Melhoria da Biocompatibilidade de Andamios de Nanofibras de Polianilina/Ácido Polilático via Morfologia de Superfície Controlada por Dopagem com Ácidos Inorgânicos

Resumo

Andamios nanofibrosos condutivos e degradáveis têm grande potencial na promoção do crescimento, proliferação e diferenciação celular sob campo elétrico externo. Embora a questão da condutividade elétrica inferior em fluidos corporais ainda exista, nanofibras degradáveis baseadas em polianilina (PANI) podem promover adesão, crescimento e proliferação celular. Para investigar se o efeito é causado pela morfologia do PANI, selecionamos três ácidos inorgânicos como dopantes no processo de polimerização oxidativa in situ do PANI: ácido clorídrico, ácido sulfúrico e ácido perclórico. As nanofibras compostas de polianilina/ácido polilático (PANI/PLA) obtidas foram caracterizadas via MEV, FTIR e XPS, e confirmamos que as nanofibras de PLA foram revestidas com sucesso pelo PANI sem qualquer alteração na estrutura porosa das nanofibras de PLA. As propriedades mecânicas in vitro e a degradabilidade indicaram que a oxidação dos dopantes ácidos deve ser considerada e que provavelmente tem um efeito de degradação oxidativa maior nas nanofibras de PLA. O teste de ângulo de contato demonstrou que nanofibras compostas PANI/PLA com diferentes morfologias de superfície têm boa molhabilidade, implicando que atendem aos requisitos de andamios para engenharia de tecido ósseo. A rugosidade de superfície e a viabilidade celular demonstraram que diferentes morfologias de PANI na superfície podem promover a proliferação celular. Quanto maior a rugosidade de superfície do PANI, melhor a biocompatibilidade. Consequentemente, a morfologia de superfície regulada de nanofibras compostas PANI/PLA via dopagem com diferentes ácidos tem efeito positivo na biocompatibilidade em engenharia de tecidos.

Introdução

A matriz extracelular (MEC) é um tipo de rede macromolecular secretada pelas células no estroma extracelular. Ela apresenta a base de células, tecidos e órgãos, acompanhada por órgãos, e é caracterizada por uma estrutura de grade complexa [1, 2]. Além disso, fornece um local adequado para a sobrevivência e atividade das células, determinando sua forma, controlando sua diferenciação, participando de sua migração e metabolismo, e afetando, em última instância, sua sobrevivência, crescimento e morte [3, 4]. Nanofibras por eletrofiação podem simular a ação da matriz extracelular para regular o comportamento celular devido à sua alta área superficial específica, propriedades mecânicas apropriadas e biodegradabilidade. Além disso, nanofibras por eletrofiação podem ser multifuncionais por modificação de superfície na base de manter sua estrutura porosa. Portanto, nanofibras por eletrofiação tornaram-se um material candidato promissor em engenharia de tecidos, amplamente aplicadas em liberação de fármacos, regeneração ortopédica, regeneração nervosa e reparo [5-10].

Polímeros condutivos (ex: polipirrol [PPy], politiofeno [PTH] e polianilina [PANI]) têm boa biocompatibilidade in vitro e in vivo, que podem afetar significativamente adesão, proliferação e diferenciação celular, bem como regeneração tecidual [11-13]. Entre esses polímeros condutivos, o PANI é considerado um material potencial para engenharia de tecidos e medicina regenerativa devido à sua boa processabilidade, excelente condutividade, boa estabilidade redox e biocompatibilidade [14, 15]. Sob estimulação elétrica, o PANI pode regular adesão, proliferação, migração e diferenciação celular [16, 17]. De fato, numerosos relatórios concluíram que nanofibras compostas degradáveis condutivas baseadas em PANI promovem comportamento celular sob campo elétrico [18-21]. No entanto, isso acarreta uma questão crucial: a condutividade do PANI em ambiente fisiológico (pH = 7,4) será enfraquecida devido à desdopagem do PANI, o que, como estudos anteriores demonstraram, diminui suas vantagens de atividade elétrica na promoção da proliferação e diferenciação celular [22]. Embora isso apresente claramente uma limitação de nanofibras degradáveis condutivas baseadas em PANI em engenharia de tecido ósseo sob estimulação elétrica externa, elas ainda podem promover proliferação e crescimento celular em grande medida [23, 24]. Aqui, especulamos que a morfologia de superfície do PANI aumenta a rugosidade das nanofibras compostas, o que é favorável à adesão, crescimento e proliferação celular.

Poli anilina dopada com ácidos inorgânicos geralmente tem boa condutividade elétrica. No entanto, os ânions introduzidos por vários dopantes de ácidos inorgânicos afetarão a condutividade e a estrutura da polianilina [25-27]. Neste artigo, três ácidos inorgânicos comuns, a saber, ácido clorídrico (HCl, HA), ácido sulfúrico (H₂SO₄, SA) e ácido perclórico (HClO₄, PA), foram selecionados como dopantes em uma polimerização oxidativa in situ de PANI. Então, as propriedades mecânicas, molhabilidade, morfologia de superfície, biocompatibilidade e adesão celular de nanofibras PANI/ácido polilático (PLA) foram investigadas sob diferentes dopantes ácidos. Os resultados indicaram que quanto maior a rugosidade de superfície do PANI, melhor a proliferação celular, mostrando assim melhor biocompatibilidade.

Métodos/Experimental

Químicos

Anilina (AN) foi adquirida da Sigma, PLA (Mw = 60.000) da Solarbio, diclorometano (DCM) da Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., e N,N-dimetilformamida (DMF) da Macklin. Enquanto isso, persulfato de amônio (APS) foi adquirido da Aladdin, HCl e H₂SO₄ da Guangzhou Chemical Co., Ltd., e HClO₄ da Macklin.

Preparação de Nanofibras de Polianilina/Ácido Polilático

Fabricação de Nanofibras de Ácido Polilático por Eletrofiação

Partículas de PLA com massa específica foram adicionadas em uma solução mista de DCM e DMF (razão de volume 7:3) antes de serem agitadas até dissolverem, obtendo-se uma solução mista de 10% PLA. A solução de PLA foi então dispensada em uma seringa e conectada a uma fonte de alta tensão. A máquina de eletrofiação (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) foi ajustada com tensão de 15 kV e distância de 15 cm. As nanofibras de PLA obtidas foram secas a vácuo durante a noite a 40 °C.

Preparação de Nanofibras de Polianilina/Ácido Polilático Dopadas com Diferentes Ácidos Inorgânicos

As nanofibras de PLA foram colocadas na câmara da máquina de limpeza a plasma (PCE-6, MTI Corporation, EUA) e descarregadas por 2 min a 30 W de potência RF. Neste artigo, três ácidos inorgânicos comuns, HCl, H₂SO₄ e HClO₄, foram usados como dopantes para polimerização oxidativa in situ na preparação de nanofibras PANI/PLA [24], e as nanofibras PANI correspondentes foram marcadas como PANI-HA, PANI-SA e PANI-PA, respectivamente, enquanto as nanofibras nanocompostas PANI/PLA foram rotuladas como PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA e PANI/PLA-PA, respectivamente. O processo de preparação de nanofibras de PLA e PANI/PLA compostas é mostrado na Fig. 1.

Figura 1. Esquema representando o processo de preparação de nanofibras de PLA e nanofibras compostas PANI/PLA

As nanofibras nanocompostas PANI/PLA foram preparadas sob condições de banho de gelo [16, 28]. O APS e AN foram adicionados a uma solução ácida 1 M de acordo com uma razão molar de 1:1. Aqui, tomamos o HCl como exemplo para ilustrar o processo de preparação de nanofibras PANI/PLA. Sob condições de banho de gelo, a AN (930 mg, 0,01 mol) foi adicionada gota a gota no APS (2.280 mg, 0,01 mol) dissolvido em 50 mL de HCl 1 M. Imediatamente, a membrana de nanofibras de PLA tratada por plasma foi imersa na solução e agitada por 2 h a 0 °C. Após a reação, a membrana de nanofibras de PLA foi limpa várias vezes com HCl e etanol para remover o PANI não aderido antes de ser seca durante a noite a 40 °C para obter nanofibras PANI/PLA-HA, que foram guardadas para uso posterior. As nanofibras compostas PANI/PLA-SA e PANI/PLA-PA foram obtidas seguindo abordagem similar.

Caracterização

Os testes de tração uniaxial para nanofibras de PLA e nanofibras compostas PANI/PLA foram conduzidos via teste tensão-deformação (Shimadzu AGX-PLUS, Japão). Aqui, a amostra foi cortada em formato de haltere, com velocidade de tração mantida constante a 3 mm/min. O módulo de Young foi calculado da região linear 0-15% de deformação na curva tensão-deformação, e a resistência à tração e taxa de fratura da curva foram determinadas a partir da fratura da membrana de nanofibras.

A morfologia dos andamios de nanofibras foi caracterizada via microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Japão) para observar as diferentes morfologias do PANI dopado com diferentes ácidos inorgânicos. Antes da observação por MEV, as amostras de nanofibras foram pulverizadas com ouro por 60 s para permitir observação mais clara da morfologia. Enquanto isso, a rugosidade de superfície das nanofibras compostas PANI/PLA foi medida usando microscopia de força atômica (AFM, Bruker Dimension Edge). Para confirmar que o PANI foi completamente carregado nas nanofibras de PLA, espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) foi usada para medir a mudança de comprimento de onda de 2000 ~ 500 cm⁻¹. Espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS; Thermo ESCALAB 250) e Al-Kα foram usados como fontes de emissão de raios X para determinar ainda mais a composição de superfície das nanofibras PANI/PLA, enquanto sua molhabilidade foi medida em termos do ângulo de contato de gotas de água à temperatura ambiente via análise de ângulo de contato (OCA 15 plus, Alemanha). A degradação das nanofibras foi avaliada usando método de perda de massa [29, 30]. As membranas de nanofibras foram cortadas em discos de 16 mm e colocadas em 20 mL de tampão fosfato salino (PBS) com pH 7,4 antes de os andamios serem incubados a 37 °C por 7, 14 e 21 dias e secos até peso constante.

Biocompatibilidade de Andamios Nanofibrosos Compostos PANI/PLA

Biocompatibilidade

Neste artigo, a biocompatibilidade de andamios nanofibrosos compostos PANI/PLA foi caracterizada por experimento de atividade de células de osteosarcoma humano (HOS). Células HOS foram adquiridas do banco de células da Academia Chinesa de Ciências, Xangai. As células HOS foram cultivadas em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) de baixa glicose contendo 10% soro fetal bovino, 100 U/mL penicilina e 100 U/mL estreptomicina antes de serem incubadas a 37 °C e 5% CO₂. Quando o crescimento celular atingiu grau de fusão de 90%, as células foram passadas na razão 1:3.

As células HOS tiveram que ser semeadas nas nanofibras PANI/PLA antes do teste de proliferação celular. Aqui, as nanofibras foram colocadas em uma placa de 96 poços de forma que cobrissem completamente o fundo do poço antes de serem esterilizadas via UV por 30 min e via solução de etanol 75% por 30 min. Elas foram então lavadas com PBS. As nanofibras foram então inoculadas com densidade de 1 × 10⁴ por poço, enquanto um grupo branco e um grupo controle foram configurados simultaneamente. As células foram então incubadas em incubadora celular a 37 °C por um, três e cinco dias, com o meio renovado a cada dois dias.

A viabilidade celular das nanofibras PANI/PLA foi avaliada usando ensaio de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazólio brometo (MTT). Após incubação de um, três e cinco dias, o meio foi removido da placa de 96 poços e lavado com PBS três vezes antes de adicionar 1 mL de DMEM contendo 10% de 5 mg/mL MTT. O meio foi então incubado a 37 °C por 4 h e então removido antes de adicionar DMSO para dissolver a metilprednisolona. O meio foi vibrado por 10 min, e então a absorbância foi determinada (BioTek Synergy HTX, EUA).

Imunofluorescência

As células HOS foram incubadas no incubador de nanofibras PANI/PLA por 24 h e lavadas com PBS três vezes. Então, as células foram fixadas com 4% paraformaldeído por 10 min à temperatura ambiente. As células fixas foram lavadas com PBS três vezes (10 min cada) e 10 μL de peptídeo marcado com FITC 100 nM foi adicionado antes de as células serem incubadas por 30 min à temperatura ambiente e então lavadas com PBS três vezes (5 min cada). A actina extracelular das células HOS foi corada, com microscopia confocal (Tipo A1, Nikon, Japão) usada para observar a coloração celular a uma ampliação de 20×.

Adesão Celular

A adesão das células HOS nos andamios nanofibrosos compostos PANI/PLA foi observada via MEV. Aqui, o meio de cultura foi removido após a cultura de 24 h de células HOS em nanofibras PANI/PLA e foi então lavado com PBS três vezes antes da adição de 4% PFA. O meio foi fixado durante a noite a 4 °C, lavado com PBS três vezes, desidratado com solução de etanol em gradiente (30%, 50%, 70%, 85%, 90% e 100%, respectivamente; 20 min cada), e depois liofilizado por 24 h. Antes da observação por MEV, as nanofibras foram pulverizadas com platina por 120 s para permitir melhor observação.

Atividade de Fosfatase Alcalina (ALP)

ALP é um dos marcadores precoces de diferenciação de osteoblastos comumente usados que dependem da expressão da enzima fosfatase alcalina. Aqui, a atividade ALP foi realizada usando o Kit de Ensaio ALP (Beyotime Biotechnology, P0321S). As células HOS foram cultivadas em diferentes andamios compostos PANI/PLA por 7 dias designados. As células foram lisadas usando 50 μL de Tris-HCl (0,1 M, pH 8) com 0,1% (v/v) triton X-100. A atividade ALP é analisada quantificando a concentração de p-nitrofenol de p-nitrofenil fosfato (PNPP), que é estimada registrando a absorbância a 405 nm. A porcentagem de atividade ALP das células cultivadas ao longo das nanofibras PANI/PLA é calculada comparando a atividade ALP das células cultivadas em nanofibras de PLA puras.

Análise Estatística

A significância estatística dos resultados foi avaliada via análise de variância unidirecional (ANOVA) usando GraphPad Prism (versão 8.02). Aqui, as diferenças em propriedades mecânicas, biodegradabilidade in vitro e viabilidade celular entre os diferentes andamios nanofibrosos compostos PANI/PLA foram analisadas. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05 (∗) e muito significativos quando p < 0,005 (∗∗).

Resultados e Discussão

As propriedades mecânicas de andamios de engenharia de tecidos são indicadores importantes na avaliação de se os andamios podem suportar dinâmica de fluidos. A presença de ácidos inorgânicos pode afetar as propriedades físico-químicas da matriz de PLA de nanofibras compostas PANI/PLA no processo de polimerização oxidativa química in situ do PANI. Portanto, explorar as propriedades mecânicas de nanofibras compostas PANI/PLA dopadas com ácidos inorgânicos é necessário. Aqui, as propriedades mecânicas de nanofibras compostas PANI/PLA foram avaliadas via teste de tração, mostrado na Fig. 2, incluindo tensão-deformação, módulo de Young, resistência à tração e alongamento na ruptura. Como mostrado na Fig. 2a, as nanofibras de PLA exibiram comportamento elástico linear, e as nanofibras compostas PANI/PLA-HA e PANI/PLA-SA exibiram claro comportamento de escoamento, enquanto as nanofibras compostas PANI/PLA-PA romperam imediatamente após deformação elástica. O módulo de Young (Fig. 2b) das nanofibras compostas PANI/PLA foi maior que o das nanofibras de PLA. Comparado ao PLA, o aumento no módulo elástico de PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA e PANI/PLA-PA foi 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47 e 28,43 ± 8,34 MPa, respectivamente. Em termos de resistência à tração (Fig. 2c) e razão de fratura (Fig. 2d), as de PANI/PLA-HA e PANI/PLA-PA diminuíram, enquanto as de PANI/PLA-SA aumentaram ligeiramente; a resistência à tração e alongamento na ruptura de PANI/PLA-PA foram as mais baixas. Comparado às nanofibras de PLA, a resistência à tração de PANI/PLA-HA e PANI/PLA-PA diminuiu em 0,15 ± 0,01 e 0,64 ± 0,03 MPa, respectivamente, enquanto a de PANI/PLA-SA aumentou ligeiramente em 0,13 ± 0,05 MPa. O alongamento na ruptura de PANI/PLA-HA e PANI/PLA-PA diminuiu em 16,93 ± 1,38% e 35,42 ± 3,94%, respectivamente, enquanto o de PANI/PLA-SA aumentou em 3,32 ± 0,13%.

Figura 2. Propriedades mecânicas de nanofibras de PLA e nanofibras compostas PANI/PLA. a Curvas representativas de tensão-deformação, b Módulo de Young, c resistência à tração na ruptura, d alongamento na ruptura

Como mostrado na Fig. 2, os ácidos inorgânicos selecionados podem aumentar o módulo elástico das nanofibras de PLA através da conexão do revestimento de PANI. Em termos de resistência à tração e alongamento na ruptura, comparado às nanofibras de PLA, as propriedades mecânicas de PANI/PLA-HA e PANI/PLA-SA variaram em graus diferentes, enquanto as de PANI/PLA-PA diminuíram mais claramente, e assim que a tensão foi aplicada durante o teste, uma fratura ocorreu em menos de 5 s. Esses resultados podem ser devidos à oxidação do HClO₄, que resultou na clivagem da ligação éster na cadeia molecular de PLA e na decomposição oxidativa do grupo carboxila, levando subsequentemente a propriedades mecânicas inferiores [31]. Enquanto isso, as diferentes propriedades mecânicas de PANI/PLA-HA e PANI/PLA-SA podem estar relacionadas à diferente densidade do PANI dopado por HCl e H₂SO₄, enquanto a introdução do APS no processo de reação também pode ter tido leve impacto nas nanofibras de PLA, com o efeito abrangente desses fatores exibindo diferentes propriedades mecânicas [32].

A adesão, proliferação e diferenciação celular são afetadas pela morfologia, com superfície rugosa geralmente acreditada como favorável à adesão celular [33]. A hidrofobicidade das nanofibras de PLA implica que a polimerização uniforme do PANI apresenta uma barreira, enquanto o tratamento de superfície das nanofibras de PLA com plasma pode melhorar significativamente a molhabilidade [34]. Após a polimerização in situ baseada em PANI com diferentes dopantes de ácidos inorgânicos, nanofibras compostas PANI/PLA com deposição de superfície uniforme foram obtidas.

A morfologia do PANI na superfície das diferentes fibras PANI/PLA foi observada via FE-SEM (Fig. 3). A figura mostra claramente que a superfície das nanofibras de PLA foi coberta por muitas nanopartículas irregulares e que as nanofibras compostas PANI/PLA dopadas com ácidos inorgânicos foram capazes de manter boa morfologia de fibra e estrutura porosa de nanofibras. As observações de morfologia revelaram que as nanofibras compostas PANI/PLA foram carregadas com sucesso com PANI, o que forneceu base para adesão e proliferação celular. Enquanto isso, AFM foi usado para medir a rugosidade de superfície das nanofibras compostas PANI/PLA, como mostrado na Fig. 4. Ra, o valor médio de rugosidade de superfície em três posições diferentes de cada amostra, é geralmente usado para avaliar a rugosidade de superfície da amostra. Além disso, o Ra das nanofibras compostas PANI/PLA foi maior que o das nanofibras de PLA, e o Ra de PANI/PLA-PA foi o mais alto. Esse aumento na rugosidade de superfície acelerou a área superficial e polaridade, potencialmente fornecendo mais sítios de crescimento para células e promovendo adesão celular.

Figura 3. Morfologia de a nanofibras de PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA e d PANI/PLA-PA nanofibras compostas

Figura 4. Imagem AFM e rugosidade de superfície (Ra) de a nanofibras de PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA e d PANI/PLA-PA nanofibras compostas

A adesão, migração e proliferação celular são significativamente afetadas pela molhabilidade dos andamios [35, 36]. Em geral, a molhabilidade é avaliada em termos do ângulo de contato entre o andamio e a água. Dado que o PLA é hidrofóbico, medimos o ângulo de contato de gotas de água na membrana de nanofibras dentro de 1 s, como mostrado na Fig. 5, e os ângulos de contato das nanofibras PANI/PLA após tratamento diminuíram significativamente. Os ângulos de contato correspondentes de PLA, PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA e PANI/PLA-PA foram 112°, 61,6°, 36,7° e 37,2°, respectivamente. A morfologia do PANI de PANI/PLA aumentou a energia de superfície do sistema, com a área de contato aumentando no contato inicial com a água, resultando na diminuição do ângulo de contato e na melhoria da molhabilidade. O ângulo de contato das nanofibras compostas mudou para 0° após 5 s de contato com água, demonstrando assim boa hidrofilicidade. Esse andamio hidrofílico também forneceu condições favoráveis para adesão e difusão celular [37], já que os grupos funcionais contendo oxigênio (ex: –OH e –COOH) na superfície do PLA estavam mais ligados à superfície da nanofibra após o tratamento a plasma, e a morfologia do PANI e grupos funcionais contendo oxigênio trabalharam juntos para garantir que as nanofibras compostas PANI/PLA fossem finalmente completamente molhadas [38, 39].

Figura 5. Ângulo de contato de a nanofibras de PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA e d PANI/PLA-PA nanofibras compostas

Os espectros FTIR de PANI puro e nanofibras compostas PANI/PLA dopadas por diferentes ácidos inorgânicos são mostrados na Fig. 6. No espectro de PANI puro dopado (Fig. 6a), os picos característicos fortes em 1.565, 1.485, 1.298 e 1.125 cm⁻¹ correspondem a um alongamento C=C dos anéis quinona e um alongamento C=C, alongamento C-N e alongamento =C-H dos anéis benzenoides, respectivamente. No espectro de PANI puro dopado (Fig. 6b), além do pico característico do PANI, um pico de PLA também pode ser visto (picos de vibração de alongamento C-O de 1092 e 1184 cm⁻¹, pico de vibração de alongamento C=O de 1757 cm⁻¹). Esses resultados indicam que o PANI foi carregado com sucesso na superfície das nanofibras PANI/PLA dopadas com ácidos inorgânicos. Para investigar ainda mais a composição química das nanofibras PANI/PLA, XPS foi usado para analisar sua composição de superfície. Além disso, nos espectros XPS (Fig. 7a), picos claros de N1s eram visíveis a ~ 400 eV nas nanofibras compostas PANI/PLA. Além disso, picos de Cl2p eram visíveis a ~ 200 eV em PANI/PLA-HA e PANI/PLA-PA, enquanto a intensidade do pico de Cl2p com PANI/PLA-PA foi maior que a com PANI/PLA-HA. Um pico de S2p apareceu a ~ 210 eV nos espectros XPS em PANI/PLA-SA. Os espectros XPS indicaram que Cl⁻, SO₄²⁻ e ClO₄⁻ foram dopados nas nanofibras PANI/PLA correspondentes. Além disso, os átomos de nitrogênio imina do PANI foram completamente ou parcialmente oxidados para produzir uma série de estados de oxidação acompanhados por graus variados de protonação. As mudanças no estado de oxidação e no nível de protonação do PANI foram medidas em termos de espectros de nível nuclear N1s (Fig. 7b-d). Cada espectro N1s pode ser desconvoluído em quatro componentes principais com energias de ligação aproximadamente 398,7, 399,6, 400,4 e 401,8 eV, que podem ser atribuídos à imina quinona (–N=), amina benzenoide (–NH–), amina protonada (–N⁺) e imina protonada (=N⁺), respectivamente [40, 41]. Com referência ao estudo de Kumar [42], o pico de ajuste do espectro N1s foi considerado afetado pela carga nos ânions ligados pelos átomos de N protonados, resultando em deslocalização e leve deslocamento.

Figura 6. Espectros FTIR de a PANI, b PLA e nanofibras compostas PANI/PLA

Figura 7. Espectros XPS (a) de andamios nanofibrosos compostos PANI/PLA preparados e PANI/PLA-HA (b), PANI/PLA-SA (c) e PANI/PLA-PA (d) do sinal de nível do núcleo de N1s

Como modelo para reparo e regeneração tecidual, andamios bioativos são degradados e excretados do corpo após induzir reparo celular e tecidual [43]. Neste artigo, as propriedades de degradação dos andamios de nanofibras foram avaliadas usando método de perda de massa, como mostrado na Fig. 8. A perda de massa de todas as amostras aumentou em 7, 14 e 21 dias, e as taxas de perda de massa das nanofibras de PLA foram 4,34 ± 0,41%, 7,84 ± 1,57% e 12,65 ± 0,83%, respectivamente. Enquanto isso, a perda de massa das nanofibras compostas PANI/PLA-PA aumentou gradualmente após a polimerização oxidativa in situ, com taxas de perda de massa de 31 ± 2,15%, 34 ± 1,86% e 40 ± 2,54% em 7, 14 e 21 dias, respectivamente, que foram significativamente maiores que as de nanofibras PANI/PLA-HA e PANI/PLA-SA. No processo de polimerização oxidativa in situ do PANI, a presença do oxidante APS poderia ter destruído a ligação éster no PLA e induzido reação de hidrólise, resultando em microfissuras nas nanofibras de PLA. Com a prolongação do tempo de imersão em PBS, as microfissuras se acumularam gradualmente e a matriz de PLA começou a degradar gradualmente. O PANI carregado na superfície também caiu, resultando em taxa de perda de qualidade da nanofibra. Com o aumento do tempo, a razão de perda de massa tornou-se mais clara. Aqui, a forte oxidação do HClO₄ agravou a degradação do PLA e acelerou a perda de massa das nanofibras PANI/PLA-PA, o que é consistente com as propriedades mecânicas apresentadas na Fig. 2.

Figura 8. Propriedades de degradação de PLA e nanofibras PANI/PLA

A biocompatibilidade de andamios bioativos é a base para promover adesão, crescimento e proliferação celular [44]. Aqui, estudamos a proliferação celular de HOS em nanofibras de PLA e PANI/PLA compostas para ilustrar a adesão e biocompatibilidade associadas. Durante o tratamento químico e funcionalização [45], vários fatores de influência potenciais poderiam entrar em jogo na preparação de andamios bioativos. Portanto, investigar sua biocompatibilidade é chave para avaliar sua aplicação prática.

Para investigar a biocompatibilidade de nanofibras compostas PANI/PLA, sua viabilidade celular foi avaliada usando método MTT. A Figura 9 mostra a atividade celular incubada em PLA e nanofibras compostas PANI/PLA após 1, 3 e 5 dias. A figura mostra claramente que com a prolongação do tempo de incubação, a atividade celular das nanofibras aumentou gradualmente; as células PANI/PLA-PA exibiram a melhor atividade, e a atividade celular após cultura de cinco dias foi a mais alta.

Figura 9. Viabilidade celular HOS cultivada por 1, 3 e 5 dias em nanofibras de PLA e nanofibras compostas PANI/PLA (*p < 0,05; **p < 0,005)

O PLA é biodegradável, mas hidrofóbico, o que significa que não é favorável à adesão, crescimento e proliferação celular. Após o tratamento a plasma, a superfície das nanofibras compostas PANI/PLA foi carregada com grupos contendo oxigênio, e a superfície funcional demonstrou boa hidrofilicidade. Os resultados de morfologia e AFM acima indicam que o PANI dopado com diferentes ácidos inorgânicos exibiu diferentes morfologias e níveis de rugosidade na superfície das nanofibras de PLA. Enquanto isso, as nanofibras compostas PANI/PLA exibiram excelente molhabilidade. Portanto, consideramos que as diferentes morfologias do PANI dopado com ácidos inorgânicos levaram ao aumento da energia de superfície e polaridade das nanofibras compostas PANI/PLA, o que consequentemente afetou o crescimento, migração e proliferação celular, resultando em desempenho melhorado em termos de atividade celular [46].

Para estudar ainda mais o comportamento celular das nanofibras compostas PANI/PLA, o crescimento e adesão nas nanofibras foram observados via imunofluorescência (Fig. 10) e MEV (Fig. 11). Aqui, comparamos a actina e morfologia celular na superfície de diferentes nanofibras. Quando as células cresceram nas fibras de PLA e nanofibras PANI/PLA, os feixes de actina demonstraram bom estado de alongamento. Enquanto isso, a densidade celular das nanofibras compostas PANI/PLA foi maior que a das nanofibras de PLA do grupo controle, com a densidade de crescimento celular seguindo a ordem PANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HA. As células HOS cresceram nas nanofibras PANI/PLA e aderiram em forma multipolar plana. Claramente, muitas células foram incorporadas nos poros das fibras PANI/PLA, mas foram mal alongadas nas nanofibras de PLA e não puderam ser totalmente expandidas. Esses resultados indicam que nanofibras compostas PANI/PLA poderiam promover adesão e proliferação de células HOS.

Figura 10. Imagens micrográficas de fluorescência em a nanofibras de PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA e d PANI/PLA-PA nanofibras compostas após incubação de 24 h

Figura 11. Micrografias MEV de HOS semeadas em a nanofibras de PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA e d PANI/PLA-PA nanofibras compostas após 24 h

Enquanto isso, os resultados de coloração imunofluorescente celular e adesão celular indicaram que as diferentes morfologias do PANI na superfície das nanofibras compostas PANI/PLA afetaram o crescimento, adesão e proliferação das células HOS, o que foi consistente com os resultados acima.

Como marcador osteogênico precoce, o teste ALP foi conduzido em andamios de nanofibras de PLA e PANI/PLA compostas por 7 dias. Comparado às nanofibras de PLA puras, o resultado (Fig. 12) mostrou que a atividade ALP foi significativamente melhorada nas nanofibras compostas PANI/PLA. Obviamente, a atividade ALP de nanofibras compostas PANI/PLA-PA é a melhor. Esses resultados provaram que nanofibras compostas PANI/PLA exibiram melhor biocompatibilidade, o que é consistente com os resultados acima de adesão, crescimento e proliferação celular.

Figura 12. Atividade de fosfatase alcalina em andamios de nanofibras compostas PANI/PLA (ns = sem significância)

Conclusões

Neste artigo, nanofibras compostas PANI/PLA de diferentes morfologias de superfície foram preparadas por três tipos de ácido inorgânico como dopante em polimerização in situ. Confirmamos que o PANI poderia ser carregado com sucesso na superfície do PLA sem alterar a estrutura porosa das nanofibras. Os experimentos de propriedades mecânicas e degradação in vitro demonstraram que ácidos oxidantes podem enfraquecer significativamente as propriedades mecânicas e acelerar a degradação de nanofibras de poliéster. Enquanto isso, a superfície mais rugosa resultou em melhor molhabilidade e promoveu adesão, crescimento e proliferação celular, indicando melhor biocompatibilidade. Em conclusão, a morfologia do PANI regulada via dopagem com diferentes ácidos tem efeito positivo na biocompatibilidade em engenharia de tecidos.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Os autores declaram que os materiais e dados estão prontamente disponíveis aos leitores sem qualificações indevidas para acordos de transferência de material. Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo.

Abreviações

PANI:

Polianilina

PLA:

Ácido polilático

MEC:

Matriz extracelular

PPy:

Polipirrol

PTH:

Politiofeno

AN:

Anilina

DCM:

Diclorometano

DMF:

N,N-Dimetilformamida

APS:

Persulfato de amônio

HOS:

Células de osteosarcoma humano

DMEM:

Meio Dulbecco's Modified Eagle

PBS:

Tampão fosfato salino

MTT:

3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazólio brometo

FITC:

Fluoresceína isotiocianato

FTIR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

FE-SEM:

Microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo

XPS:

Espectroscopia de fotoelétrons de raios X

ALP:

Fosfatase alcalina