Detecção Avançada de miRNA-335-5p Usando Eletrodos Interdigitalados para Avaliar Gravidade de Aneurisma Aórtico Abdominal

Resumo

Aneurisma aórtico abdominal (AAA) refere-se ao alargamento da artéria inferior da aorta abdominal, e a identificação de uma ferramenta de detecção precoce é urgentemente necessária para diagnóstico. No estudo atual, uma superfície de sensoriamento de eletrodo interdigitalado (IDE) foi usada para identificar miRNA-335-5p, que reflete a formação de AAAs. A uniformidade do material de sílica foi observada por profilometria 3D, e a superfície quimicamente modificada altamente condutiva melhorou a detecção via modo I-V. O miRNA-335-5p alvo foi detectado de maneira dependente da dose e, baseando-se em análises de regressão linear e 3σ, a sensibilidade foi determinada em 1 fM com sonda biotinilada. A alta especificidade foi mostrada discriminando a sequência alvo de sequências não complementares e com mismatch simples e triplo. Esses resultados demonstraram a detecção de alto desempenho de miRNA-335-5p com boa reprodutibilidade para determinação da gravidade de AAA.

Introdução

Aneurismas aórticos abdominais (AAAs) são doenças que ameaçam a vida, definidas como aorta abdominal com diâmetro > 3 cm ou maior que o normal. Esta condição ocorre com aterosclerose ou acúmulo de placa, que enfraquece as paredes da aorta abdominal e resulta em uma protuberância para fora, semelhante a um balão. Com o tempo, a parede da artéria se alarga, e esta situação é comparável ao envelhecimento de mangueiras de jardim. A pressão do sangue bombeando através da aorta causa esta área enfraquecida a protuberar para fora, o que é chamado de aneurisma. AAA é formado quando a porção enfraquecida da aorta leva a complicações. AAA pode levar à morte causada por ruptura em aneurismas pequenos. Atualmente, exames físicos, angiografias por tomografia computadorizada, ressonância magnética e ultrassonografia são usados para diagnosticar esta condição. No entanto, não há métodos de detecção para AAA, que é comumente identificado enquanto se analisa outros problemas de saúde. Isso resulta em identificação tardia de AAA, causando problemas de saúde desnecessários. Para superar este problema, pesquisadores precisam desenvolver métodos de detecção precoce, e uma estratégia potencial é o desenvolvimento de um sistema de sensoriamento.

Detecção precoce, rápida e sensível de doença de maneira quantitativa é objetivo vital para diagnósticos clínicos. As atuais plataformas de biossensoriamento atenderam várias demandas e requerem configurações laboratoriais adequadas e treinamento. Assim, a maioria dos métodos não é portátil, o que é requerido para detecção point-of-care ideal. Além disso, para auxiliar médicos na tomada de decisão de maneira precisa e rápida, uma análise das mudanças nos níveis de biomarcadores é altamente desejável. Biomarcadores circulantes expressos em áreas específicas devem ser investigados para diagnosticar AAA e acompanhar o progresso do tratamento. A identificação desses tipos de biomarcadores circulantes ajudará a diagnosticar a doença e realizar acompanhamento do paciente após tratamento. Para atender estas necessidades, este estudo propõe gerar sensores de biomarcadores apropriados para AAA. O sensor (eletrodo interdigitalado) proposto neste estudo tem potencial para análise de alto desempenho com ampla gama de biomarcadores. É um sistema dielétrico com gaps e dedos alternados que operam sob medidas dielétricas.

Os biomarcadores podem ser quaisquer biomoléculas, incluindo DNA, RNA, proteínas, carboidratos, lipídios e suas formas modificadas. Além disso, pesquisadores propuseram que diferentes biomarcadores, como RNAs não codificantes, são expressos no sistema celular, mas não serão traduzidos em proteínas. RNAs não codificantes geralmente não são traduzidos em proteínas e geralmente têm sequências curtas. Diferentes classes de RNAs não codificantes, como microRNAs (miRNAs), RNAs ribossômicos, RNAs de transferência, RNAs nucleolares pequenos, RNAs nucleares pequenos, RNAs telomerase, snRNAs, RNAs Xist, RNAs vault e RNAs 7SL, foram relatados. miRNAs funcionam principalmente na regulação transcripcional e pós-transcripcional da expressão gênica e frequentemente resultam em silenciamento gênico. Recentemente, pesquisadores descreveram a importância de miRNAs para predição de AAA e relataram redução na expressão de miRNA-335-5p em pacientes com AAA. Foi provado que a combinação de fatores clínicos e expressão de microRNAs melhorou drasticamente a predição de doenças e exibiu maior precisão. Pesquisadores focaram especificamente em miRNA-335-5p, que exibiu faixa significativamente mínima em indivíduos com AAA de crescimento rápido. Além disso, uma diminuição nos níveis de miRNA-335-5p aumentou a confiança na detecção de AAA crescente. Em outras palavras, a saída negativa (níveis mais altos) de miR-335-5p indica a gravidade de AAA e minimiza triagem trabalhosa. Esta descoberta foi demonstrada por Wanhainen et al. e revelou que miRNAs são biomarcadores úteis para triagem de AAA e eliminação do risco de AAA de crescimento rápido. O estudo atual demonstra a aplicação de detecção de miRNA-335-5p por sensor de eletrodo interdigitalado (IDE) para determinar a gravidade de AAA em indivíduos afetados.

Materiais e Métodos

Reagentes e Biomoléculas

Estreptavidina, 1,1'-carbonyldiimidazol (CDI) e solução tampão fosfato (PBS) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, EUA. Etanolamina foi adquirida da Fisher Scientific, Reino Unido. Todos os oligos foram sintetizados comercialmente pela Apical Scientific Sdn. Bhd., Malásia.

Design de Padrão em Máscara de Cromo

Inicialmente, o padrão do sensor dielétrico foi desenhado usando software AutoCAD. As dimensões desejadas eram comprimento de 7500 μm, largura de 4100 μm, 20 pares dedo-gap, tamanho de gap de 85 μm, tamanho de eletrodo de 100 μm, espessura de eletrodo de 40 nm, e comprimento de dedo de 4000 μm. O padrão foi impresso em uma fotomáscara em branco e colado na superfície do vidro de cromo. Este vidro de cromo foi fixado sob sistema de exposição UV para procedimento de transferência de padrão. Um substrato de dióxido de silício depositado com filme fino de alumínio foi colocado na direção oposta contra o vidro de cromo e exposto à luz UV por 10 s. O padrão foi transferido seguido pelo processo de revelação usando revelador de resist.

Fabricação do Eletrodo Interdigitalado

O eletrodo de superfície foi produzido via processo convencional de microfabricação eletrônica para fabricar a superfície como segue: (i) Um wafer de 4 polegadas com óxido nativo existente foi preparado. (ii) O wafer foi limpo usando gravação de óxido tamponado (BOE) e solução piranha para remover óxido nativo e contaminantes inorgânicos. (iii) Camada de óxido de 2800 Å foi crescida via uma hora de oxidação térmica úmida a 1000 °C. (iv) O wafer com camada de óxido foi dividido em quatro para melhor manuseio. (v) Camada metálica foi depositada com l como camada de adesão para camada condutiva. Camada de alumínio (40 nm) foi produzida a 3 cm de comprimento com diâmetro de 0,5 mm via método de deposição física baseada em evaporador térmico, (vi) Camada de fotoresist positivo foi spin-coated no substrato, (vii) O wafer foi soft-baked a 90 °C por 60 s. (viii) O wafer foi alinhado com máscara de cromo e exposto à luz UV por 10 s. (ix) O wafer foi enxaguado em solução reveladora RD6 dentro de 15 s para remover área não exposta, resultando no padrão de eletrodo interdigitalado (IDE) com óxido. (x) O wafer foi hard-baked a 90 °C por 120 s. (xi) O wafer foi gravado usando água régia para remover área exposta de ambas as camadas. (xii) O padrão de superfície foi produzido, e o fotoresist restante foi lavado usando acetona. Então, análise de nanofotometria 3D (Hawk 3D-profilometry, EUA) foi realizada para observar imagem clara dos gaps entre eletrodos. Medidas de corrente (A) foram realizadas usando Keithley 6487 com varredura linear de 0 a 2 V em passo de 0,1 V (a 20 s).

Funcionalização Química da Superfície: Estratégia Tetravalente Estreptavidina-Biotina

Para funcionalização química da superfície, a superfície de sílica foi inicialmente lavada completamente com 1 M hidróxido de potássio (pH 9,0) para ativar a superfície. Esta superfície foi modificada adicionalmente por CDI (0,5 M) com período de incubação de 1 h para reagir com 100 nM estreptavidina (por 1 h), diluída do estoque original em 10 mM tampão fosfato salino (PBS; pH 7,4). Após esta etapa, os espaços não reagidos foram bloqueados usando 1 M etanolamina (por 1 h). Então, a estreptavidina tetravalente reagiu com 1 μM de sonda miRNA-335-5p biotinilada (por 10 min) a temperatura ambiente. Após conclusão de cada modificação, a superfície foi completamente lavada com PBS a menos que declarado de outra forma.

Design das Sequências Sonda e Alvo do miRNA-335-5p

O miRNA-335-5p de comprimento total (5′-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3′) com código de acesso MIMAT0000765 foi coletado do banco de dados. A região desejada para este estudo como alvo é 5′-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3′. Para capturar a região alvo miRNA-335-5p, a sonda foi desenhada como 5′-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3′. Na extremidade 3′, biotina foi marcada para interagir com estreptavidina imobilizada na superfície de sensoriamento. A estrutura secundária do miRNA-335-5p de comprimento total foi prevista por software mfold online (https://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold).

Interações Sonda-Alvo: Sequências miRNA-335-5p

Após ligação da sonda biotinilada à superfície de estreptavidina como detalhado acima, a sequência alvo miRNA-335-5p interagiu (por 10 min) a temperatura ambiente desde baixo femtomolar até baixo nanomolar. Estas concentrações variaram de 1 fM a 1 nM com diluições seriadas 10 vezes em PBS. Os anexos foram testados independentemente de concentrações menores para maiores, e após formação de duplo, a superfície foi lavada com 5 volumes de PBS, e medidas foram tomadas.

Medidas I-V

As caracterizações elétricas foram realizadas por medidas I-V usando um picoamperímetro Keithley 6487 com fonte de tensão/corrente. As medidas foram registradas nas tensões mencionadas na superfície nua seguida por cada modificação química da superfície. Similarmente, para análise interativa entre sonda e miRNA-335-5p alvo em cada concentração, a medida foi realizada após etapa de lavagem com 10 volumes de reação. Todas as modificações, interações e medidas foram mantidas sob condições úmidas a menos que declarado de outra forma.

Resultados e Discussão

Fabricação do Sensor IDE e Análise de Superfície

O estudo atual usou miRNA-335-5p como ferramenta para elucidar a gravidade de AAA por análise interativa em sensor de eletrodo interdigitalado (IDE) (Fig. 1). Para análise interativa com a sonda e o alvo desenhados do comprimento total de miRNA-335-5p, uma superfície IDE foi desenhada e fabricada usando técnicas fotolitográficas convencionais. Modificações de superfície passo a passo foram realizadas e medidas por um amperímetro (Fig. 2b, c). O alinhamento de máscara desenhado para fabricação de IDE e a uniformidade foram confirmados por análise de nanofotometria 3D de alta resolução. Esta observação confirmou que a fabricação e a distância entre cada dedo foram bem alinhadas (Fig. 2d). IDEs têm tamanho de eletrodo de ~100 μm com espaçamento de ~85 μm, e uma grande rede intercalada com milhões de biomarcadores em série/paralelo é formada. Para garantir o sucesso dos IDEs fabricados, usamos diferentes dispositivos nus para determinar a reprodutibilidade sob o sistema dielétrico. Este sistema mede as vibrações moleculares entre os dielétrodos causadas pelo momento dipolar (Fig. 2c). Este IDE dielétrico é um sistema bem aceito que tem sido amplamente usado para diferentes análises biomoleculares e químicas. Neste estudo, todas as modificações químicas de superfície e análises interativas foram medidas pelo modo de corrente I-V.

Montagem Molecular de Superfície de Alta Densidade: Estratégia Estreptavidina-Biotina

Anexos moleculares de alta densidade na superfície de sensoriamento ou biochips mostraram-se cruciais e altamente dependentes da funcionalização de superfície. Este estudo visou determinar a superfície apropriada necessária para alto número de acomodações moleculares, obrigatório para expressão gênica, descoberta e análise molecular. Para estas aplicações potenciais, a geração de superfícies de sistemas analíticos requer acoplamento adequado de moléculas para imobilizá-las em formatos apropriados. Estas superfícies de materiais foram estudadas para investigar o mecanismo interativo de superfície, pois são baratas e fornecem graus variados de densidades de empacotamento, morfologia e espessura. Esta descoberta facilitará a fixação adequada de moléculas e prevenirá a perda de atividade biomolecular. Além disso, a orientação correta de imobilização biomolecular é retida com confirmação estrutural secundária adequada.

Para alcançar moléculas de alta densidade na superfície, lavamos inicialmente a superfície de sílica completamente com solução alcalina e modificamos por CDI. Para capturar altos níveis de sondas biotiniladas na superfície CDI, imobilizamos a sonda com estreptavidina. Estreptavidina é uma proteína tetravalente com quatro sítios para ligar biotina e é considerada molécula de alta afinidade nas ciências biológicas. A superfície de IDE tinha nível de corrente de 2,08E−10 A, e após anexo de CDI, aumentou para 9,2E−06 A. Esta descoberta indica claramente que a superfície de IDE modificada por CDI é apropriada para nossas análises. Quando estreptavidina foi adicionada, o nível de corrente aumentou ainda mais para 2,36E−05 A. Usando esta estratégia, imobilizamos maior número de sondas biotiniladas desenhadas do miRNA-335-5p de comprimento total na superfície de IDE (Fig. 3a). Interações de biotina foram realizadas após etapa de bloqueio na superfície de IDE para mascarar áreas não reagidas. Com cada modificação de superfície, as mudanças na corrente foram determinadas (Fig. 3b). Como mostrado na Fig. 3c, após adição de etanolamina, as mudanças de corrente foram 2,53E−05 A, e quando 1 nM de sequência de captura biotinilada foi adicionada, o nível de corrente diminuiu para 1,29E−08 A. Esta mudança na corrente confirmou a imobilização da sonda de captura na superfície de sensoriamento IDE. Geralmente, um oligonucleotídeo de fita simples carrega carga mais negativa com espinha dorsal fosfato 5-carbonatada exposta (sonda), enquanto a carga líquida de etanolamina é neutra, conforme declarado pelo fornecedor. Esta grande diferença de carga resultou em variação aparente na corrente medida, como mostrado na Fig. 3c. Além disso, este parâmetro reverteu novamente após formação de duplo com a fita alvo. Esta descoberta se deve à redução na exposição da espinha dorsal fosfato, e as cargas positivas adicionais originam-se das bases nitrogenadas na fita de miRNA (Fig. 4a).

Análise Interativa Dependente de Dose no IDE

Após anexo da sonda biotinilada na superfície de sensoriamento, a análise interativa alvo foi realizada com diferentes doses. Esta validação foi realizada da faixa de baixo femtomolar a baixo nanomolar. Para garantir esta faixa, realizamos análise preliminar com 1 nM de sequências alvo miRNA-335-5p. Após adição de 1 nM da sequência alvo miRNA-335-5p na superfície de sonda de captura modificada, o nível de corrente mudou de 1,29 E−08 A para 1,29E−07 A (Fig. 4a); este resultado indicou que hibridização ocorreu entre a sonda de captura e a sequência alvo. Após esta confirmação, para determinar o limite de detecção, titularam a sequência alvo de 1 fM a 1 nM, que caiu independentemente nas superfícies de sonda de captura modificadas. As mudanças de corrente foram detectadas antes e depois da imobilização. As diferenças de corrente para hibridizações de 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM e 1 nM foram 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21 e 11,61E−08 A, respectivamente. Baseado nos resultados obtidos, claras mudanças de corrente dependentes de dose foram detectadas em todas as concentrações testadas da sequência alvo (Fig. 4b).

Alto Desempenho Analítico: Sensibilidade, Especificidade e Reprodutibilidade

Baseado nos resultados acima com incrementos dependentes de concentração, análise de regressão linear foi realizada. A sensibilidade da detecção foi estimada usando cálculo 3σ, e ficou em 1 fM (Fig. 5a, b). A concentração foi menor que 1 fM, mostrando sinal de fundo e valores menores. Além disso, análise de especificidade foi realizada para discriminar as sequências alvo das sequências não complementares e com mismatch simples e triplo. Foi aparente que a sonda desenhada mostrou reação mais forte com as sequências complementares perfeitas de miRNA-335-5p do que as outras sequências (Fig. 6a). Uma sequência com mismatch simples resultou em resposta de corrente mais alta que as sequências não complementares e com mismatch triplo devido à formação parcial de duplo pela sequência com mismatch simples na sequência da sonda. Análises de reprodutibilidade foram realizadas com todas as modificações químicas e biológicas na superfície de IDE em triplicata, e os dados foram calculados em média. Os dados médios indicam que não houve mudanças significativas quando diferentes experimentos foram realizados (Fig. 6b). Além disso, para apoiar o desempenho do IDE, as características dos métodos atualmente disponíveis foram comparadas (Tabela 1).

Conclusões

Desenvolvimento de método analítico usando biomarcadores biológicos auxilia no diagnóstico de AAA durante exames físicos. Na pesquisa atual, detecção mediada por miRNA-335-5p para predizer a gravidade de AAA foi desenvolvida, pois miRNA-335-5p foi encontrado expresso com AAA. A saída da detecção IDE gerada exibiu níveis de detecção mais baixos a mais altos para facilitar a predição da gravidade de AAA. O nível de detecção mais baixo foi 1 fM com alta especificidade e reprodutibilidade para análise de alto desempenho. O método tetravalente estreptavidina-biotina usado nesta pesquisa produziu boa saída e pode ser utilizado para outras análises de biomarcadores.