Montagem de pontos de carbono em estruturas com estabilidade e atividade antibacteriana aprimoradas

Resumo

Os pontos de carbono (CDs) têm sido amplamente utilizados como antimicrobianos devido à sua superfície ativa, mas alguns CDs sofrem instabilidade. Portanto, as aplicações relativas, como a atividade antibacteriana, podem não ser confiáveis para uso a longo prazo. Aqui, sintetizamos CDs com fluorescência azul por um processo hidrotérmico. Posteriormente, a polietilenimina foi aplicada para a montagem de CDs em estruturas baseadas em CDs (CDFs). Os CDFs exibiram fluorescência extinta, mas mostraram propriedades mais estáveis com base no microscópio eletrônico de varredura e investigações de potencial zeta. Ambos os CDs e CDFs mostram atividade antibacteriana contra Escherichia coli Gram-negativa ( E. coli ) e Gram-positivo Staphylococcus aureus ( S. aureus ), mas os CDFs exibiram melhor desempenho antibacteriano e S. aureus poderia ser completamente inibido com a concentração inibitória mínima de 30 μg / mL. Isso revela que os CDFs aumentam tanto a estabilidade quanto a atividade antibacteriana, o que seria mais promissor para aplicações práticas.

Resumo gráfico

Introdução

As infecções bacterianas representam uma séria ameaça à vida humana, e o desenvolvimento de medicamentos eficazes para desinfetar bactérias é muito procurado [1]. Vários antibióticos têm sido usados para tratar infecções bacterianas, mas o uso excessivo de antibióticos causa outros problemas, como efeitos colaterais e problemas de resistência aos medicamentos [2]. Os nanomateriais incluindo polímeros antimicrobianos [3], nanomateriais de metal [4] e nanomateriais de carbono [5, 6] têm sido usados como alternativas aos antibióticos clássicos [7]. Os problemas resistentes aos medicamentos e tóxicos são um alívio [8]. Recentemente, CDs [9, 10] e nanoclusters (NCs) [11] são bem aplicados no combate a infecções bacterianas porque são biocompatíveis [12], ativos [13] e podem ser facilmente limpos por circulações devido aos tamanhos ultrapequenos [14, 15]. Especialmente, os pesquisadores descobriram que os CDs mostram uma excelente capacidade de eliminação de radicais livres, que pode ser mais forte do que muitos medicamentos anti-infecciosos tradicionais [16,17,18]. No entanto, alguns antimicrobianos ultrapequenos sofrem baixa estabilidade devido à maior área de superfície oxidativa [19]. É altamente desejado desenvolver agentes antibacterianos mais eficazes para combater infecções bacterianas para uso de longo prazo.

Para atender à demanda por aplicações práticas, os antimicrobianos devem ter as seguintes características:(a) Excelente estabilidade permanece inalterada por certo tempo em um ambiente ambiente; (b) Excelente biocompatibilidade e baixa toxicidade:(c) alta atividade antibacteriana. Os nanomateriais maiores tendem a ser mais estáveis, mas podem ter atividade antibacteriana relativamente mais fraca devido à menor área de superfície ativa. Considerando a fraqueza de nanomateriais pequenos e grandes, relatamos a montagem dos pequenos CDs em grandes CDFs simplesmente adicionando polietilenoimina (PEI) (Fig. 1). Os CDs não foram fundidos, mas mantiveram sua morfologia como blocos de construção. Portanto, os CDFs inteiros mostraram tamanhos maiores, mas demonstraram mais estabilidade excelente sem perder as propriedades ativas dos CDs. Além disso, descobrimos que os CDFs exibiam atividades antibacterianas aumentadas contra Escherichia coli Gram-negativa ( E. coli ) e Gram-positivo Staphylococcus aureus ( S. aureus ) em comparação com CDs, indicando seu desempenho antibacteriano de amplo espectro, embora muitos CDs tenham erradicado apenas bactérias Gram-positivas [20]. Além disso, os CDFs promoveram a proliferação das células PC12 (uma linhagem celular obtida de um feocromocitoma da medula adrenal de rato), apresentando grande potencial para aplicações de recuperação nervosa [21]. Este trabalho sugere que a montagem de pequenos CDs em grandes CDFs não apenas aumenta a estabilidade, mas também aumenta a atividade antibacteriana.

Esquema para a síntese de CDs e a montagem em CDFs adicionando PEI com atividade antibacteriana aprimorada

Materiais e métodos

Materiais e instrumentos

Os espectros de fotoelétrons de superfície de raios-X (XPS) foram registrados em um instrumento ESCALAB250Xi de espectroscopia de fotoelétrons de superfície de raios-X (XPS). O microscópio eletrônico de transmissão (TEM) foi realizado por um microscópio JEM-2100 operando a 200 kV. A fluorescência dos materiais foi obtida por meio do espectrômetro de fluorescência F97. A coloração FDA / PI das células bacterianas foi registrada no modo tapping com um microscópio Leica DFC450C. O tempo de vida da fluorescência foi medido em um sistema de contagem de fóton único correlacionado com o tempo (TCSPC) usando um espectrofluorômetro Nanolog (Horbia JY, Japão). Os espectros de espectroscopia ultravioleta-visível (UV-vis) são obtidos do instrumento UV-1600. A imagem bacteriana foi observada por um microscópio confocal (Olympus FLUOVIEW FV1000 c). Todos os reagentes eram de qualidade analítica. A água deionizada foi utilizada nos experimentos. O kit-8 de contagem de células foi obtido na Beyotime Biotechnology.

Preparação de CDs e CDFs

A L-cisteína (1,0 g) foi dissolvida em 10,0 mL de água desionizada e bem misturada. Em seguida, o pH da solução foi ajustado para 9,0 com NaOH 1,0 M. A solução foi transferida para um reator hidrotérmico e aquecida a 160 ° C durante 24 h. Depois que a solução foi resfriada à temperatura ambiente, a solução resultante foi submetida a diálise usando um saco de diálise (MW 7000 cut off) por um dia. Os CDs obtidos foram usados para as seguintes caracterizações e experimentos. Para a preparação dos CDFs, 40 µL de PEI a 1% foram adicionados a 1 mL dos CDs. A mistura foi deixada permanecer durante 1 h. O produto foi purificado por diálise usando o mesmo método que a purificação de CDs. Para a caracterização de HR-TEM, as amostras foram concentradas em um pequeno volume, transferidas para uma coluna de gel de sílica e eluídas com metanol e diclorometano para obter os produtos purificados posteriormente.

Avaliação de toxicidade

As células PC12 foram semeadas em placas de 96 poços por 12 horas e, em seguida, foram incubadas com CDs e CDFs com diferentes concentrações. O número de células viáveis foi investigado usando um ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazólio (MTT) (5 mg / mL em PBS) foi adicionado em 1/10 do volume de cultura e as células foram devolvidas à incubadora. Em seguida, os sobrenadantes foram descartados e 200 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados a cada poço. Os cristais foram dissolvidos agitando as placas durante 10 min. A absorvância a 490 nm foi medida usando o Microreader (Varioskan LUX Multimode Reader). Poços de controle em branco foram incluídos para todas as medições de absorbância.

Experimento antibacteriano

E. coli e S. aureus foram incubados na ausência e presença de CDs e CDFs a 37 ° C com agitação de 250 rpm. O crescimento das células bacterianas em cultura de caldo Lysogeny (LB) foi medido pelo microrreader a 600 nm de comprimento de onda (OD600). O meio LB foi usado como o controle em branco. O OD600 representa a densidade celular, e a viabilidade celular relativa foi calculada com base na comparação entre as células bacterianas cultivadas na presença dos materiais com o grupo de controle (OD600 das células bacterianas na ausência dos CDs ou CDFs). As bactérias vivas / mortas são avaliadas pelo protocolo de coloração FDA / PI [22].

Detecção de espécies de oxigênio reativas Ros (ROS)

A produção de ROS intracelular foi medida em células bacterianas antes e após o tratamento por CDs e CDFs por 12 h, com uma sonda de diacetato de 2 ′, 7′-diclorofluorescina (DCFH-DA) seguindo as instruções. A fluorescência foi detectada em um comprimento de onda de emissão de 525 nm com excitação em 488 nm.

Resultados e discussões

Caracterização dos materiais

Investigações de tamanho

A Figura 2 mostra o SEM do pó para CDFs com ampliação relativamente menor (Fig. 2a0) e maior (Fig. 2b0) após exposição ao ar por várias horas. Pode-se observar que os CDFs estavam bem distribuídos e apresentavam um tamanho médio de ca. 25 nm. Os CDs deveriam mostrar tamanhos pequenos monodispersos com base no estudo TEM e AFM (Arquivo adicional 1:Figura S1), mas essas pequenas partículas exibiram agregação observada por SEM após exposição ao ar por um certo tempo (Arquivo adicional 1:Figura S2 ) Por outro lado, os CDFs mantiveram sua morfologia embora estivessem expostos ao ambiente ambiente. Isso indicou que os CDFs obtidos são mais promissores para aplicações práticas. Os CDFs foram ainda caracterizados por TEM (Fig. 2b1). Pode-se ver que os CDFs exibiram estruturas de montagem com pequenos CDs como os blocos de construção. A análise de microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HR-TEM) (Fig. 2b2) revelou que o bloco de construção de CDFs exibia franjas de rede com espaçamento d de 0,21 nm, correspondendo à (100) rede plana de grafite, que era semelhante aos CDs clássicos [23,24,25]. Portanto, os CDFs de montagem não perdem a característica de CDs, que podem combinar as vantagens tanto das grandes estruturas inteiras quanto dos pequenos blocos de construção internos.

SEM para CDFs com relativamente menor ( a0 ) e ampliação superior ( b0 ); TEM ( b1 ) HR-TEM ( b2 ) de CDFs

Potencial Zeta

Investigações de potencial zeta foram usadas para medir o grau de repulsão eletrostática de CDs e CDFs entre partículas carregadas adjacentes no sistema disperso (Fig. 3). Percebe-se que o pico de potencial zeta dos CDs não foi bem caracterizado, os quais foram expostos ao ambiente ambiente. Além disso, múltiplos picos de potencial zeta foram obtidos com grandes desvios zeta (Tabela 1), indicando que os CDs eram bastante instáveis e irrepetíveis. Por outro lado, o pico do potencial zeta para CDFs focou em uma faixa relativamente estável. Também tivemos desvios zeta muito menores com base em medições de três vezes, revelando que os CDFs eram mais estáveis e os sistemas dispersos tinham amostras com maior pureza.

Potencial zeta dos CDs ( a ) e CDFs ( b )

Propriedades de fluorescência

Os espectros de emissão de fluorescência foram usados para monitorar o processo de montagem de CDs em CDFs (Fig. 4). Conforme a titulação de PEI, a emissão de fluorescência em 350 nm extinguiu-se gradualmente (Fig. 4a). Mas nenhuma mudança significativa de espectro de fluorescência foi observada, revelando que não ocorreu agregação. A estrutura de montagem dos CDFs altera todo o tamanho dos CDs, o que influencia a fluorescência. Enquanto isso, os CDs próximos marcavam a fluorescência um do outro. Além disso, a química da superfície desempenha um papel importante nas propriedades de fluorescência. Os átomos de nitrogênio e de enxofre na superfície dos CDs podem gerar armadilhas de energia. A fluorescência brilhante dos CDs atribui à superfície do defeito muitos grupos carbonila e amino. Após a funcionalização do PEI, a superfície dos CDFs foi dominada pelos grupos amino, que extinguiram a fluorescência juntamente com os tamanhos crescentes. A comparação do comportamento de fluorescência de CDs e CDFs foi ainda examinada por TCSPC para compreender as vias de recombinação de carga gerada por foto dos materiais (Fig. 4b). A emissão foi monitorada a 430 nm. Os decaimentos de fluorescência exigiram um ajuste exponencial de dois componentes. As constantes de tempo e amplitudes relativas são ajustadas e resumidas na Tabela S1. Pode-se ver que o tempo de vida do componente dominante para CDs foi de 2,45 ns, enquanto o do outro componente foi de 7,47 ns. Por outro lado, o tempo de vida do componente dominante para CDs foi de 1,98 ns, enquanto o outro componente mostrou um tempo de vida de 7,30 ns. Nenhuma mudança significativa no tempo de vida foi observada entre CDs e CDFs, o que também indicou que as propriedades dos CDs não foram alteradas substancialmente durante a montagem em CDFs [26].

Espectro de emissão de fluorescência a de CDs como a titulação de PEI e vida útil b para CDs e CDFs

Toxicidade

Para avaliação da segurança dos materiais, a toxicidade dos CDs e CDFs para as células PC12 é investigada. Ensaios de MTT foram conduzidos para investigar a influência dos materiais nas viabilidades celulares (Fig. 5). Após a incubação de PC12 com CDs e CDFs, as viabilidades celulares não foram muito afetadas em 24 h. Curiosamente, ambos os materiais de carbono promovem a proliferação de PC12, que desempenha um papel importante na terapia de danos nos nervos. Esses resultados indicam a baixa toxicidade dos materiais, e os materiais são promissores para proteção nervosa com células PC12 envolvidas [27].

Viabilidade celular de PC12 na presença de CDs ( a ) e CDFs ( b ) Viabilidade celular (%) =(absorbância do grupo experimental - absorbância do grupo em branco) / (absorbância do grupo de controle - absorbância do grupo em branco) × 100%

Investigações antibacterianas

As atividades antibacterianas dos CDs e CDFs foram avaliadas inicialmente pela medição da densidade bacteriana na presença desses agentes em 600 nm [28]. A Fig. 6 mostra um efeito antibacteriano substancial de ambos os CDs e CDFs contra ambos os S. aureus e E. coli células. Especialmente, a viabilidade do S. aureus células era quase 0 quando maiores que 30 µg / mL de CDFs foram usados. Da mesma forma, o E. coli as células foram desinfetadas por CDs e CDFs. Os CDs mostraram várias cargas (Fig. 3a). Por outro lado, os CDFs apresentavam cargas insignificantes (Fig. 3b), o que poderia suprimir a adesão bacteriana sob repulsão fraca, interagindo mais facilmente com a superfície bacteriana. Em comparação, os CDFs mostram atividade antibacteriana mais alta com base no fenômeno de que uma proporção relativamente maior das células é morta quando mais de 6 µg / mL dos materiais são usados. A atividade antibacteriana aumentada dos CDFs é possivelmente atribuída ao efeito de sinergia dos CDs como blocos de construção, bem como às cargas de superfície mais estáveis. Para compreender profundamente o mecanismo antibacteriano, o ROS que poderia oxidar DCFH não fluorescente em DFC fluorescente foi medido (Fig. 6C). Ambos os materiais de carbono não induziram significativamente a produção de ROS após o tratamento de E. coli . No entanto, os CDFs aumentaram notavelmente os ROS intracelulares enquanto interagiam com S. aureus . Como as ROS podem danificar o DNA, o RNA e as proteínas bacterianas, o valor aprimorado facilitou a desinfecção das bactérias. Além disso, o ROS foi estimulado com H ₂ O _2. É importante notar que as produções ROS foram todas dramaticamente promovidas em comparação com o H ₂ O ₂ tratamento sozinho, enquanto os CDFs mostraram o maior realce. Isso indicou a combinação de H ₂ O ₂ com esses dois materiais de carbono pode aumentar ainda mais a atividade antibacteriana, especialmente para os CDFs.

Atividade antibacteriana de CDs e CDFs contra S. aureus ( a ) e E.coli ( b ), c intensidade de fluorescência de DCF em 525 nm, que mostra uma relação linear com o nível de ROS, com o tratamento de CDs e CDFs na ausência e presença de H ₂ O ₂ (100 μM)

Alguns CDs foram relatados anteriormente para desinfetar S. aureus , que está listado na Tabela 2 para comparação. Os CDFs atuais mostraram um MIC competitivo. Além disso, ao invés de apenas diminuir a viabilidade celular investigada, os CDFs promoveram a proliferação celular de PC12, indicando sua versatilidade no tratamento de infecções bacterianas.

A integridade da membrana bacteriana após o tratamento com CDs e CDFs foi investigada pelo experimento de coloração vivo / morto (Fig. 7). A coloração verde fluorescente do FDA pode mostrar apenas as células vivas, enquanto o vermelho fluorescente PI cora especificamente as bactérias mortas com membranas quebradas, mas as vivas com membranas bacterianas intactas não são coradas [30, 31]. Conforme mostrado nas imagens de fluorescência, fluorescência vermelha óbvia foi observada nas amostras tratadas com CDs e uma densidade muito maior de células mortas foi observada nas amostras tratadas com CDFs.

Coloração FDA / PI S. aureus e E. coli na ausência e presença de CDs e CDFs a 30 µg / mL. Barra de escala, 200 µm

Com base nas comparações acima, concluímos que os CDFs são promissores para matar células bacterianas Gram-positivas e Gram-negativas. Portanto, E. coli e S. aureus antes e depois do tratamento com 30 µg / mL de CDFs foram caracterizados por SEM (Fig. 8). Como mostrado na Fig. 8a, c, as bactérias antes do tratamento com CDFs exibem superfície regular. No entanto, após incubação com CDFs, a morfologia das células bacterianas incluindo S. aureus (Fig. 8b) e d E. coli (Fig. 8d) mudou drasticamente. Além disso, as membranas de muitas células bacterianas se separaram. Alguns pequenos materiais foram observados na superfície da bactéria, originados dos CDFs anexados. Isso indica que os CDFs podem desinfetar as células bacterianas, danificando as membranas [32].

SEM para S. aureus ( a , b ) e E.coli antes ( a , c ) e depois ( b , d ) o tratamento com 30 µg / mL de CDFs. Barra de escala:2 µm

Uma vez que ambos os CDs e CDFs são fluorescentes, 6 µg / mL dos agentes foram investigados para imagens bacterianas durante o progresso da desinfecção. A imagem de S. aureus foi investigado e mostrado na Fig. 9. Curiosamente, foi descoberto que ambos os CDs e CDFs podem ser usados para a imagem de S. aureus . No entanto, os CDFs mostram maior eficiência de captação, uma vez que as células bacterianas observadas nos campos claro e escuro quase se sobrepõem. Por outro lado, apenas parte de S. aureus as células foram manchadas pelos CDs. Além disso, as densidades de células bacterianas foram menores com o tratamento de CDFs, representando CDFs desinfetados S. aureus de forma mais eficiente em comparação com CDs nas mesmas dosagens. Esses resultados também revelam que os CDFs podem ser usados como corantes alternativos para a geração de imagens de várias células bacterianas.

Imagem de S. aureus pela captação de CDs e CDFs após 12 h

Conclusões

A montagem de CDs em CDFs resulta em atividade antibacteriana mais robusta. Conclui-se que a estrutura de montagem permite propriedades mais estáveis, mas aumenta a atividade antibacteriana dos CDs. Este trabalho também fornece uma nova via de montagem de pequenos nanomateriais em estruturas para aplicações mais práticas.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados que sustentam as conclusões deste artigo estão incluídos no artigo.

Abreviações

CDs:: Pontos de carbono
CDFs:: Estruturas baseadas em pontos de carbono
PEI:: Polietilenimina
E. coli :: Escherichia coli
S. aureus :: Staphylococcus aureus
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
HR-TEM:: TEM de alta resolução
XPS:: Espectros de fotoelétrons de superfície de raios-X
MIC:: Concentração inibitória mínima
NCs:: Nanoclusters
TCSPC:: Contagem de fóton único correlacionada com o tempo
CCK-8:: Ensaio do kit-8 de contagem de células
ROS:: Espécies reativas de oxigênio Ros
SEM:: Microscópio eletrônico de varredura
ZP:: Potencial zeta

Os fotodetectores baseados em heterojunções de monocamada lateral MoS2 / WS2 CoFe2O4-pontos quânticos para terapia fototérmica / fotodinâmica sinérgica de câncer de pulmão de células não pequenas por meio do desencadeamento de apoptose por meio da regulação da via PI…

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