Detecção de microRNA-335-5p em uma superfície de eletrodo interdigitado para determinação da gravidade de aneurismas da aorta abdominal

Resumo

O aneurisma da aorta abdominal (AAA) refere-se ao alargamento da artéria inferior da aorta abdominal, e a identificação de uma ferramenta de detecção precoce é urgentemente necessária para o diagnóstico. No estudo atual, uma superfície de detecção de eletrodo interdigitado (IDE) foi usada para identificar miRNA-335-5p, que reflete a formação de AAAs. A uniformidade do material de sílica foi observada por profilometria 3D, e a superfície altamente condutora quimicamente modificada melhorou a detecção via modo I-V. O miRNA-335-5p direcionado foi detectado de maneira dependente da dose e com base na regressão linear e análises 3σ, a sensibilidade foi determinada como sendo 1 fM com uma sonda biotinilada. A alta especificidade foi mostrada discriminando a sequência alvo de sequências não complementares e não combinadas simples e triplas. Esses resultados demonstraram a detecção de alto desempenho de miRNA-335-5p com boa reprodutibilidade para determinação da gravidade de AAA.

Introdução

Os aneurismas da aorta abdominal (AAAs) são doenças potencialmente fatais definidas como uma aorta abdominal com diâmetro> 3 cm ou maior que o normal [1, 2]. Essa condição ocorre com aterosclerose ou formação de placa, que enfraquece as paredes da aorta abdominal e resulta em uma protuberância para fora, semelhante a um balão. Com o tempo, a parede arterial se alarga e essa situação é comparável ao envelhecimento das mangueiras de jardim. A pressão do sangue que bombeia pela aorta faz com que essa área enfraquecida se projete para fora, o que é chamado de aneurisma. O AAA é formado quando a porção enfraquecida da aorta leva a complicações [3,4,5,6]. O AAA pode levar à morte por ruptura em pequenos aneurismas. Atualmente, exames físicos, angiografias de tomografia axial computadorizada, ressonância magnética e ultrassonografia são usados para diagnosticar esta condição [7,8,9,10]. No entanto, não existem métodos de detecção para AAA, que é comumente identificado durante a análise de outros problemas de saúde. Esta situação resulta na identificação atrasada de AAA, causando problemas de saúde desnecessários. Para superar esse problema, os pesquisadores precisam desenvolver métodos de detecção precoce e uma estratégia potencial é o desenvolvimento de um sistema de detecção.

A detecção precoce, rápida e sensível da doença de maneira quantitativa é uma meta vital para o diagnóstico clínico. As atuais plataformas de biossensor atendem a várias demandas e exigem configurações e treinamento laboratoriais adequados. Portanto, a maioria dos métodos não é portátil, o que é necessário para a detecção ideal no ponto de atendimento [11, 12]. Além disso, para auxiliar os médicos na tomada de decisões de maneira precisa e rápida, uma análise das mudanças nos níveis de biomarcadores é altamente desejável. Biomarcadores circulantes que são expressos em áreas específicas devem ser investigados para diagnosticar AAA e acompanhar o progresso do tratamento. A identificação desses tipos de biomarcadores circulantes ajudará no diagnóstico da doença e no acompanhamento do paciente após o tratamento. Para atender a essas necessidades, este estudo se propõe a gerar sensores de biomarcadores adequados para AAA. O sensor (eletrodo interdigitado) proposto neste estudo tem potencial para análises de alto desempenho com uma ampla gama de biomarcadores. É um sistema dielétrico com gaps e dedos alternados que operam sob medidas dielétricas [13,14,15].

Os biomarcadores podem ser quaisquer biomoléculas, que incluem DNA, RNA, proteínas, carboidratos, lipídios e suas formas modificadas [16, 17]. Além disso, pesquisadores propuseram que diferentes biomarcadores, como RNAs não codificantes, são expressos no sistema celular, mas não serão traduzidos em proteínas [18]. Os RNAs não codificadores geralmente não são traduzidos em proteínas e geralmente têm sequências curtas [18,19,20,21]. Foram relatadas diferentes classes de RNAs não codificantes, como microRNAs (miRNAs), RNAs ribossômicos, RNAs de transferência, pequenos RNAs nucleolares, pequenos RNAs nucleares, RNAs de telomerase, snRNAs, RNAs Xist, RNAs vault e RNAs 7SL. Os miRNAs funcionam principalmente na regulação transcricional e pós-transcricional da expressão gênica e freqüentemente resultam no silenciamento gênico [22]. Recentemente, pesquisadores descreveram a importância dos miRNAs para a predição de AAA e relataram uma redução na expressão de miRNA-335-5p em pacientes com AAA [23]. Foi comprovado que a combinação de fatores clínicos e a expressão de microRNAs melhorou drasticamente a predição de doenças e apresentou maior acurácia [24]. Os pesquisadores se concentraram especificamente no miRNA-335-5p, que exibiu uma faixa significativamente mínima em indivíduos com AAA de crescimento rápido [2, 23]. Além disso, uma diminuição nos níveis de miRNA-335-5p aumentou a confiança na detecção de crescimento de AAA. Em outras palavras, a saída negativa (níveis mais altos) de miR-335-5p indica a gravidade do AAA e minimiza a triagem trabalhosa. Esse achado foi demonstrado por Wanhainen et al. [23] e revelaram que miRNAs são biomarcadores úteis para rastrear AAA e eliminar o risco de AAA de crescimento rápido. O estudo atual demonstra a aplicação da detecção de miRNA-335-5p por um sensor de eletrodo interdigitado (IDE) para determinar a gravidade do AAA em indivíduos afetados.

Materiais e métodos

Reagentes e biomoléculas

Estreptavidina, 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) e solução tampão de fosfato (PBS) foram adquiridos na Sigma-Aldrich, EUA. A etanolamina foi adquirida na Fisher Scientific, UK. Todos os oligos foram sintetizados comercialmente da Apical Scientific Sdn. Bhd., Malásia.

Desenho de padrão em uma máscara do Chrome

Inicialmente, o padrão do sensor dielétrico foi projetado usando o software AutoCAD. As dimensões desejadas eram um comprimento de 7500 μm, uma largura de 4100 μm, 20 pares de gap de dedo, um tamanho de gap de 85 μm, tamanho do eletrodo de 100 μm, espessura do eletrodo de 40 nm e um comprimento de dedo de 4000 μm. O padrão foi impresso em uma fotomáscara em branco e colado na superfície do vidro cromado. Este vidro cromado foi fixado sob um sistema de exposição UV para o procedimento de transferência do padrão. Um substrato de dióxido de silício depositado com filme fino de alumínio foi colocado na direção oposta ao vidro de cromo e exposto à luz ultravioleta por 10 s. O padrão foi transferido seguido pelo processo de revelação usando o revelador de resistência.

Fabricação do eletrodo interdigitado

O eletrodo de superfície foi produzido por meio de um processo de fabricação microeletrônico convencional para fabricar a superfície como segue:(i) Foi preparada uma pastilha de 4 polegadas com óxido nativo existente. (ii) O wafer foi limpo usando solução de ataque de óxido tamponado (BOE) e piranha para remover o óxido nativo e contaminantes inorgânicos. (iii) Uma camada de óxido de 2800 Å de espessura foi cultivada por meio de uma hora de oxidação térmica úmida a uma temperatura de 1000 ° C. (iv) O wafer com a camada de óxido foi dividido em quatro para melhor manuseio. (v) A camada de metal foi depositada com l como uma camada de adesão para a camada condutora. A camada de alumínio (40 nm) foi produzida com 3 cm de comprimento com 0,5 mm de diâmetro por meio de um método de deposição física à base de evaporador térmico, (vi) Uma camada de fotoresiste positivo era um revestimento de rotação sobre o substrato, (vii) O wafer era macio a 90 ° C por 60 s. (viii) O wafer foi alinhado com uma máscara de cromo e exposto à luz ultravioleta por 10 s. (ix) O wafer foi enxaguado em solução reveladora RD6 dentro de 15 s para remover a área não exposta, resultando no padrão de eletrodo interdigitado (IDE) com óxido. (x) A bolacha foi endurecida a 90 ° C durante 120 s. (xi) O wafer foi gravado usando água régia para remover a área exposta de ambas as camadas. (xii) O padrão de superfície foi produzido, e o fotorresiste remanescente foi removido por lavagem com acetona. Em seguida, a análise da nanoprofilometria 3D (Hawk 3D-profilometry, EUA) foi realizada para observar a imagem nítida das lacunas entre os eletrodos. As medições de corrente (A) foram realizadas usando Keithley 6487 com uma varredura linear de 0 a 2 V em uma etapa de 0,1 V (a 20 s).

Funcionalização Química de Superfície:Estratégia Tetravalente de Estreptavidina-Biotina

Para a funcionalização química da superfície, a superfície da sílica foi inicialmente lavada minuciosamente com hidróxido de potássio 1 M (pH 9,0) para ativar a superfície. Esta superfície foi ainda modificada por CDI (0,5 M) com um período de incubação de 1 h para reagir com estreptavidina 100 nM (por 1 h), diluída do estoque original em solução salina tamponada com fosfato 10 mM (PBS; pH 7,4). Após esta etapa, os espaços que não reagiram foram bloqueados usando etanolamina 1 M (por 1 h). Em seguida, a estreptavidina tetravalente foi reagida com 1 μM de sonda miRNA-335-5p biotinilada (por 10 min) em temperatura ambiente. Após a conclusão de cada modificação, a superfície foi completamente lavada com PBS, a menos que indicado de outra forma.

Projetando a sonda e as sequências alvo de miRNA-335-5p

O miRNA-335-5p de comprimento total (5′-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3 ′) com o banco de dados do código de acesso MIMAT765, foi coletado00007. A região desejada para este estudo como alvo é 5′-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3 ′. Para capturar a região miRNA-335-5p alvo, a sonda foi projetada como 5′-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3 ′. Na extremidade 3 ', a biotina foi marcada para interagir com a estreptavidina imobilizada na superfície de detecção. A estrutura secundária do miRNA-335-5p de comprimento total foi prevista pelo software mfold online (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold).

Interações sonda-alvo:sequências de miRNA-335-5p

Após a ligação da sonda biotinilada à superfície de estreptavidina, conforme detalhado acima, a sequência miRNA-335-5p alvo interagiu (por 10 min) à temperatura ambiente desde as concentrações femtomolar baixas até as concentrações nanomolares baixas. Estas concentrações variaram de 1 fM a 1 nM com diluições em série de 10 vezes em PBS. Os anexos foram testados independentemente de concentrações mais baixas para mais altas e, após a formação do duplex, a superfície foi lavada com volumes de 5 vezes de PBS e as medições foram feitas.

Medições I-V

As caracterizações elétricas foram realizadas por medições I-V usando um Picoamperímetro Keithley 6487 com alimentação de tensão / corrente. As medições foram registradas nos volts acima mencionados na superfície nua, seguidos por em cada modificação química da superfície. Da mesma forma, para a análise interativa entre a sonda e o miRNA-335-5p alvo em cada concentração, a medição foi realizada após a etapa de lavagem com 10 volumes de reação. Todas as modificações, interações e medições foram mantidas em condições úmidas, a menos que indicado de outra forma.

Resultados e discussão

Fabricação do sensor IDE e análise de superfície

O estudo atual usou miRNA-335-5p como a ferramenta para elucidar a gravidade do AAA por análise interativa em um sensor de eletrodo interdigitado (IDE) (Fig. 1). Para a análise interativa com a sonda e o alvo projetado a partir do comprimento total do miRNA-335-5p, uma superfície IDE foi projetada e fabricada usando técnicas fotolitográficas convencionais. Modificações de superfície passo a passo foram realizadas e medidas por um amperímetro (Fig. 2b, c). O alinhamento da máscara projetada para a fabricação do IDE e a uniformidade foram confirmados por análise de nanoprofilometria 3D de alta resolução. Essa observação confirmou que a fabricação e a distância entre cada dedo estavam bem alinhadas (Fig. 2d). IDEs têm um tamanho de eletrodo de ~ 100 μm com um espaçamento de ~ 85 μm, e uma grande rede intercalada com milhões de biomarcadores em série / paralelo é formada. Para garantir o sucesso dos IDEs fabricados, usamos diferentes dispositivos simples para determinar a reprodutibilidade sob o sistema dielétrico. Este sistema mede as vibrações moleculares entre os dieletrodos causadas pelo momento de dipolo (Fig. 2c). Este dielétrico IDE é um sistema bem aceito que tem sido amplamente utilizado para diferentes análises biomoleculares e químicas [15, 25,26,27,28]. Neste estudo, todas as modificações químicas de superfície e análises interativas foram medidas pelo modo de corrente I-V.

Representação da detecção de miRNA-335-5p em um IDE. A sonda projetada e o alvo são mostrados junto com a formação duplex na superfície IDE

Medições de superfície em um IDE. a Etapas de medição. b Modo de medição. O padrão IDE e o sistema de conexão são mostrados. Uma medição dielétrica também é exibida. c Mecanismo de superfície durante a medição. Um momento de dipolo é mostrado. d O perfil de profilometria 3D do IDE fabricado

Conjunto molecular de superfície de alta densidade:estratégia de estreptavidina-biotina

Os anexos moleculares de alta densidade na superfície de detecção ou biochips têm se mostrado cruciais e são altamente dependentes da funcionalização da superfície [29, 30]. Este estudo teve como objetivo determinar a superfície apropriada necessária para um grande número de acomodações moleculares, que são obrigatórias para a expressão gênica, descoberta e análise molecular. Para essas aplicações potenciais, a geração de superfícies de sistemas analíticos requer o acoplamento adequado de moléculas para imobilizá-las em formatos apropriados. Essas superfícies de materiais foram estudadas para investigar o mecanismo interativo de superfície, visto que são baratas e fornecem diversos graus de densidades de empacotamento, morfologia e espessura. Este achado irá facilitar a fixação adequada das moléculas e prevenir a perda da atividade biomolecular. Além disso, a orientação correta da imobilização biomolecular é mantida com a confirmação estrutural secundária adequada.

Para obter moléculas de alta densidade na superfície, inicialmente lavamos completamente a superfície de sílica com solução alcalina e a modificamos por CDI. Para capturar altos níveis de sondas de biotinilação na superfície do CDI, imobilizamos a sonda com estreptavidina. A estreptavidina é uma proteína tetravalente com quatro locais para se ligar à biotina e é considerada uma molécula de alta afinidade nas ciências biológicas [31, 32]. A superfície do IDE tinha um nível atual de 2,08E− 10 A e, após o anexo do CDI, foi aumentado para 9,2E-06 A. Esse achado indica claramente que a superfície do IDE modificado pelo CDI é apropriada para nossas análises. Quando a estreptavidina foi adicionada, o nível atual foi aumentado para 2,36E-05 A. Usando essa estratégia, imobilizamos um número maior de sondas biotiniladas projetadas a partir de miRNA-335-5p de comprimento total na superfície IDE (Fig. 3a). As interações da biotina foram realizadas após a etapa de bloqueio na superfície IDE para mascarar as áreas que não reagiram. Com cada modificação de superfície, as mudanças na corrente foram determinadas (Fig. 3b). Conforme mostrado na Fig. 3c, após a adição de etanolamina, as mudanças atuais foram 2.53E− 05 A, e quando 1 nM de sequência de captura biotinilada foi adicionado, o nível da corrente foi diminuído para 1.29E− 08 A. Esta mudança em a corrente confirmou a imobilização da sonda de captura na superfície de detecção IDE. Geralmente, um oligonucleotídeo de fita simples carrega uma carga mais negativa com o esqueleto de fosfato 5 carbonatado exposto (sonda), enquanto a carga líquida de etanolamina é neutra, conforme declarado pelo fornecedor. Essa grande diferença de carga resultou em uma variação aparente na corrente medida, conforme mostrado na Fig. 3c. Além disso, este parâmetro foi revertido novamente após a formação do duplex com a fita alvo. Este achado é devido à redução na exposição da estrutura de fosfato, e as cargas positivas adicionais se originam das nucleobases na fita de miRNA (Fig. 4a).

a Estrutura secundária prevista de miRNA-335-5p. O miRNA-335-5p de comprimento total é exibido com as regiões de haste e loop. A região de destino selecionada para a análise interativa é indicada. b Medições I-V no IDE para as modificações químicas e biológicas de superfície (círculo preto, vazio; círculo vermelho, CDI; círculo azul escuro, estreptavidina; círculo verde, etanolamina). A inserção da figura é mostrada em diagrama. c Medições I-V no IDE para a conexão da sonda. (círculo verde, etanolamina; círculo vermelho escuro, sonda). A imagem da complicação AAA é mostrada como a inserção da figura

Análise interativa da sonda e do alvo. a Interação de dose mais alta da sonda e miRNA-335-5p (alvo). (círculo vermelho escuro, sonda; círculo preto, alvo). b Análise dependente da dose de miRNA-335-5p. Testando do femtomolar inferior ao intervalo nanomolar inferior. (círculo vermelho escuro, sonda; círculo laranja, 1 fM; círculo azul, 10 fM; círculo verde, 100 fM; círculo roxo, 1 pM; círculo rosa, 10 pM; círculo azul claro, 100 pM; círculo preto, 1 nM)

Análise interativa dependente de dose no IDE

Após a fixação da sonda biotinilada na superfície de detecção, a análise interativa do alvo foi realizada com diferentes doses. Esta validação foi realizada a partir do intervalo baixo-femtomolar para baixo-nanomolar. Para garantir esse intervalo, realizamos a análise preliminar com 1 nM de sequências miRNA-335-5p alvo. Após a adição de 1 nM da sequência miRNA-335-5p alvo na superfície modificada pela sonda de captura, o nível de corrente foi alterado de 1,29 E− 08 A para 1,29E− 07 A (Fig. 4a); este resultado indicou que a hibridização ocorreu entre a sonda de captura e a sequência alvo. Após esta confirmação, para determinar o limite de detecção, titulamos a sequência alvo de 1 fM a 1 nM, que caiu independentemente nas superfícies modificadas pela sonda de captura. As alterações atuais foram detectadas antes e depois da imobilização. As diferenças na corrente para as hibridizações de 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM e 1 nM foram 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21 e 11,61E-08 A, respectivamente. Com base nos resultados obtidos, mudanças claras dependentes da dose foram detectadas em todas as concentrações testadas da sequência alvo (Fig. 4b).

Alto desempenho analítico:sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade

Com base nos resultados acima com incrementos dependentes da concentração, a análise de regressão linear foi realizada. A sensibilidade da detecção foi estimada usando o cálculo 3σ e caiu para 1 fM (Fig. 5a, b). A concentração era inferior a 1 fM, mostrando o sinal de fundo e valores mais baixos. Além disso, a análise de especificidade foi realizada para discriminar as sequências alvo das sequências não complementares e não combinadas simples e triplas. Ficou aparente que a sonda projetada mostrou uma reação mais forte com as sequências complementares de miRNA-335-5p perfeitas do que as outras sequências (Fig. 6a). Uma sequência de incompatibilidade única resultou em uma resposta de corrente mais alta do que as sequências não complementares e de incompatibilidade tripla devido à formação de duplex parcial pela sequência de incompatibilidade única na sequência de sonda. As análises de reprodutibilidade foram realizadas com todas as modificações químicas e biológicas na superfície IDE em triplicata, e os dados foram calculados. Os dados médios indicam que não houve mudanças significativas quando os diferentes experimentos foram realizados (Fig. 6b). Além disso, para apoiar o desempenho do IDE, as características dos métodos atualmente disponíveis foram comparadas (Tabela 1).

Dependência da dose. a Interação dependente da dose de miRNA-335-5p com a sonda. b Análise de regressão linear com diferentes concentrações de miRNA-335-5p. O LOD foi considerado a concentração mais baixa de um analito contra o sinal de fundo (S / N =3:1)

Análise de alto desempenho. a Análise de especificidade. As sequências alvo foram discriminadas das sequências não complementares e não emparelhadas simples e triplas. b Teste de reprodutibilidade. Os valores médios são exibidos com experimentos em triplicado

Conclusões

O desenvolvimento de um método analítico utilizando biomarcadores biológicos auxilia no diagnóstico de AAA durante exames físicos. Na pesquisa atual, a detecção mediada por miRNA-335-5p para predizer a gravidade de AAA foi desenvolvida, uma vez que miRNA-335-5p foi encontrado para ser expresso com AAA. A saída da detecção de IDE gerada exibiu níveis de detecção inferiores a superiores para facilitar a previsão da gravidade de AAA. O nível de detecção mais baixo foi 1 fM com alta especificidade e reprodutibilidade para a análise de alto desempenho. O método de estreptavidina-biotina tetravalente usado nesta pesquisa rendeu um bom resultado e pode ser utilizado para outras análises de biomarcadores.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados estão totalmente disponíveis sem restrição.

Abreviações

AAA:: Aneurisma da aorta abdominal
CDI :: 1,1′-Carbonildiimidazol
PBS:: Solução tampão de fosfato
IDE:: Eletrodo interdigitado
UV:: Ultravioleta

Estudo dos efeitos piroelétricos de compósitos modificados por LiNbO3 Uma referência Bandgap auto-polarizada de 180 nm com alto aprimoramento de PSRR

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biológico

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