Nanopartículas de Sílica Mesoporosa Co-entregam Inibidor de NQO1 e 5-Fluorouracil, Aumentando Atividade Antitumor em Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço

Resumo

Carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço (CECP) são uma das formas mais letais de câncer, e 90% de sua origem é a partir de células espinhosas. A NAD(P)H:quinona oxidorredutase 1 (NQO1), uma enzima superexpressa no carcinoma espinocelular, desempenha papel importante na proliferação e quimiorresistência. Os principais objetivos foram estudar o efeito inibitório do β-lapachona (ARQ761 na forma clínica) em CECP e estudar o efeito combinatório de 5-FU e β-lap na melhoria da eficácia terapêutica em CECP. Nanopartículas de sílica mesoporosa montadas por bicamada lipídica carregadas com 5-FU/β-lap foram preparadas e estudadas quanto às suas propriedades físico-químicas e biológicas. O β-lap mostrou inibição dependente de concentração da atividade enzimática da NQO1 em células Cal33. Notavelmente, efeito inibitório significativo foi observado na dose de 20–50 μg/ml de β-lap. A combinação de 5-FU+β-lap resultou em menor viabilidade celular; mais notavelmente, nanopartículas de sílica mesoporosa carregadas com 5-FU/β-lap (FNQ-MSN) exibiram viabilidade celular significativamente menor comparada à de qualquer fármaco individual ou combinações físicas. O β-lap resultou em diminuição da banda proteica de NQO1 comparado ao controle; porém, a diminuição mais notável no nível de NQO1 foi observada no grupo de células tratadas com FNQ-MSN. FNQ-MSN resultou em mais de 60% de apoptose celular (precoce e tardia) e fragmentação nuclear predominante de células cancerosas indicando efeito anticâncer superior de um regime combinacional baseado em carreador. Diminuição notável no volume tumoral foi observada com a mistura física de 5-FU+β-lap; porém, tratamento combinado de 5-FU e β-lap baseados em carreador (FNQ-MSN) atrasou significativamente o crescimento tumoral e prolongou a sobrevivência de camundongos xenoenxertados portadores de tumor. Estes achados sugerem o potencial do inibidor de NQO1 em aumentar o potencial quimioterapêutico do 5-FU no tratamento de CECP.

Introdução

Carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço (CECP) são uma das formas mais letais de câncer e 90% de sua origem é a partir de células espinhosas. O CECP é altamente angiogênico por natureza e sua vasculatura expressa várias citocinas incluindo fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) e fatores de crescimento endotelial vascular (VEGFs) que estão ligados a maior metástase e baixa sobrevivência. A incidência de CECP na China é a sexta em morte relacionada a câncer com aproximadamente 250.000 novos casos registrados em 2015 e 77.500 casos de morte. A taxa de sobrevivência global de 5 anos do CECP é muito baixa devido a fatores incluindo natureza agressiva, recaída precoce, alta metástase e alta taxa de mortalidade devido a prognóstico ruim. A principal opção de tratamento no CECP é procedimento cirúrgico seguido por radioterapia ou quimioterapia. Especificamente, quimioterapia se usada eficazmente em estágios iniciais ou pós-cirúrgicos contrabalançaria o crescimento tumoral. Uso eficaz de quimioterapia erradicará as células cancerosas dentro dos tecidos tumorais e inibirá a recaída tumoral. No entanto, quimioterapia de longo prazo baseada em agente único frequentemente resulta em resistência a fármacos e eficácia terapêutica reduzida. Portanto, é necessário empregar estratégias inovadoras para melhorar a sobrevivência e qualidade de vida de pacientes com CECP.

Vários agentes anticâncer usados no tratamento de CECP incluem cisplatina, 5-fluorouracil (5-FU), paclitaxel ou docetaxel. Entre todos, o 5-fluorouracil (5-FU) é empregado como terapia de primeira linha em CECP e outros tratamentos de carcinoma espinocelular. O 5-FU é um análogo de pirimidina que age inibindo irreversivelmente a timidilato sintase dentro das células cancerosas e, assim, suprime a replicação do DNA resultando em morte celular. Como todos os fármacos anticâncer, o 5-FU não é isento de efeitos adversos na circulação sistêmica e causa toxicidade aos tecidos normais, enquanto se relata que a combinação de 5-FU com um agente secundário poderia potencialmente reduzir os efeitos colaterais e melhorar a eficácia terapêutica global no tratamento do câncer.

A NAD(P)H:quinona oxidorredutase 1 (NQO1) é uma flavoproteína que está elevada nos tecidos tumorais na faixa de 100-200 vezes comparada à de tecidos normais. A oxidorredutase de dois elétrons é uma enzima desintoxificante de fase II indutível capaz de desintoxicar quinonas formando hidroquinonas estáveis. A NQO1 mostrou expressar em nível basal baixo em tecidos humanos normais onde protege as células contra ciclagem redox e estresse oxidativo e estabiliza o supressor p53. A NQO1 é constitutivamente superexpressa em vários cânceres incluindo mama, pâncreas e carcinomas espinocelulares. A superexpressão de NQO1 promove a progressão da carga cancerosa e torna as células cancerosas mais resistentes a fármacos quimioterápicos como 5-FU ou cisplatina (indutores de estresse oxidativo) tornando a NQO1 um alvo oncogênico potencial para melhorar a eficácia terapêutica. Foi relatado que a supressão de NQO1 por siRNA aumentou o efeito citotóxico de múltiplos fármacos como gemcitabina ou doxorrubicina. Além disso, vários inibidores sintéticos e naturais de NQO1 são relatados como cumarinas, curcuminas ou ES936. Neste estudo, empregamos β-lapachona (β-lap, 3,4-Dihidro-2,2-dimetil-2H-nafto[1,2-b]pirana-5,6-diona) como inibidor de NQO1. O β-lap age através de mecanismo dependente de NQO1 e cria quantidade significativa de espécies reativas de oxigênio (ERO) que levarão a danos às fitas de DNA e causarão morte de células cancerosas.

O emprego de nanopartículas para entrega sistêmica de pequenas moléculas torna-se uma abordagem promissora no tratamento do câncer. Nanopartículas carregadas de fármacos requerem menos esquema de dosagem e mostraram melhorar a eficácia anticâncer e reduzir relativamente os efeitos adversos. Entre todos os carreadores, nanopartícula de sílica mesoporosa (MSN) tem potencial significativo para entregar eficazmente a carga aos tecidos tumorais. Os poros de tamanho micrométrico permitem carregamento estável dos fármacos e previnem sua liberação na circulação sistêmica e permitem acúmulo preferencial nos tecidos cancerosos com vazamento usando efeito de permeação e retenção aumentada (EPR).

No geral, o principal objetivo do presente estudo foi combinar os benefícios terapêuticos do 5-FU e inibidor de NQO1 para aumentar o efeito anticâncer em CECP. O efeito anticâncer in vitro foi analisado usando várias técnicas como viabilidade celular, análise de western blot, ensaio de apoptose por citometria de fluxo/Hoechst e ensaio vivo/morto. Estudos in vivo foram realizados no modelo xenoenxertado portador de células tumorais Cal33.

Conclusão

Em resumo, formulamos com sucesso nanopartículas de sílica mesoporosa revestidas por bicamada lipídica carregadas com 5-FU+β-lap. Demonstramos que (i) efeito antitumoral do β-lap de maneira dependente de concentração em células tumorais de CECP, (ii) combinação de 5-FU+β-lap resulta em inibição significativa da proteína NQO1 e proteína Bcl-2, (iii) FNQ-MSN baseada em combinação demonstrou redução significativa da carga tumoral em xenoenxerto de CECP. Estes dados apontam inequivocamente para o fato de que dose subletal de inibidor de NQO1 (β-lap) poderia potencialmente aumentar a eficácia terapêutica do 5-FU em tumores de CECP e potencialmente ser estendido ao tratamento clínico de outras malignidades.

Materiais e Métodos

Preparação de Nanopartículas de Sílica Mesoporosa com Bicamada Lipídica Carregadas com 5-FU/β-lap

O MSN carregado de fármaco foi preparado dissolvendo brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) (210 mg) em 180 ml de água e fervido a 80 °C, seguido pela adição de 5-FU e β-lap a 20% p/p do total de nanopartículas e então fluoreto de amônio (NH4F) (30 mg) foi adicionado e agitado bem por 60 min. Em seguida, 1,6 ml de ortossilicato de tetraetila (TEOS) foi adicionado de forma gota a gota por 30 min e agitado continuamente por 3 h. Coloides brancos semi-transparentes foram formados, coletados após centrifugação (15 min) a 10000 rpm a 24 ± 1 °C. Os MSN foram ressuspensos em água ultrapura, e o ciclo de centrifugação foi repetido 2 vezes. Separadamente, uma membrana de filme fino foi preparada usando DSPE-PEG2000 (2% do peso total do MSN) e hidratada com água suspensa com MSN carregado de fármaco. A mistura foi imediatamente sonicada com sonda por 5 min a 50 W à temperatura ambiente (25 °C). O MSN suportado por bicamada lipídica PEGilada foi finalmente lavado duas vezes e ressuspenso em água ultrapura.

Análise de Tamanho de Partícula, Potencial Zeta e Morfologia

O diâmetro de partícula, índice de polidispersibilidade (PDI) e potencial zeta foram avaliados usando Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). As partículas foram analisadas usando mecanismo de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e dispersões de partículas foram bem diluídas antes do experimento. Todos os experimentos foram realizados em triplicata à temperatura ambiente. A morfologia das nanopartículas foi determinada por microscopia eletrônica de transmissão (MET) usando CM 200 UT, Philips, MA, EUA) operado a 100 kV. Brevemente, dispersões de partículas foram diluídas, uma gota foi colocada em grade de MET de 300 malhas e deixada assentar por 10 min. As partículas foram contrasteadas com 2% de ácido fosfotúngstico (PTA) como coloração negativa, secas ao ar e observadas sob microscópio MET.

Carga de Fármaco

Análise de carga de fármaco de duas vias foi realizada calculando o fármaco não carregado ou livre no sobrenadante e fármaco carregado na nanopartícula. A eficiência de carga de fármaco foi realizada pelo método HPLC. O HPLC foi equipado com bomba Shimadzu LC-20 AD PLC e detector SPD-M20A PDA e software de análise Shimadzu LC contendo coluna de fase reversa C18 (Phenomenex C18, 150 4,6 mm, 5 μm). A fase móvel para 5-FU consiste em mistura de acetonitrila e água (10:90, v/v) bombeada a taxa de 1 ml/min. O comprimento de onda de detecção definido a 265 nm para 5-FU. A fase móvel para β-lap consistindo de acetonitrila/água (31:69, v/v) e comprimento de onda de detecção definido a 254 nm a 35 °C. A capacidade de carga (LC) e eficiência de carga (LE) de 5-FU/β-lap foram calculadas usando as respectivas fórmulas.

Estudo de Liberação de Fármaco

A liberação de 5-FU e β-lap foi avaliada em PBS (pH 7,4) e ABS (pH 5,0) a 37 °C usando método de diálise. Brevemente, 1 mg equivalente de cada nanopartícula carregada de fármaco foi carregado em membrana de diálise em 1 ml de respectivo tampão e as extremidades seladas. A membrana de diálise selada foi colocada em 25 ml de respectivo ABS e PBS tampão e colocada em banho de água com agitação a 37 °C. Amostras foram coletadas em intervalos de tempo predeterminados e substituídas com volume igual de tampão fresco. A quantidade de fármaco liberado no respectivo tampão foi avaliada pelo método HPLC como descrito na seção anterior.

Cultura Celular e Ensaio de Atividade da NAD(P)H:Quinona Oxidoredutase 1 (NQO1)

A célula CECP Cal33 foi cultivada em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de SFB e 1% de mistura de antibióticos. As células foram mantidas em condições ambientes em incubadora. Para ensaio de atividade da NQO1, células Cal33 foram semeadas em placa de 96 poços com densidade de semeadura de 8 × 10³ células por poço e incubadas durante a noite. As células foram tratadas com diferentes concentrações de β-lap e incubadas por 24 h. 0,8% de digitonina (50 μl de 2 nM EDTA) foi usada para lisar as células e o ensaio foi realizado usando menadiona e MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) como reação de acoplamento de substrato e atividade medida a 620 nm. O ensaio foi realizado em triplicata.

Ensaio de Viabilidade Celular In Vitro

Ensaio de viabilidade celular de β-lap em concentração crescente e ensaio de viabilidade celular de regimes individuais e combinacionais foram testados por ensaio 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (MTS). Brevemente, células Cal33 foram semeadas em placa de 96 poços com densidade de semeadura de 1 × 10⁴ células por poço e incubadas durante a noite. No dia seguinte, células foram tratadas com concentração crescente de β-lap, separadamente; células foram tratadas com regimes individuais e combinacionais de 5-FU e β-lap a concentração base de 5, 10 e 20 μg/ml e incubadas por 24 h. As células foram lavadas duas vezes e tratadas com solução MTS conforme orientações do fabricante. A viabilidade celular foi calculada em relação a células não tratadas, e um leitor de microplacas foi usado para absorbância a 460 nm.

Análise de Western Blot

As células semeadas em placa de 6 poços foram tratadas com concentração crescente de β-lap, separadamente; células foram tratadas com regimes individuais (5-FU ou β-lap) e combinacionais de 5-FU e β-lap (FNQ-MSN) e incubadas por 24 h. As células foram colhidas, lisadas (buffer M-per), centrifugadas, e o sobrenadante contendo proteína foi coletado. A concentração de proteína no lisado celular foi avaliada usando método de ácido bicinconínico (BCA). Gel de poliacrilamida Bis-Tris a 10% foi usado para separar as proteínas e imediatamente transferido para membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). A membrana foi bloqueada usando 5% leite desnatado preparado em buffer Tris tamponado com salina (TBS) contendo Tween 20 (TBST, pH 7,2). Anticorpos primários de NQO1 policlonal de coelho (1:1000), Bcl-2 monoclonal de camundongo (1:1000) e GAPDH monoclonal de camundongo (1:1000) foram incubados na membrana durante a noite a 4 °C. A membrana foi lavada com TBST e então incubada com anticorpos secundários (anti-camundongo ou anti-coelho IgG) a diluição de 1:10000. A membrana foi novamente lavada com TBST e os blotts expostos a solução de substrato ECL e densidades das bandas proteicas avaliadas usando fotodesenvolvedor.

Análise de Apoptose e Hoechst

Células Cal33 foram semeadas em placa de 6 poços com densidade de semeadura de 2 × 10⁵ células por poço e incubadas durante a noite. As células foram então tratadas com regimes individuais (5-FU ou β-lap) e combinacionais de 5-FU e β-lap (FNQ-MSN) e incubadas por 24 h. As células foram colhidas, lavadas, centrifugadas e pelletizadas. As células foram tratadas com 2,5 μl de anexina V e 2,5 μl de PI e incubadas por 15 min em condições de escuro. As células foram então completadas a 1 ml e avaliadas usando classificação de células ativada por fluorescência (FACS, BD, FACSverse). Um total de 10.000 células foram analisadas. Procedimento similar para semeadura celular e tratamento com fármaco foi seguido e então coradas com corante Hoechst 33342 (10 μg/ml) e incubadas por 10 min. As células foram lavadas e fixadas com 4% paraformaldeído (PFA) e lavadas novamente. A morfologia celular foi observada sob microscópio de fluorescência (Nikon A1, Japão).

Eficácia Antitumor do FNQ-MSN no Modelo Xenoenxertado de Tumor CECP

Camundongos BALB/c machos de 18 a 22 g com média de 4-5 semanas de idade foram obtidos do Centro de Instalação Animal Próprio da Universidade de Indústria Leve de Zhengzhou, Henan. Os animais foram mantidos em sala climatizada com ciclo escuro-claro de 12 h e dado acesso livre a comida e água. Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Indústria Leve de Zhengzhou, Henan. Para estabelecer modelo xenoenxertado, 1 × 10⁷ células Cal33 em 150 μl de meio de cultura foram inoculadas no quadril direito do camundongo subcutaneamente. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 80-100 mm³, camundongos foram randomicamente divididos em 5 grupos para controle, 5-FU, β-lap, 5-FU+β-lap e FNQ-MSN, respectivamente com 8 camundongos em cada grupo. O 5-FU foi administrado em dose fixa de 5 mg/kg e β-lap em dose fixa de 25 mg/kg e administrado 3 vezes com intervalo de 3 dias para cada injeção na veia caudal. Peso do camundongo e volume tumoral foram monitorados regularmente por 18 dias. O volume tumoral foi calculado usando a fórmula:

V (mm³) = Largura² (mm²) × Comprimento (mm) / 2

O presente estudo não observou morte de camundongo devido à carga de células tumorais e todos os animais foram eutanasiados com CO₂ e depois sacrificados por dislocação cervical no final do estudo.

Análise Estatística

Múltiplos grupos foram comparados usando análise de variância bidirecional (ANOVA). Nível de significância de p < 0,05 foi considerado significativo e todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão a menos que especificamente mencionado nos respectivos experimentos.

Resultados e Discussão

Preparação de Nanopartículas de Sílica Mesoporosa Suportadas por Bicamada Lipídica Carregadas com 5-FU/β-lap

Neste estudo, personalizamos uma nanopartícula de sílica mesoporosa estabilizada por bicamada lipídica PEGilada. O MSN carregado com 5-FU/β-lap foi preparado pelo método de emulsão-sonicação, e então o MSN carregado de fármaco foi introduzido no frasco contendo filme fino lipídico consistindo de DSPE-PEG2000. A mistura foi sonicada e o MSN revestido por lipídio contendo 5-FU/β-lap foi obtido (FNQ-MSN) (Fig. 1a). Eficiências de carga (LE) de 5-FU e β-lap foram 91,5 ± 1,65% e 92,9 ± 1,24%, respectivamente. O FNQ-MSN exibiu 8,1 ± 1,12% p/p de 5-FU e 7,6 ± 0,95% p/p de β-lap indicando alta capacidade de carga (LC) do carreador MSN. A presença de bicamada lipídica prevenirá sua liberação indesejada na circulação sistêmica e, assim, previne a toxicidade. O tamanho médio de partícula do MSN carregado de fármaco foi 92,1 ± 0,85 nm (PDI ~ 0,089) enquanto a montagem de bicamada lipídica na superfície do MSN (FNQ-MSN) aumentou o tamanho médio de partícula para 128,4 ± 1,24 nm (PDI ~ 0,115) indicando presença sólida de materiais lipídicos na superfície do MSN (Fig. 1b). O potencial zeta mudou de −18,2 ± 1,22 para −26,4 ± mV. O pequeno tamanho de partícula do FNQ-MSN permitirá acúmulo preferencial do carreador carregado de fármaco nos tecidos tumorais com vazamento por virtude do efeito EPR. Além disso, a PEGilação de superfície conferirá excelente estabilidade e tempo prolongado de circulação sanguínea que aumentará ainda mais as chances do FNQ-MSN nos tecidos tumorais. Imagem MET mostrou semelhança morfológica com lipossomo e apresentou forma esférica perfeita uniformemente espalhada na grade. Imagem MET mostrou claramente camada externa acinzentada e núcleo mais escuro indicando presença de montagem lipídica na superfície do MSN (Fig. 1c). O tamanho observado do MET corrobora com o tamanho de partícula DLS do zetasizer. MSN possui canais bem ordenados para distribuição homogênea de moléculas de fármaco. A propriedade de superfície dos poros é um dos fatores importantes no carregamento estável de pequenas moléculas. As várias forças físicas envolvidas na interação hospedeiro-hóspede incluem principalmente forças hidrofóbicas e forças de interação van der Waals. A maior capacidade de carga de fármaco fornecerá maior concentração intracelular e maior eficiência de morte nos sítios tumorais. O FNQ-MSN exibiu excelente estabilidade no meio PBS e o tamanho de partícula permaneceu inalterado durante todo o período do estudo até 30 dias. Tal estabilidade melhorada do sistema carreador e alta capacidade de carga do sistema carreador melhorarão a biodistribuição e eficiência no tratamento tumoral.

Liberação de Fármaco In Vitro

A liberação in vitro de 5-FU e β-lap do FNQ-MSN foi estudada em PBS e ABS (Fig. 2). Como mostrado, duas tendências diferentes de liberação foram observadas em pH 7,4 e pH 5,0. Por exemplo, 25% de 5-FU liberado em 24 h em pH 7,4 comparado a ~40% de liberação de fármaco em pH 5,0 em 24 h. Similarmente, 20% e 30% de β-lap foram liberados em pH 7,4 e pH 5,0, respectivamente. A cinética de liberação foi idêntica durante todo o período do estudo com 50% de 5-FU liberado em tampão alcalino e 80% de liberação de fármaco a pH 5,0 após 72 h de período de estudo. Liberação de fármaco responsiva a pH em condições ácidas é vantajosa para tratamento do câncer. Nenhum fenômeno de liberação em explosão foi observado em ambas as condições de pH, principalmente atribuído à presença da camada DSPE-PEG que controlou a liberação do fármaco do FNQ-MSN durante todo o período do estudo. Diferença significativa na liberação de fármaco foi observada entre condições de pH 7,4 e pH 5,0. Em condições de pH 7,4, PEG-b-DSPE exibe propriedade de camada furtiva alta prevenindo liberação do composto encapsulado. O resultado presente mostrou que a liberação de fármaco acelerou a pH 5,0, indicando desmontagem da casca protetora ao redor da superfície do MSN. A taxa de liberação de fármaco sensível a pH, que garante liberação máxima dentro das células cancerosas, pode melhorar eficácia antitumoral e diminuir toxicidade indesejada a tecidos normais. É possível que na presença de elemento responsivo a pH, FNQ-MSN resulte na eliminação da bicamada lipídica no MSN resultando em liberação aumentada em condições de pH mais baixo.

Sensibilidade da NQO1 ao β-lap

Como a regulação positiva de NQO1 em muitas células cancerosas incluindo CECP associada a prognóstico ruim e resultado terapêutico ruim, fármacos alvejando NQO1 poderiam ser estratégia potencial para tratamento do câncer. A NQO1 é superexpressa no nível variando de 100 a 200 vezes em carcinoma espinocelular comparado àquele associado a tecidos normais. Portanto, influência do β-lap na atividade enzimática da NQO1 foi estudada em células Cal33. Como mostrado, β-lap mostrou inibição dependente de concentração da atividade enzimática da NQO1 em células Cal33 (Fig. 3a). Notavelmente, efeito inibitório significativo foi observado na dose de 20–50 μg/ml de β-lap. Além disso, potencial inibitório do β-lap na proteína NQO1 foi estudado por análise de western blot (Fig. 3b). Resultados revelaram claramente diminuição significativa na proteína NQO1 nas células cancerosas com aumento na concentração de β-lap. Aproximadamente 80% de inibição da NQO1 observada a 100 μg/ml de β-lap. Fármaco bioativável por NQO1 como β-lap é metabolizado por NQO1 e forma composto hidroquinona instável que imediatamente converte de volta ao componente original deixando 2 oxidações de um elétron e consumindo 2 O²⁻. Isso criará ciclo redox fútil no qual 1 molécula de β-lap gerará 130 moles de superóxido ao custo de consumir 60-70 moles de NAD(P)H6. O superóxido (O2.−) formado será convertido a peróxido de hidrogênio (H2O2−) e causará apoptose e morte celular.

Efeito Anticâncer In Vitro do FNQ-MSN em Células CECP

O efeito anticâncer in vitro do β-lap em célula Cal33 foi estudado por ensaio MTT. Resultados revelaram que β-lap exibiu diminuição típica dependente de concentração na viabilidade celular (Fig. 4a). Notavelmente, diminuição significativa na viabilidade celular foi observada na concentração de 50 μg/ml. Para experimentos futuros, 20 μg/ml foi selecionado (abaixo do valor IC50 do β-lap). Em seguida, efeito de potencialização do β-lap no 5-FU foi estudado em 3 diferentes concentrações (5, 10 e 20 μg/ml). Como mostrado, combinação de 5-FU+β-lap resultou em menor viabilidade celular; mais notavelmente, FNQ-MSN exibiu viabilidade celular significativamente menor comparada à de qualquer fármaco individual ou combinações físicas (Fig. 4b). Por exemplo, 5-FU e β-lap mostraram viabilidade celular de 35,7% e 70,2% enquanto 5-FU+β-lap mostrou 26,5% e FNQ-MSN mostrou 13,1%, respectivamente. Resultados mostraram claramente que o efeito citotóxico do 5-FU foi significativamente aumentado quando combinado com β-lap. Vale notar que FNQ-MSN foi mais eficaz comparado à 5-FU+β-lap atribuído à melhor internalização e liberação controlada de terapêuticos carregados do sistema carreador. Resultados revelam claramente o efeito inibitório do β-lap na atividade enzimática e níveis de proteína da NQO1 e potencializou o efeito anticâncer do 5-FU resultando em resultado terapêutico aprimorado no tratamento de CECP.

Papel do FNQ-MSN nas Vias de Sinalização: Análise de Western Blot

O mecanismo do efeito citotóxico mediado por β-lap foi explorado mais por análise de western blot. Como mostrado, β-lap resultou em diminuição na banda proteica de NQO1 comparado ao controle; porém, diminuição mais notável no nível de NQO1 foi observada no grupo de células tratadas com FNQ-MSN (Fig. 4c). O aumento da quimiossensibilidade de Cal33 induzido por β-lap pelo aumento da apoptose celular foi avaliado através do nível de proteína Bcl-2. A família Bcl-2 desempenha papel importante na regulação da homeostase celular e controla proliferação e morte de células cancerosas. O processo de diminuição de Bcl-2 e aumento de Bax resulta na liberação do citocromo C no citosol que iniciará toda a cascata de caspase resultando em morte celular. Resultados destacaram claramente que a combinação de 5-FU e β-lap (FNQ-MSN) regulou negativamente significativamente o Bcl-2 indicando efeito anticâncer aprimorado nas células cancerosas Cal33.

Análise de Apoptose de CECP

Seguindo a análise de viabilidade celular, efeito de apoptose de fármacos individuais e combinados em células Cal33 foi avaliado por citometria de fluxo após coloração com anexina V/PI (Fig. 5). O efeito de apoptose de 5-FU individual (10 μg/ml) ou β-lap (30 μg/ml) não resultou em apoptose apreciável de células cancerosas; porém, 5-FU+β-lap resultou em aumento dramático na proporção de apoptose de células cancerosas. Importante, FNQ-MSN resultou em mais de 60% de apoptose celular (precoce e tardia) significando efeito terapêutico superior de regime combinacional baseado em carreador. Efeito de apoptose foi confirmado adicionalmente por coloração Hoechst 33342. Como mostrado, células tratadas com FNQ-MSN resultam em maior quantidade de células sofrendo apoptose, condensação nuclear e características de fragmentação comparadas àquelas de 5-FU ou β-lap sozinhos (Fig. 6). Durante o processo de apoptose, células encolhem sem serem danificadas na membrana celular externa e resulta em condensação de cromatina com aumento de formação de corpos apoptóticos.

Ensaio Vivo/Morto

O efeito anticâncer de fármacos individuais e combinados foi avaliado adicionalmente pelo ensaio Vivo/Morto. As células tratadas foram submetidas a coloração com Calceína AM e brometo de etídio como marcadores respectivos de células vivas e mortas (Fig. 7). Como mostrado, células não tratadas são coradas com 100% de fluorescência verde. Os fármacos individuais, 5-FU (10 μg/ml) ou β-lap (30 μg/ml) embora mostrassem células coradas com leve fluorescência vermelha; porém, células predominantes exibiram fluorescência verde indicando morte celular limitada. Morte celular notável foi observada em células cancerosas tratadas com FNQ-MSN como mostrado por fluorescência vermelha predominante e poucas células coradas com fluorescência verde. O maior efeito anticâncer do FNQ-MSN foi atribuído à atividade sinérgica de 5-FU e β-lap nas células cancerosas e à capacidade do β-lap de aumentar a quimiossensibilidade do 5-FU.

Eficácia Antitumor In Vivo do FNQ-MSN Contra Modelo Xenoenxertado de CECP

Para avaliar ainda mais a eficácia do regime combinacional em modelo animal, xenoenxerto de CECP foi preparado e administrado com 5 mg/kg de 5-FU e 10 mg/kg de β-lap, respectivamente. O grau farmacêutico de β-lap é ARQ761 que está atualmente em ensaio clínico de fase I para tratamento de malignidades metastáticas. β-lap estabeleceu limite para dose máxima tolerável em humanos conforme estudos pré-clínicos. Mantendo isso em mente, selecionamos otimamente dose de 10 mg/kg de β-lap para estudos in vivo. Como mostrado, nenhuma diminuição significativa no volume tumoral foi observada com 5-FU e β-lap administrados individualmente comparados ao controle não tratado (Fig. 8a). Diminuição notável no volume tumoral foi observada com mistura física de 5-FU+β-lap; porém, tratamento combinado de 5-FU e β-lap baseados em carreador (FNQ-MSN) atrasou significativamente o crescimento tumoral e prolongou a sobrevivência de camundongos xenoenxertados portadores de tumor. O gráfico de volume tumoral do FNQ-MSN pôde ser dividido em duas partes; crescimento insignificante no volume tumoral observado até dia 9 enquanto tumor aumentou significativamente após dia 9 até dia 18, no entanto, volume tumoral global foi múltiplas vezes menor comparado ao controle ou outros grupos. A preocupação de toxicidade dos regimes individuais e combinacionais foi avaliada em termos de peso corporal (Fig. 8b). Como mostrado, mistura física de 5-FU+β-lap resultou em toxicidade severa representada por mais de 10% de perda de peso corporal enquanto 5-FU resultou em 5% de perda de peso corporal. Como esperado, FNQ-MSN não resultou em nenhuma perda de peso corporal indicando vantagem única do sistema carreador baseado em MSN-lipídio. O efeito antitumoral aprimorado do FNQ-MSN foi atribuído ao efeito inibitório do β-lap em direção à enzima e proteína NQO1 que por sua vez aumentou a quimiossensibilidade do 5-FU e resultou em efeito anticâncer sinérgico nos tumores humanos Cal33, segundo, MSN revestido por bicamada lipídica protegeu o fármaco durante circulação sistêmica e pode liberar de maneira controlada no tecido tumoral, terceiro, PEGilação do nanocarreador pode prolongar tempo de circulação sanguínea permitindo acúmulo preferencial nos tecidos tumorais devido ao efeito EPR. MSN PEGiladas foram principalmente aprisionadas no RES do fígado, baço e pulmão, contabilizando mais de 80% da dose administrada. Modificação PEG do MSN obviamente diminuiu taxa de clearance do MSN em órgãos, demonstrando que NPs PEGiladas foram mais difíceis de remover dos órgãos RES independentemente da forma da partícula. No geral, estudo in vivo no modelo CECP oferece "prova de conceito" que combinação eficaz de 5-FU+β-lap em nanocarreador estável pode aumentar eficácia terapêutica no tumor enquanto alivia efeito tóxico associado.