Combinação baseada em nanopartículas de sílica mesoporosa de inibidor de NQO1 e 5-fluorouracil para efeito antitumoral potente contra carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC)

Resumo

Os carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço (CECP) são uma das formas mais letais de câncer e 90% de sua origem é de células escamosas. NAD (P) H:quinona oxidoredutase 1 (NQO1), uma enzima superexpressada no carcinoma de células escamosas, desempenha um papel importante na proliferação e quimiorresistência. Os principais objetivos foram estudar o efeito inibitório da ß-lapachona (ARQ761 na forma clínica) em HNSCC e estudar o efeito combinacional de 5-FU e ß-lap na melhoria da eficácia terapêutica em HNSCC. Nanopartículas de sílica mesoporosa montadas em bicamada lipídica carregadas com 5-FU / ß-lap foram preparadas e estudadas quanto às suas propriedades físico-químicas e biológicas. ß-lap mostrou uma inibição dependente da concentração da atividade da enzima NQO1 em células Cal33. Notavelmente, um efeito inibitório significativo foi observado com uma dose de 20–50 μg / ml de ß-lap. A combinação de 5-FU + ß-lap resultou em menor viabilidade celular; mais notavelmente, nanopartículas de sílica mesoporosa carregadas com 5-FU / ß-lap (FNQ-MSN) exibiram viabilidade celular significativamente mais baixa em comparação com a de qualquer droga individual ou combinações físicas. ß-lap resultou em uma diminuição na banda de proteína de NQO1 em comparação com o controle; no entanto, a diminuição mais notável no nível de NQO1 foi observada no grupo de células tratadas com FNQ-MSN. FNQ-MSN resultou em mais de 60% de apoptose celular (apoptose precoce e tardia) e fragmentação nuclear predominante de células cancerosas, indicando o efeito anticâncer superior de um regime de combinação baseado em transportador. Diminuição notável no volume do tumor foi observada com a mistura física de 5-FU + ß-lap; no entanto, o tratamento combinado de 5-FU e ß-lap (FNQ-MSN) baseado em transportador atrasou significativamente o crescimento do tumor e prolongou a sobrevivência de camundongos xenoenxertados com tumor. Esses achados sugerem o potencial do inibidor de NQO1 em aumentar o potencial quimioterápico de 5-FU no tratamento de HNSCC.

Introdução

Os carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço (CECP) são uma das formas mais letais de câncer e 90% de sua origem é de células escamosas [1]. HNSCC é de natureza altamente angiogênica e sua vasculatura expressa várias citocinas, incluindo fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) e fatores de crescimento endotelial vascular (VEGFs) que estão ligados a metástases mais altas e sobrevida pobre [2]. A incidência de HNSCC na China é o sexto em mortes relacionadas ao câncer, com aproximadamente 250.000 novos casos registrados em 2015 e 77.500 casos de morte. A taxa de sobrevida geral de 5 anos de HNSCC é muito baixa devido a fatores que incluem natureza agressiva, recidiva precoce, alta metástase e alta taxa de mortalidade devido ao mau prognóstico [3]. A principal opção de tratamento no HNSCC é o procedimento cirúrgico seguido de radioterapia ou quimioterapia. Para ser mais específico, a quimioterapia, se usada efetivamente nos estágios iniciais ou nos estágios pós-cirúrgicos, neutralizaria o crescimento do tumor [4, 5]. O uso eficaz da quimioterapia erradicará as células cancerosas dos tecidos tumorais e inibirá a recidiva do tumor. No entanto, a quimioterapia de longo prazo baseada em um único agente frequentemente resulta em resistência aos medicamentos e redução da eficácia terapêutica [6]. Portanto, é necessário empregar estratégias inovadoras para melhorar a sobrevida e a qualidade de vida dos pacientes com CECP.

Vários agentes anticâncer usados ​​no tratamento de HNSCC incluem cisplatina, 5-fluorouracil (5-FU), paclitaxel ou docetaxel. Entre todos, o 5-fluorouracil (5-FU) é empregado como terapia de primeira linha no HNSCC e no tratamento de outros carcinomas de células escamosas [7]. O 5-FU é um análogo da pirimidina que atua inibindo irreversivelmente a timidilato sintase dentro das células cancerosas e, assim, suprime a replicação do DNA, resultando na morte celular [8]. Tal como acontece com todas as drogas anticâncer, 5-FU não é sem efeito adverso na circulação sistêmica e causa toxicidade aos tecidos normais, embora seja relatado que a combinação de 5-FU com um agente secundário poderia reduzir potencialmente os efeitos colaterais e melhorar a eficácia terapêutica geral no tratamento do câncer [9].

NAD (P) H:quinona oxidoredutase 1 (NQO1) é uma flavoproteína que está elevada nos tecidos tumorais na faixa de 100-200 vezes em comparação com os tecidos normais [10]. A oxidorredutase de dois elétrons é uma enzima desintoxicante de fase II induzível, capaz de desintoxicar quinonas por meio da formação de hidroquinonas estáveis ​​[11]. NQO1 é mostrado para se expressar em um nível basal baixo em tecidos humanos normais, onde protege as células contra o ciclo redox e estresse oxidativo e estabiliza o supressor de p53. NQO1 é constitutivamente superexpresso em vários cânceres, incluindo carcinomas de células escamosas, pancreáticas e de mama [12]. A superexpressão de NQO1 promove a progressão da carga de câncer e torna as células cancerosas mais resistentes a drogas quimioterápicas, como 5-FU ou cisplatina (indutores de estresse oxidativo), tornando NQO1 um potencial oncotarget para melhorar a eficácia terapêutica [13]. Foi relatado que o knockdown de NQO1 por siRNA aumentou o efeito citotóxico de várias drogas como a gencitabina ou a doxorrubicina [14]. Além disso, vários inibidores de NQO1 sintéticos e naturais são relatados, como cumarinas ou curcuminas ou ES936 [15,16,17]. Neste estudo, empregamos ß-lapachona (ß-lap, 3,4-Diidro-2,2-dimetil-2H-nafto [1,2-b] piran-5,6-diona) como um inibidor de NQO1 [ 18]. O ß-lap atua por meio de um mecanismo dependente de NQO1 e cria uma quantidade significativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) que irão causar danos às fitas de DNA e causar a morte das células cancerosas [19].

O emprego de nanopartículas para a entrega sistêmica de pequenas moléculas torna-se uma abordagem promissora no tratamento do câncer [20]. As nanopartículas carregadas com a droga requerem menos esquema de dosagem e mostraram melhorar a eficácia anticâncer e reduzir relativamente os efeitos adversos. Entre todos os transportadores, a nanopartícula de sílica mesoporosa (MSN) possui um potencial significativo para efetivamente entregar a carga útil aos tecidos tumorais [21, 22]. Os poros do tamanho de um micrômetro permitem o carregamento estável dos medicamentos e previnem sua liberação na circulação sistêmica e permitem o acúmulo preferencial nos tecidos cancerosos com vazamento usando o efeito de maior permeação e retenção (EPR) [23].

No geral, o objetivo principal do presente estudo foi combinar os benefícios terapêuticos do 5-FU e do inibidor de NQO1 para aumentar o efeito anticâncer no HNSCC. O efeito anticâncer in vitro foi analisado usando várias técnicas, como viabilidade celular, análise de western blot, citômetro de fluxo / ensaio de apoptose baseado em Hoechst e ensaio de vida / morte. Os estudos in vivo foram realizados no modelo de xenoenxerto com células tumorais Cal33.

Conclusão

Em resumo, formulamos com sucesso nanopartículas de sílica mesoporosa revestidas com bicamada lipídica carregada com 5-FU + ß-lap. Mostramos que (i) o efeito antitumoral de ß-lap de maneira dependente da concentração em células tumorais de HNSCC, (ii) a combinação de 5-FU + ß-lap resulta na inibição significativa da proteína NQO1 e da proteína Bcl-2, ( iii) FNQ-MSN baseado em combinação demonstrou uma redução significativa na carga tumoral no xenoenxerto de HNSCC. Esses dados apontam inequivocamente para o fato de que a dose subletal de inibidor de NQO1 (ß-lap) pode aumentar potencialmente a eficácia terapêutica de 5-FU em tumores de HNSCC e pode ser estendida ao tratamento clínico de outras doenças malignas.

Materiais e métodos

Preparação de nanopartículas de sílica mesoporosa de bicamada lipídica carregada com 5-FU / ß-lap

O MSN carregado com a droga foi preparado dissolvendo brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) (210 mg) em 180 ml de água e fervido a 80 ° C, seguido por 5-FU e ß-lap foram adicionados 20% w / w do total de nanopartículas e em seguida, foi adicionado fluoreto de amônio (NH4F) (30 mg) e bem agitado durante 60 min. A seguir, 1,6 mL de ortossilicato de tetraetila (TEOS) foi adicionado gota a gota durante 30 min e agitado continuamente durante 3 h. Foram formados coloides brancos semitransparentes que foram coletados após centrifugação (15 min) a 10.000 rpm a 24 ± 1 ° C. O MSN foi ressuspenso em água ultrapura e o ciclo de centrifugação foi repetido 2 vezes. Separadamente, uma membrana de filme fino foi preparada usando DSPE-PEG2000 (2% do peso total de MSN) e hidratada com água suspensa com MSN carregado com fármaco. A mistura foi imediatamente sonicada por sonda durante 5 min a 50 W à temperatura ambiente (25 ° C). O MSN com bicamada lipídica PEGuilado foi finalmente lavado duas vezes e ressuspenso em água ultrapura.

Tamanho de partícula, análise de potencial Zeta e análise de morfologia

O diâmetro da partícula, índice de polidispersidade (PDI) e potencial zeta foram avaliados usando Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). As partículas foram analisadas usando o mecanismo de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e as dispersões de partículas foram bem diluídas antes do experimento. Todas as experiências foram realizadas em triplicado à temperatura ambiente. A morfologia das nanopartículas foi determinada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) usando CM 200 UT, Philips, MA, EUA) operado a 100 kV. Resumidamente, as dispersões de partículas foram diluídas e uma gota foi colocada em uma grade TEM de malha 300 e deixada em repouso por 10 min. As partículas foram contrastadas com ácido fosfotúngstico 2% (PTA) como coloração negativa, secas ao ar e observadas em um microscópio TEM.

Carregamento de droga

A análise de carga da droga de duas maneiras foi realizada calculando a droga descarregada ou não ligada no sobrenadante e a droga carregada na nanopartícula. A eficiência do carregamento do fármaco foi realizada pelo método HPLC. O HPLC foi equipado com bomba Shimadzu LC-20 AD PLC e detector SPD-M20A PDA e software de análise Shimadzu LC contendo coluna C18 de fase reversa (Phenomenex C18, 150 4,6 mm, 5 μm). A fase móvel do 5-FU consiste em uma mistura de acetonitrila e água (10:90, v / v) e bombeada a uma taxa de 1 ml / min. O comprimento de onda de detecção definido em 265 nm para 5-FU. A fase móvel para ß-lap consistindo em acetonitrila / água (31:69, v / v) e comprimento de onda de detecção fixado em 254 nm a 35 ° C. A capacidade de carga (LC) e a eficiência de carga (LE) de 5-FU / ß-lap foram calculadas usando a respectiva fórmula.
$$ \ mathrm {LE} \ \ left (\% \ right) ={W} _ {t \ mathrm {otal} \ 5- \ mathrm {FU} + \ mathrm {\ ss} - \ mathrm {lap}} - {W} _ {\ mathrm {free} \ 5- \ mathrm {FU} + \ mathrm {\ ss} - \ mathrm {lap}} / {W} _ {\ mathrm {total} \ 5- \ mathrm { FU} + \ mathrm {\ ss} - \ mathrm {lap}} \ times 100 $$$$ \ mathrm {LC} \ \ left (\% \ right) ={W} _ {\ mathrm {total} \ 5 - \ mathrm {FU} + \ mathrm {\ ss} - \ mathrm {lap}} - {W} _ {\ mathrm {grátis} \ 5- \ mathrm {FU} + \ mathrm {\ ss} - \ mathrm { lap}} / {W} _ {\ mathrm {total} \ \ mathrm {NP} \ \ mathrm {massa}} \ times 100 $$

Estudo de liberação de drogas

A liberação de 5-FU e ß-lap foi avaliada em PBS (pH 7,4) e ABS (pH 5,0) a 37 ° C usando o método de diálise. Resumidamente, 1 mg equivalente de cada nanopartícula carregada com droga foi carregada em uma membrana de diálise em 1 ml do respectivo tampão e as extremidades são seladas. A membrana de diálise selada foi colocada em 25 ml dos respectivos ABS e tampão PBS e colocada num banho de água com agitação a 37 ° C. As amostras foram coletadas em um intervalo de tempo predeterminado e substituídas por um volume igual de tampão fresco. A quantidade de droga liberada no respectivo tampão foi avaliada pelo método HPLC conforme descrito na seção anterior.

Cultura de células e NAD (P) H:Ensaio de atividade de quinona oxidoredutase 1 (NQO1)

A célula Cal33 HNSCC foi cultivada em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de FBS e 1% de mistura de antibióticos. As células foram mantidas em condições ambientais em uma incubadora. Para o ensaio de atividade de NQO1, células Cal33 foram semeadas em placa de 96 poços a uma densidade de semeadura de 8 × 10 ³ células por poço e incubadas durante a noite. As células foram tratadas com diferentes concentrações de ß-lap e incubadas por 24 h. 0,8% digitonina (50 μl de 2 nM EDTA) foi usada para lisar as células e o ensaio foi realizado usando menadiol e MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) como um a reação e a atividade de acoplamento do substrato foram medidas a 620 nm. O ensaio foi realizado em triplicado.

Ensaio de viabilidade celular in vitro

Ensaio de viabilidade celular de ß-lap em concentração crescente e ensaio de viabilidade celular de regime individual e combinacional foram testados por um 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-car boximetoxifenil) -2- (4 ensaio de -sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS). Resumidamente, as células Cal33 foram semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de semeadura de 1 × 10 ⁴ células por poço e incubadas durante a noite. No dia seguinte, as células foram tratadas com concentração crescente de ß-lap, separadamente; as células foram tratadas com regime individual e combinacional de 5-FU e ß-lap em uma concentração de base de 5, 10 e 20 μg / ml e incubadas por 24 h. As células foram lavadas duas vezes e tratadas com solução MTS de acordo com as orientações do fabricante. A viabilidade celular foi calculada em relação às células não tratadas, e um leitor de microplaca foi usado para absorbância a 460 nm.

Análise de Western Blot

As células semeadas em uma placa de 6 poços foram tratadas com concentração crescente de ß-lap, separadamente; as células foram tratadas com regime individual (5-FU ou ß-lap) e combinacional de 5-FU e ß-lap (FNQ-MSN) e incubadas por 24 h. As células foram colhidas, lisadas (M por tampão) e centrifugadas, e o sobrenadante contendo a proteína foi coletado. A concentração de proteína no lisado celular foi avaliada usando o método do ácido bicinconínico (BCA). 10% de gel de poliacrilamida Bis-Tris foi usado para separar as proteínas e imediatamente transferido para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). A membrana foi bloqueada usando 5% de leite desnatado preparado em tampão n Tris-tamponado salino (TBS) contendo Tween 20 (TBST, pH 7,2). Os anticorpos primários de NQO1 policlonal de coelho (1:1000), Bcl-2 monoclonal de camundongo (1:1000) e GAPDH monoclonal de camundongo (1:1000) foram incubados na membrana durante a noite a 4 ° C. A membrana foi lavada com TBST e então incubada com anticorpos secundários (anti-rato ou anti-rato IgG) em uma diluição de 1:10000 diluições. A membrana foi novamente lavada com TBST e os blots foram expostos à solução de substrato de ECL e as densidades das bandas de proteína foram avaliadas usando fotorrevelador.

Ensaio de apoptose e Hoechst

As células Cal33 foram semeadas em uma placa de 6 poços a uma densidade de semeadura de 2 × 10 ⁵ células por poço e incubadas durante a noite. As células foram então tratadas com regime individual (5-FU ou ß-lap) e combinação de 5-FU e ß-lap (FNQ-MSN) e incubadas por 24 h. As células foram colhidas, lavadas, centrifugadas e sedimentadas. As células foram tratadas com 2,5 μl de anexina V e 2,5 μl de PI e incubadas por 15 min no escuro. As células foram então feitas até 1 ml e avaliadas usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS, BD, FACSverse). Um total de 10.000 células foram analisadas. Procedimento semelhante para semeadura de células e tratamento com drogas foi seguido e, em seguida, corado com o corante Hoechst 33342 (10 μg / ml) e incubado por 10 min. As células foram lavadas e fixadas com 4% de paraformaldeído (PFA) e lavadas novamente. A morfologia celular foi observada em microscópio de fluorescência (Nikon A1, Japão).

Eficácia antitumoral de FNQ-MSN no modelo de tumor de xenoenxerto de HNSCC

Camundongos BALB / c machos de 18 a 22 gramas com idade média de 4 a 5 semanas foram adquiridos no Centro de Instalação de Animais Internos da Universidade da Indústria Leve de Zhengzhou, Henan. Os animais foram mantidos em uma sala com ar-condicionado, ciclo escuro-claro de 12 horas e livre acesso a comida e água. Todos os protocolos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Zhengzhou University of Light Industry, Henan. Para estabelecer um modelo de xenoenxerto, 1 × 10 ⁷ Células Cal33 em 150 μl de meio de cultura foram inoculadas no quadril direito do camundongo por via subcutânea. Quando o tamanho médio do tumor atinge 80-100 mm3, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 5 grupos para controle, 5-FU, ß-lap, 5-FU + ß-lap e FNQ-MSN, respectivamente com 8 camundongos em cada grupo . O 5-FU foi administrado em uma dose fixa de 5 mg / kg e ß-lap em uma dose fixa de 25 mg / kg e administrado 3 vezes com um intervalo de 3 dias para cada injeção na veia da cauda. O peso do camundongo e o volume do tumor foram monitorados regularmente por 18 dias. O volume do tumor foi calculado usando a fórmula
$$ V \ \ left ({\ mathrm {mm}} ^ 3 \ right) ={\ mathrm {Width}} ^ 2 \ \ left ({\ mathrm {mm}} ^ 2 \ right) \ times \ mathrm { Comprimento} \ \ left (\ mathrm {mm} \ right) / 2 $$
O presente estudo não observou nenhuma morte de camundongo devido ao carregamento de células tumorais e todos os animais foram sacrificados com CO ₂ e então sacrificado por luxação cervical no final do estudo.

Análise estatística

Vários grupos foram comparados usando análise de variância de duas vias (ANOVA). Nível de significância de p <0,05 foi considerado significativo e todos os dados são apresentados como uma média ± desvio padrão, a menos que seja especificamente mencionado nos respectivos experimentos.

Resultado e discussão

Preparação de nanopartículas de sílica mesoporosa suportadas por bicamada lipídica carregada com 5-FU / ß-lap

Neste estudo, personalizamos uma nanopartícula de sílica mesoporosa estabilizada por bicamada lipídica PEGuilada. O MSN carregado com 5-FU / ß-lap foi preparado pelo método de emulsão-sonicação e, em seguida, o MSN carregado com a droga foi introduzido no frasco contendo filme fino de lipídio consistindo em DSPE-PEG2000. A mistura foi sonicada e o MSN revestido com lípido contendo 5-FU / ß-lap foi obtido (FNQ-MSN) (Fig. 1a). As eficiências de carregamento (LE) de 5-FU e ß-lap foram 91,5 ± 1,65% e 92,9 ± 1,24%, respectivamente. O FNQ-MSN exibiu 8,1 ± 1,12% em peso de 5-FU e 7,6 ± 0,95% em peso de ß-lap indicando a alta capacidade de carga (LC) da portadora do MSN. A presença da bicamada lipídica evitará sua liberação indesejada na circulação sistêmica e, assim, previne a toxicidade. O tamanho médio de partícula do MSN carregado com droga foi de 92,1 ± 0,85 nm (PDI ~ 0,089), enquanto a montagem da bicamada lipídica na superfície do MSN (FNQ-MSN) aumentou o tamanho médio de partícula para 128,4 ± 1,24 nm (PDI ~ 0,115), indicando um presença sólida de materiais lipídicos na superfície do MSN (Fig. 1b). O potencial zeta mudou de - 18,2 ± 1,22 para - 26,4 ± mV. O pequeno tamanho de partícula de FNQ-MSN permitirá o acúmulo preferencial de transportador carregado com a droga nos tecidos tumorais com vazamento em virtude do efeito EPR. Além disso, a superfície PEGuilada conferirá excelente estabilidade e tempo prolongado de circulação sanguínea que aumentará ainda mais as chances de FNQ-MSN nos tecidos tumorais. A imagem TEM mostrou uma semelhança morfológica com a do lipossoma e apresentou uma forma esférica perfeita e uniformemente espalhada na grade. A imagem TEM mostrou claramente um núcleo externo acinzentado e mais escuro, indicando a presença de montagem de lipídios na superfície do MSN (Fig. 1c). O tamanho observado a partir de TEM corrobora com o tamanho de partícula DLS de um zetasizer. O MSN possui canais bem ordenados para a distribuição homogênea de moléculas de drogas. A propriedade da superfície dos poros é um dos fatores importantes no carregamento estável das moléculas pequenas. As várias forças físicas envolvidas na interação hospedeiro-convidado incluem principalmente as forças hidrofóbicas e as forças de interação de van der Waals. Quanto maior a capacidade de carga da droga, maior a concentração intracelular e maior eficiência de eliminação nos locais do tumor. O FNQ-MSN exibiu excelente estabilidade no meio PBS e o tamanho das partículas permaneceu inalterado durante todo o período de estudo até 30 dias. Essa estabilidade melhorada do sistema transportador e alta capacidade de carga do sistema transportador irão melhorar a biodistribuição e eficiência no tratamento do tumor.

a Apresentação esquemática da construção de 5-FU e nanopartículas de sílica mesoporosa revestidas com bicamada lipídica carregadas com ß-lap. Dois medicamentos são carregados nos poros do MSN que foram posteriormente estabilizados pelo conjunto de bicamada lipídica PEGuilada na superfície externa do MSN. b Distribuição de tamanho de partícula de FNQ-MSN. c Imagem TEM de FNQ-MSN com uma inserção de ampliações maiores

Liberação de droga in vitro

A liberação de drogas in vitro de 5-FU e ß-lap de FNQ-MSN foi estudada em PBS e ABS (Fig. 2). Como mostrado, duas tendências de liberação diferentes foram observadas em pH 7,4 e pH 5,0. Por exemplo, 25% de 5-FU liberado em 24 h em pH 7,4 em comparação com ~ 40% da liberação de droga em pH 5,0 em 24 h. Da mesma forma, 20% e 30% do ß-lap foi liberado em pH 7,4 e pH 5,0, respectivamente. A cinética de liberação foi idêntica ao longo do período de estudo, com 50% do 5-FU liberado em tampão alcalino e 80% da liberação do fármaco em pH 5,0 após 72 h do período de estudo. Uma liberação de droga responsiva ao pH em condições ácidas é vantajosa para o tratamento do câncer. Nenhum fenômeno de liberação repentina foi observado em ambas as condições de pH atribuídas principalmente à presença da camada DSPE-PEG que controlou a liberação do fármaco do FNQ-MSN ao longo do período de estudo. Diferença significativa na liberação da droga foi observada entre as condições de pH 7,4 e pH 5,0. Em condições de pH 7,4, PEG- b -DSPE exibe uma propriedade de camada de alta furtividade, evitando assim a liberação do composto encapsulado. O presente resultado mostrou que a liberação do fármaco se acelerou em pH 5,0, indicando a desmontagem da capa protetora em torno da superfície do MSN. A taxa de liberação do medicamento sensível ao pH, que garante a liberação máxima do medicamento nas células cancerosas, pode melhorar a eficácia antitumoral e diminuir a toxicidade indesejada para os tecidos normais. É possível que, na presença de um elemento responsivo ao pH, o FNQ-MSN resulte na liberação da bicamada lipídica no MSN, resultando em uma liberação aprimorada nas condições de pH mais baixo.

Liberação in vitro de 5-FU e ß-lap de FNQ-MSN em condições tampão de pH 7,4 e pH 5,0. O estudo de liberação foi continuado até 72 h, e a liberação do fármaco foi quantificada pelo método HPLC. ** p <0,01

Sensibilidade de NQO1 a ß-lap

Como a regulação positiva de NQO1 em muitas células cancerosas, incluindo HNSCC, está associada a um prognóstico ruim e a um resultado terapêutico ruim, os medicamentos que visam o NQO1 podem ser uma estratégia potencial para o tratamento do câncer [24]. O NQO1 é superexpresso em um nível que varia de 100 a 200 vezes no carcinoma de células escamosas em comparação com aquele associado aos tecidos normais. Portanto, a influência da ß-lap na atividade da enzima NQO1 foi estudada em células Cal33. Como mostrado, ß-lap mostrou uma inibição dependente da concentração da atividade da enzima NQO1 em células Cal33 (Fig. 3a). Notavelmente, um efeito inibitório significativo foi observado com uma dose de 20–50 μg / ml de ß-lap. Além disso, o potencial inibitório da ß-lap na proteína NQO1 foi ainda estudado por análise de western blot (Fig. 3b). Os resultados revelaram claramente a diminuição significativa na proteína NQO1 nas células cancerosas com um aumento na concentração de ß-lap. Aproximadamente, 80% de inibição de NQO1 observada em 100 μg / ml de ß-lap. A droga bioativável NQO1, como ß-lap, é metabolizada por NQO1 e forma um composto de hidroquinona instável que se converte imediatamente de volta ao componente original, deixando de volta 2 oxidações de um elétron e consome 2 O ²⁻ . Isso criará um ciclo redox fútil no qual 1 molécula de ß-lap irá gerar 130 moles de superóxido ao custo de consumir 60-70 moles de NAD (P) H6. Os radicais superóxido assim formados (O2.−) serão convertidos em peróxido de hidrogênio (H2O2−) e causarão apoptose e morte celular [25].

a Efeito da atividade dependente da concentração de ß-lap na atividade NQO1 de células cancerosas Cal33 pelo método enzimático. b Efeito da atividade dependente da concentração de ß-lap nos níveis de proteína NQO1 por análise de Western blot usando GAPDH como uma proteína de manutenção

Efeito anticâncer in vitro de FNQ-MSN em células HNSCC

O efeito anticâncer in vitro de ß-lap em células Cal33 foi estudado pelo ensaio MTT. Os resultados revelaram que a ß-lap exibiu uma diminuição típica dependente da concentração na viabilidade celular (Fig. 4a). Notavelmente, uma diminuição significativa na viabilidade celular foi observada a uma concentração de 50 μg / ml. Para outros experimentos, 20 μg / ml foi selecionado (abaixo do valor IC50 de ß-lap). Em seguida, o efeito de potencialização do ß-lap em 5-FU foi estudado em 3 concentrações diferentes (5, 10 e 20 μg / ml). Como mostrado, a combinação de 5-FU + ß-lap resultou em menor viabilidade celular; mais notavelmente, FNQ-MSN exibiu viabilidade celular significativamente mais baixa em comparação com a de qualquer droga individual ou combinações físicas (Fig. 4b). Por exemplo, 5-FU e ß-lap mostraram uma viabilidade celular de 35,7% e 70,2%, enquanto 5-FU + ß-lap mostrou 26,5% e FNQ-MSN mostrou 13,1%, respectivamente. Os resultados mostraram claramente que o efeito citotóxico de 5-FU foi significativamente aumentado quando combinado com ß-lap. É importante notar que o FNQ-MSN foi mais eficaz em comparação com o 5-FU + ß-lap atribuído à melhor internalização e liberação controlada da terapêutica carregada do sistema portador. Os resultados revelam claramente o efeito inibitório do ß-lap na atividade enzimática do NQO1 e nos níveis de proteína, potencializando o efeito anticâncer do 5-FU e resultando em um melhor resultado terapêutico no tratamento de HNSCC.

a Efeito da atividade dependente da concentração de ß-lap na viabilidade celular de células Cal33. b Efeito citotóxico individual e em combinação com o segundo agente quimioterápico, 5-FU em 3 concentrações diferentes de 5–20 μg / ml, respectivamente. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio MTT após 24 h de incubação. c Análise de Western blot da expressão da proteína NQO1 e Bcl-2 após o tratamento com o indivíduo e a combinação de 5-FU e ß-lap

Função do FNQ-MSN nas vias de sinalização:análise de Western Blot

O mecanismo do efeito citotóxico mediado por ß-lap foi posteriormente explorado por análise de western blot. Como mostrado, a ß-lap resultou em uma diminuição na banda de proteína de NQO1 em comparação com o controle; no entanto, a diminuição mais notável no nível de NQO1 foi observada no grupo de células tratadas com FNQ-MSN (Fig. 4c). O aumento da quimiossensibilidade de Cal33 induzido por ß-lap ao aumentar a apoptose celular foi avaliado através do nível de proteína Bcl-2. A família Bcl-2 desempenha um papel importante na regulação da homeostase celular e controla a proliferação e morte de células cancerosas. O processo de diminuição de Bcl-2 e aumento de Bax resulta na liberação do citocromo C no citosol que iniciará toda a cascata da caspase resultando em morte celular [26]. Os resultados destacaram claramente que a combinação de 5-FU e ß-lap (FNQ-MSN) desregulou significativamente o Bcl-2, indicando o efeito anticâncer intensificado nas células cancerosas Cal33.

Análise de apoptose de HNSCC

Seguindo a análise de viabilidade celular, o efeito de apoptose do fármaco individual e combinado em células Cal33 foi avaliado por citômetro de fluxo após coloração com anexina V / PI (Fig. 5). O efeito de apoptose de 5-FU (10 μg / ml) ou ß-lap (30 μg / ml) individual não resultou em nenhuma apoptose apreciável das células cancerosas; no entanto, 5-FU + ß-lap resultou em um aumento dramático na proporção de apoptose das células cancerosas. É importante ressaltar que o FNQ-MSN resultou em mais de 60% da apoptose celular (apoptose precoce e tardia), significando o efeito terapêutico superior do regime de combinação baseado em transportador. O efeito de apoptose foi posteriormente confirmado pela coloração Hoechst 33342. Como mostrado, as células tratadas com FNQ-MSN resultam em uma quantidade maior de células em apoptose, condensação nuclear e características de fragmentação em comparação com 5-FU ou ß-lap sozinho (Fig. 6). Durante o processo de apoptose, as células encolhem sem serem danificadas na membrana celular externa e resulta em condensação da cromatina com aumento da formação de corpos apoptóticos.

Análise de citômetro de fluxo de células Cal33 usando coloração dupla de anexina V e PI após tratamento com indivíduo e combinação de 5-FU e ß-lap. 10.000 eventos foram registrados no citômetro de fluxo

Análise da morfologia nuclear de células Cal33 após coloração com Hoechst 33342; as células foram tratadas com indivíduo e combinação de 5-FU e ß-lap. 10.000 eventos foram registrados no citômetro de fluxo

Ensaio vivo / morto

O efeito anticancerígeno do fármaco individual e combinado foi posteriormente avaliado pelo ensaio Live / Dead. As células tratadas foram submetidas a coloração com Calceína AM e brometo de etídio como um marcador respectivo de células vivas e mortas (Fig. 7). Como mostrado, as células não tratadas são coradas com 100% de fluorescência verde. Os medicamentos individuais, 5-FU (10 μg / ml) ou ß-lap (30 μg / ml), entretanto, mostraram células coradas com fluorescência vermelha leve; no entanto, as células predominantes exibiram fluorescência verde indicando morte celular limitada. A morte celular notável foi observada em células cancerosas tratadas com FNQ-MSN, conforme demonstrado pela fluorescência vermelha predominante e menos células coradas com fluorescência verde. O maior efeito anticâncer do FNQ-MSN foi atribuído à atividade sinérgica de 5-FU e ß-lap nas células cancerosas e à capacidade do ß-lap de aumentar a quimiossensibilidade do 5-FU.

Análise viva / morta de células Cal33 usando coloração dupla de Calceína AM e brometo de etídio após tratamento com indivíduo e combinação de 5-FU e ß-lap

Eficácia antitumoral in vivo de FNQ-MSN contra modelo de xenoenxerto de HNSCC

Para avaliar ainda mais a eficácia do regime combinacional em um modelo animal, o xenoenxerto de HNSCC foi preparado e administrado com 5 mg / kg de 5-FU e 10 mg / kg de ß-lap, respectivamente. O grau farmacêutico do ß-lap é ARQ761, que está atualmente em ensaio clínico de fase I para o tratamento de doenças malignas metastáticas. ß-lap estabeleceu o limite para a dose máxima tolerável em humanos de acordo com os estudos pré-clínicos [27]. Tendo isso em mente, selecionamos de forma ideal uma dose de 10 mg / kg de ß-lap para os estudos in vivo. Como mostrado, nenhuma diminuição significativa no volume do tumor foi observada com 5-FU e ß-lap administrados individualmente em comparação com o controle não tratado (Fig. 8a). Uma diminuição notável no volume do tumor foi observada com uma mistura física de 5-FU + ß-lap; no entanto, o tratamento combinado de 5-FU e ß-lap (FNQ-MSN) baseado em transportador atrasou significativamente o crescimento do tumor e prolongou a sobrevivência de camundongos xenoenxertados com tumor. O gráfico de volume tumoral do FNQ-MSN pode ser dividido em duas partes; crescimento insignificante no volume do tumor foi observado até o dia 9, enquanto o tumor aumentou significativamente após o dia 9 até o dia 18, no entanto, o volume total do tumor foi muito menor em comparação com o do controle ou outros grupos. A preocupação com a toxicidade do indivíduo e do regime combinacional foi avaliada em termos de peso corporal (Fig. 8b). Como mostrado, a mistura física de 5-FU + ß-lap resultou em toxicidade grave, representada por mais de 10% de perda no peso corporal, enquanto o 5-FU resultou em 5% do peso corporal. Como esperado, o FNQ-MSN não resultou em nenhuma perda de peso corporal, indicando a vantagem exclusiva do sistema transportador baseado em lipídios-MSN. O efeito antitumoral aprimorado de FNQ-MSN foi atribuído ao efeito inibitório de ß-lap em relação à enzima e proteína NQO1 que, por sua vez, aumentou a quimiossensibilidade de 5-FU e resultou em efeito anticâncer sinérgico nos tumores humanos Cal33, segunda camada lipídica - o MSN revestido protegeu a droga durante a circulação sistêmica e pode liberar de maneira controlada no tecido tumoral; terceiro, a PEGilação do nanocarreador pode prolongar o tempo de circulação sanguínea permitindo o acúmulo preferencial nos tecidos tumorais devido ao efeito EPR [28, 29 ] O MSN PEGuilado ficou preso principalmente no RES do fígado, baço e pulmão, respondendo por mais de 80% da dose administrada. A modificação do PEG do MSN obviamente diminuiu a taxa de depuração do MSN nos órgãos, demonstrando que os NPs PEGuilados eram mais difíceis de serem removidos dos órgãos RES, independentemente da forma da partícula [30, 31]. No geral, o estudo in vivo no modelo de HNSCC oferece uma "prova de conceito" de que a combinação eficaz de 5-FU + ß-lap em um nanocarreador estável pode aumentar a eficácia terapêutica no tumor, ao mesmo tempo que alivia o efeito tóxico associado.

a Eficácia antitumoral in vivo de FNQ-MSN no modelo de xenoenxerto de HNSCC. Os camundongos com tumores HNSCC foram tratados com 5-FU, ß-lap, 5-FU + ß-lap e FNQ-MSN a uma dose fixa de 5 mg / kg de 5-FU e 10 mg / kg de ß-lap por via intravenosa por 3 vezes. O volume do tumor foi anotado como parte da análise de eficácia e comparado com o controle não tratado. b Análise de peso corporal correspondente aos dados de volume do tumor. * p <0,05 e *** p <0,001

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados gerados ou analisados ​​durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e seus arquivos de informações complementares.

Abreviações

5-FU:

5-fluorouracil

EPR:

Maior permeação e efeito de retenção

FNQ-MSN:

Nanopartículas de sílica mesoporosa carregadas com 5-FU / ß-lap

HNSCC:

Carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço

MSN:

Nanopartícula de sílica mesoporosa

NQO1:

NAD (P) H:quinona oxidoredutase 1

ß-lap:

ß-lapachone

Dicroísmo Circular Ajustável Gigante de Matrizes Nanocrescentes de Metal Quiral Extrínseco de Grande Área ARTIGO RETRATADO:Um Estudo Comparativo da Toxicidade de Nanoesferas e Nanopartículas de Ferrita de Cobalto Revestida com Polietileno Glicol