo de cetrimônio

FTIR

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

MRSA

Staphylococcus aureus resistente à meticilina

TEM

Microscopia eletrônica de transmissão

UV-Vis

Espectroscopia ultravioleta-visível

XRD

Difração de raios-X