Síntese Verde de Nanopartículas de Prata com Extrato de Levedura: Morfologia Controlada e Atividade Antibacteriana Aumentada

Resumo

Biossíntese para preparação de nanopartículas de prata antimicrobianas (Ag NPs) é um método verde sem o uso de agentes redutores e surfactantes citotóxicos. Aqui, Ag NPs com forma controlada e bem dispersas foram biossintetizadas usando extrato de levedura como agentes redutores e de captação. As Ag NPs sintetizadas exibiram forma esférica uniforme e tamanho fino, com tamanho médio de 13,8 nm. As biomoléculas de aminoácidos redutores, ácido alfa-linolênico e carboidratos no extrato de levedura têm papel significativo na formação de Ag NPs, o que foi provado pela análise de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. Além disso, aminoácidos na superfície de Ag NPs carregam cargas negativas líquidas que maximizam as interações de repulsão eletrostática em solução alcalina, fornecendo estabilidade favorável por mais de um ano sem precipitação. As Ag NPs em tratamento combinado com ampicilina reverteram a resistência em células E. coli resistentes à ampicilina. Essas Ag NPs monodispersas poderiam ser uma alternativa promissora para desinfecção de cepas bacterianas multirresistentes, e mostraram citotoxicidade negligenciável e boa biocompatibilidade com células Cos-7.

Introdução

Infecções resistentes a fármacos são uma causa importante de morte e resultaram em risco sério à saúde pública. Adicionalmente, resistência crescente a fármacos antimicrobianos está emergindo como um problema urgente na medicina [1]. Várias cepas de Staphylococcus aureus são resistentes à meticilina e são a causa principal de infecções adquiridas em hospitais. Além disso, outras bactérias resistentes a antibióticos incluem Neisseria gonorrhoeae resistente à penicilina e Escherichia coli (E. coli) multirresistente [2, 3]. Os principais mecanismos de resistência são o aumento de effluxo e a absorção reduzida de antibióticos [4]. Outro mecanismo de resistência a fármacos é a expressão de enzimas que modificam a estrutura molecular de antibióticos [5]. Embora muito esforço tenha sido focado no desenvolvimento da próxima geração de agentes antimicrobianos, há uma necessidade aumentada de métodos superiores de desinfecção.

Nanopartículas de prata (Ag NPs) têm sido usadas em muitas aplicações, como transportadores de proteínas, radiosensibilizadores, melhoria de eficiência de células de combustível solar e agentes antibacterianos [6-8]. Nanopartículas, incluindo nanopartículas contendo metal, Ag NPs são as mais amplamente usadas como agentes antimicrobianos [9]. Na realidade, nanopartículas de prata mostraram atividade antimicrobiana significativa contra cepas bacterianas mas citotoxicidade negligenciável a células animais [10, 11]. Além disso, Ag NPs exibiram atividade antimicrobiana contra fungos, certos vírus e cepas bacterianas resistentes a antibióticos. Com relação ao seu mecanismo de ação, supressão de replicação de DNA, bloqueio da diferença de potencial elétrico necessária em membranas citoplasmáticas e supressão da cadeia respiratória são os principais mecanismos de ação de Ag NPs. Assim, o tamanho, estrutura de superfície e formas controladas de Ag NPs desempenham papéis cruciais em sua atividade antimicrobiana e outras aplicações. O método geral para preparação de Ag NPs envolve a redução de íons de prata na presença de um surfactante apropriado para alcançar o crescimento controlado de Ag NPs [12]. A maioria dos agentes redutores e surfactantes mostra citotoxicidade a células de tecido humano e potencialmente causa contaminação ambiental. Portanto, mais esforço no desenvolvimento de métodos verdes para preparação de Ag NPs com forma controlada é essencial.

Neste trabalho, apresentamos uma nova rota para a biossíntese de Ag NPs utilizando extrato de levedura. Durante o processo, o extrato de levedura fornece agentes redutores e de captação, incluindo aminoácidos, vitaminas e carboidratos, enquanto íons de prata servem como aceitadores de elétrons. Como resultado, a estabilidade favorável fornecida pelos agentes de captação orgânicos na superfície, as Ag NPs monodispersas, podem ser preservadas por mais de um ano sem precipitação. Foi encontrado que Ag NPs exibiram atividade antibacteriana superior comparada à ampicilina contra células E. coli resistentes à ampicilina. Comparado a métodos sintéticos convencionais, a abordagem de biossíntese apresentada aqui é biocompatível, custo-efetiva e ambientalmente benigna. Além disso, as Ag NPs com forma controlada e bem dispersas exibiram bons efeitos antibacterianos contra E. coli.

Métodos

Materiais

Nitrato de prata (AgNO₃), sacarose (C₁₂H₂₂O₁₁), cloreto de sódio (NaCl) e hidróxido de sódio (NaOH) foram comprados da Sinopharm Co., Ltd. Levedura de padeiro seca foi obtida da AB/MAURI Co., Ltd. E. coli foi comprado da TransGen Biotech Co., Ltd. O kit CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) foi comprado da Promega Biotech Co., Ltd. Plasmid pcDNA3.4, buffer de amostra 1 × NuPAGE® LDS, meio Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) e soro fetal bovino (FBS) foram comprados da Thermo Fisher Scientific Inc. Ampicilina e meio Luria-Bertani (LB) foram comprados da Sangon Biotech Co., Ltd. Todos os químicos foram reagentes analíticos e usados sem purificação adicional. Água ultrapura desionizada (18,2 MΩ·cm) foi usada em todos os experimentos.

Síntese de Ag NPs

As células de levedura estocadas foram inoculadas no meio Luria-Bertani (LB) e agitadas a aproximadamente 150 rpm durante a noite a 25 °C para ativação. Então, as células de levedura ativadas foram lavadas com solução salina 0,9% e dispersas em solução de sacarose 2% com agitação a aproximadamente 150 rpm por 6 h a 25 °C. Finalmente, o extrato de levedura livre de células foi coletado para a biossíntese de Ag NPs por centrifugação a 2000 rpm por 5 min. Durante o processo biossintético, o valor de pH do extrato de levedura foi ajustado para 10 com solução de NaOH, e então a solução de AgNO₃ foi gradualmente adicionada à solução acima sob agitação magnética vigorosa. Por fim, as Ag NPs obtidas foram dialisadas com membranas de diálise de 1 kDa por 5 dias e liofilizadas para posterior caracterização.

Caracterizações

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de Ag NPs foram observadas no microscópio JEM-2100 com tensão de aceleração de 200 kV (JEOL, Japão). Imagens de microscopia eletrônica de varredura (SEM) foram obtidas em um microscópio eletrônico de varredura Carl Zeiss ULTRA plus (Carl Zeiss, Alemanha) equipado com espectrômetro de dispersão de energia (EDS) operado a 20 kV. Espectros de absorção ultravioleta-visível (UV-Vis) foram registrados em um espectrofotômetro Lambda 950 UV/Vis/NIR (Perkin-Elmer, EUA). Padrões de difração de raios X em pó (XRD) foram obtidos usando um instrumento D8 Advance (Bruker, Alemanha). Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foi registrada de 4000-500 cm⁻¹ com amostras preparadas como pastilhas de KBr em um espectrômetro FTIR Vertex 70 (Bruker, Alemanha). O potencial zeta de Ag NPs foi medido com um Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, Reino Unido) a 25 °C. Os elementos de superfície nas Ag NPs foram identificados por espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) usando um instrumento Kratos AXIS Ultra DLD com fonte Al Kα monocromática (1486,6 eV) (Shimadzu, Japão). Os componentes de aminoácidos foram analisados com um analisador de aminoácidos de alta velocidade L-8900 (Hitachi, Japão).

Ensaio de Citotoxicidade Celular

Para explorar a biocompatibilidade das Ag NPs preparadas, um ensaio MTS foi empregado para avaliar a citotoxicidade celular das Ag NPs [13]. Células Cos-7 foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% FBS meio completo em uma incubadora com atmosfera umidificada contendo 5% CO₂ a 37 °C. As células foram semeadas em placas de 96 poços de fundo plano a uma densidade de 10000 células por poço e cultivadas por 24 h. Então, o meio de crescimento foi substituído por meio DMEM fresco contendo diferentes concentrações de Ag NPs. Após incubação por mais 24 h, as células relativamente viáveis foram determinadas por MTS. A absorbância foi medida a 490 nm usando um leitor de microplacas SpectraMax® M5 (Molecular Devices, EUA). Células não tratadas em meio DMEM foram usadas como controle.

Ensaio SDS-PAGE

SDS-PAGE padrão foi realizado com gel separador a 10% (p/v) e gel de empilhamento a 4%. As amostras foram fervidas por 5 min com 1 × NuPAGE® LDS Sample Buffer e centrifugadas a 12000 rpm por 5 min antes da aplicação nos géis. O marcador de proteína padrão foi usado como controle de referência. Os géis foram corados com 0,5% Azul Coomassie. Imagens dos géis foram registradas com sistemas de imagem de gel GelDoc XR⁺ (Bio-Rad, EUA).

Estudos de Atividade Antimicrobiana

Para determinar a atividade antimicrobiana, as Ag NPs sintetizadas foram testadas para atividade bactericida contra E. coli [14]. Uma única colônia de E. coli foi cultivada durante a noite a 37 °C em meio LB em um agitador orbital a 150 rpm. Colônias foram ajustadas a um OD de 0,01–0,02 a 600 nm com meio LB fresco. Então, 100 μL de diluições seriais de Ag NPs foram preenchidos em microplacas de 96 poços. As microplacas foram então inoculadas com 100 μL de solução de E. coli diluída e incubadas por 16 h a 37 °C. A viabilidade de E. coli foi determinada pela medição da absorbância a 600 nm com um leitor de microplacas SpectraMax® M5 (Molecular Devices, EUA). Uma análise de curso temporal foi realizada para avaliar a sensibilidade antibacteriana contra E. coli ao longo do tempo. Finalmente, 100 μL de solução de E. coli foi adicionada a tubos estéreis contendo 10 e 20 μg/mL Ag NPs, respectivamente. A absorbância a 600 nm foi medida com um leitor de microplacas SpectraMax® M5 (Molecular Devices, EUA) após 1, 2, 4 e 6 h.

Ensaio de unidade formadora de colônia foi introduzido para investigar as Ag NPs contra células bacterianas resistentes a antibióticos. E. coli expressa estavelmente plasmídeo pcDNA3.4 contendo o gene β-lactamase que confere resistência à ampicilina como modelo. Quando as células E. coli resistentes à ampicilina (E. coli-Amp⁺) atingiram fase de crescimento log, as células E. coli-Amp⁺ foram cultivadas em placa de ágar LB no tratamento com ampicilina sozinha ou no tratamento combinatório com Ag NPs e incubadas a 37 °C por 18 h. O número de colônias E. coli-Amp⁺ formadas em placas LB foi calculado. Todos os ensaios foram realizados pelo menos três vezes.

Resultados e Discussão

Síntese de Ag NPs

Como ilustrado esquematicamente no Esquema 1, a preparação de Ag NPs começou com a auto-montagem de biomoléculas no extrato de levedura para formar micelas de levedura. Então, Ag⁺ foi reduzido in situ pelos agentes redutores no extrato de levedura, incluindo aminoácidos, vitaminas e carboidratos. As nanopartículas de Ag formadas foram estabilizadas pelas biomoléculas. O revestimento de superfície nas Ag NPs aumentou a afinidade em direção à membrana bacteriana, aumentando a permeabilidade da parede celular. A interação entre Ag NPs e peptidoglicano mudou a configuração do peptidoglicano, finalmente levando ao processo de apoptose para danificar as bactérias.

Caracterização Estrutural de Ag NPs

Como mostrado na Fig. 1a, a imagem SEM típica mostrou que as Ag NPs sintetizadas têm forma esférica e tamanho fino. O EDX confirmou a formação de Ag NPs (Fig. 1b). Um pico de absorção óptica forte foi observado a aproximadamente 3 keV, que é um pico de absorção óptica típico de nanocristalitos de prata para ressonância de plasma de superfície. As quantidades menores de oxigênio e carbono poderiam ser atribuídas à fina camada de captação orgânica nas Ag NPs sintetizadas. A reação de solução AgNO₃ com NaOH leva à formação de uma pequena quantidade de Ag₂O. Portanto, uma pequena quantidade de O também pode ser atribuída à presença de Ag₂O. A morfologia e tamanho das Ag NPs foram further caracterizados por TEM de alta resolução (HRTEM). As Ag NPs variaram em diâmetro de 10,3 a 18,9 nm (Fig. 1c), com tamanho médio de 13,8 nm (Fig. 1d). O tamanho, forma e química de superfície de Ag NPs mostraram efeito importante na atividade antimicrobiana. O menor tamanho e maior área de superfície permitiram que as Ag NPs interagissem melhor com a membrana bacteriana para atividade antimicrobiana further aumentada [15-17]. As franjas de rede claras na imagem HRTEM mostraram espaçamento de franja de 0,15 nm (Fig. 2a), que corresponde aos planos (220) de prata. Como mostrado na Fig. 2b, a natureza cristalina das Ag NPs foi demonstrada pelos padrões típicos de difração de área selecionada (SAED), onde os anéis circulares brilhantes correspondem aos planos (311), (220), (200) e (111) [18, 19].

O espectro UV-Vis de Ag NPs exibiu um pico forte a 418 nm, que foi devido à ressonância de plasma de superfície (Fig. 3a). Uma solução amarela de Ag NPs sintetizadas é mostrada na Fig. 3b, que indica a formação de Ag NPs. A análise de padrão XRD das Ag NPs sintetizadas mostrou quatro picos intensos a 77,36°, 64,30°, 43,52° e 38,16°, correspondentes aos planos (311), (220), (200) e (111) para prata, respectivamente (Fig. 3c). Os dados foram confirmados por dados padrão de prata do cartão JCPDS N. 04-0783 [20]. O padrão XRD demonstrou a natureza cristalina das Ag NPs sintetizadas, em concordância com relatório anterior [21]. Análise FTIR foi empregada para caracterizar e identificar as biomoléculas potenciais nas Ag NPs sintetizadas (Fig. 3d). A banda larga a 3405 cm⁻¹ corresponde a alongamento −OH [22]. O pico mais fraco a 2915 cm⁻¹ é atribuído à vibração de alongamento −CH2. A banda a 1655 cm⁻¹ no extrato de levedura é devida à vibração de alongamento C=O de grupos carboxilo, e esta banda desloca para 1573 cm⁻¹ em Ag NPs, devido à interação entre grupos carboxilo e Ag NPs [23]. O pico agudo a 1375 cm⁻¹ é atribuído à vibração de alongamento C–N. As bandas a 1048 cm⁻¹ e 1083 cm⁻¹ são atribuídas às vibrações de alongamento de C–O–C e C–OH, respectivamente [24, 25]. Esses resultados demonstraram que biomoléculas do extrato de levedura foram responsáveis pela biossíntese de Ag NPs. O revestimento de superfície nas Ag NPs afetou a afinidade em direção à membrana bacteriana [26, 27]. Os estados de Ag NPs foram further caracterizados por XPS. Como mostrado na Fig. 4a, a varredura completa do espectro XPS com picos claros foi atribuída a C 1s, Ag 3d, Ag 3p, Ag 3s e O 1s. Os picos Ag 3d (5/2) e Ag 3d (3/2) foram observados em energias de ligação de aproximadamente 368,5 e 374,5 eV, respectivamente (Fig. 4b). Este valor de divisão de energia de 6,0 eV demonstrou a formação de Ag NPs [28, 29].

A carga de superfície de Ag NPs foi determinada pelo instrumento Malvern Zeta Nano ZS-90, que é um parâmetro importante de estabilidade e dispersão de soluções coloidais. O potencial zeta é o potencial eletrostático de superfície na fronteira entre a camada difusa e compacta de nanopartículas, e que é um indicador para aplicações de polímeros biomédicos [30]. Como mostrado no Arquivo Adicional 1: Fig. S1, a um valor de pH mais baixo de 3, o potencial zeta de Ag NPs revelou uma carga ligeiramente negativa (−3,2 mV). O potencial zeta de Ag NPs diminuiu monoticamente de −12,1 mV a pH 7,0 para −24,4 mV a pH 11,0, o que confirmou os grupos carregados negativamente na superfície de Ag NPs. Gao et al. relataram que a dispersão e estabilidade de Ag NPs atribuem-se principalmente à carga de superfície [31]. A presença de grupos carregados negativamente melhora a estabilidade e dispersão de Ag NPs em soluções aquosas [32].

Citotoxicidade de Ag NPs e Análise de Biomoléculas

A biocompatibilidade das Ag NPs sintetizadas é importante para sua further aplicação biomédica. Para investigar a citotoxicidade das Ag NPs, a viabilidade celular de células Cos-7 foi detectada pelo ensaio MTS. As células Cos-7 foram incubadas com Ag NPs em diferentes concentrações por 24 h. Como mostrado na Fig. 5a, nenhuma citotoxicidade significativa foi revelada quando as células foram tratadas com Ag NPs em concentrações tão altas quanto 200 μg/mL. Pode-se concluir que as Ag NPs mostraram citotoxicidade negligenciável e boa biocompatibilidade para com células Cos-7.

Para explorar os mecanismos sintéticos das Ag NPs sintetizadas, analisamos biomoléculas na superfície de Ag NPs e extrato de levedura. Como mostrado na Fig. 5b, a análise SDS-PAGE mostrou nenhuma proteína detectável ou marginal na superfície das Ag NPs sintetizadas ou no extrato de levedura. Determinamos further as biomoléculas no extrato de levedura com um analisador de aminoácidos de alta velocidade. Como resumido no Arquivo Adicional 1: Tabela S1 de informação suplementar, há aproximadamente 22 tipos de aminoácidos no extrato de levedura que são ricos em ácido glutâmico, ácido γ-aminobutírico, ornitina e ácido alfa-linolênico. O ponto isoelétrico desses aminoácidos é aproximadamente 6, exceto os de lisina e arginina que são aproximadamente 10~11. Além disso, uma variedade de componentes contendo −NH₂, como ureia, amônia, asparagina e glutamina, poderiam ser encontrados. As biomoléculas de aminoácidos redutores, ácido alfa-linolênico e carboidratos no extrato de levedura têm papel significativo na formação de Ag NPs. Foi relatado que redutase dependente de NADH [33, 34] ou a enzima nitrato redutase está envolvida no processo de redução [35-37] na biossíntese de Ag NPs via extrato de microrganismo.

Biomoléculas do extrato de levedura desempenham parte decisiva na formação de Ag NPs protegendo-as de agregação. Estabilizadores de biomoléculas ajudam a prevenir reações redundantes entre Ag NPs [38]. As moléculas anfóteras de aminoácidos contêm grupos tanto básicos quanto ácidos. A carga líquida desses compostos de aminoácidos pode ser negativa ou positiva dependendo das mudanças de pH da solução de extrato de levedura, o que further afeta a capacidade de ligação durante a síntese de Ag NPs [39]. Na solução alcalina, aminoácidos na superfície de Ag NPs carregam cargas negativas líquidas que maximizam as interações de repulsão eletrostática [40-42]. As biomoléculas do extrato de levedura atuam como agente de captação e desempenham papel chave no controle da distribuição de tamanho, forma e morfologia na formação de Ag NPs. O valor de pH é um fator importante com efeito na síntese controlada de Ag NPs no estudo. Quando o valor de pH está abaixo de 7, a nucleação ocorre a uma taxa baixa. Ag NPs podem ser formadas em poucos minutos a valores de pH mais altos, e o tamanho de partícula diminui com o aumento dos valores de pH da solução. O equilíbrio ótimo foi demonstrado entre os processos de crescimento e nucleação [43]. Ag NPs instáveis e aglomeradas sempre apresentadas no processo de redução de soluções com valores de pH extremos (> 11) [44].

Atividade Antibacteriana

E. coli foi extensivamente avaliada para atividade antimicrobiana de Ag NPs. O crescimento de E. coli na presença ou ausência de Ag NPs prova a capacidade antimicrobiana. Como mostrado na Fig. 6a, as Ag NPs sintetizadas exibiram atividade antibacteriana significativa de maneira dependente de concentração contra E. coli. O ensaio de inibição de crescimento demonstrou uma redução completa em E. coli em concentrações de Ag NPs acima de 20,0 μg/mL comparado ao controle negativo. A concentração inibitória metade (EC₅₀) de Ag NPs foi 13,4 μg/mL. A dose de 20,0 μg/mL Ag NPs exibiu efeito antibacteriano significativo contra E. coli ao longo do tempo testado, enquanto 10,0 μg/mL Ag NPs mostrou efeito inibitório parcial (Fig. 6b).

Para investigar se as Ag NPs realmente afetam as células bacterianas resistentes a antibióticos, avaliamos a atividade antibacteriana de Ag NPs contra E. coli resistente à ampicilina por ensaio de unidade formadora de colônia. E. coli-Amp⁺ expressa estavelmente um alto número de cópias do plasmídeo pcDNA3.4 contendo o gene β-lactamase que confere resistência à ampicilina a E. coli [45]. As células E. coli-Amp⁺ foram cultivadas em placa de ágar LB no tratamento com ampicilina sozinha ou no tratamento combinatório com Ag NPs. A atividade inibitória das Ag NPs preparadas é apresentada na Fig. 7. Foi notado que as Ag NPs em tratamento combinatório com ampicilina exibiram atividade antibacteriana superior comparada à ampicilina sozinha. Em contraste, o tratamento de ampicilina sozinha não tem atividade inibitória em E. coli-Amp⁺. Terapia combinatória de antibióticos e Ag NPs fornece uma estratégia complementar para superar células bacterianas resistentes a antibióticos, o que further melhora as abordagens terapêuticas atuais. Os resultados gerais apresentados neste estudo contribuem para o desenvolvimento de inibidores antibacterianos alternativos para tratar infecções bacterianas causadas por cepas bacterianas multirresistentes.

Há uma grande necessidade de novos fármacos com diferentes mecanismos para combater a resistência bacteriana. Devido à sua potente atividade antimicrobiana, Ag NPs têm sido usadas em produtos médicos, produtos de cuidados pessoais e têxteis. Existem múltiplos mecanismos pelos quais Ag NPs combatem a resistência microbiana [46]. Ag NPs acumulam na superfície da membrana bacteriana, aumentando a permeabilidade da parede celular. A interação entre Ag NPs e peptidoglicano mudou a configuração do peptidoglicano e assim danificou a membrana bacteriana [47]. As características de forma, estrutura de superfície, morfologia, dispersibilidade e biocompatibilidade de Ag NPs têm papel significativo em sua atividade antimicrobiana.

Conclusões

Aqui, relatamos um novo método biossintético para preparação de Ag NPs usando extrato de levedura. As micelas de levedura formaram quando a solução Ag⁺ foi misturada com o extrato de levedura. Biomoléculas biorredutoras desempenham papel principal na redução de Ag⁺. Além disso, as biomoléculas fornecem estabilidade favorável, monodispersibilidade e distribuição de tamanho controlável para as Ag NPs sintetizadas, exibindo boa estabilidade por mais de um ano sem precipitação. A análise de aminoácidos de alta velocidade revelou que o extrato de levedura é rico em biomoléculas, incluindo aminoácidos, ácido alfa-linolênico e ácido aminobutírico. As Ag NPs exibiram atividade antibacteriana significativa de maneira dependente de concentração contra E. coli. O ensaio de inibição de crescimento demonstrou uma redução completa em E. coli em concentrações de Ag NPs acima de 20,0 μg/mL. As Ag NPs em tratamento combinatório com ampicilina exibem atividade antibacteriana superior comparada à ampicilina sozinha contra células E. coli resistentes à ampicilina (E. coli-Amp⁺). Os revestimentos de superfície nas Ag NPs aumentaram a afinidade em direção à membrana bacteriana e aumentaram a permeabilidade da parede celular. A interação entre Ag NPs e peptidoglicano mudou a configuração do peptidoglicano e finalmente levou à apoptose das bactérias. Além disso, essas Ag NPs estabilizadas pelas biomoléculas exibiram baixa citotoxicidade e boa biocompatibilidade para com células Cos-7.