Preparação de nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA e sua aplicação no tratamento de dano celular H9c2 induzido por LPS

Resumo

Éter monometílico de polietilenoglicol hidrofílico (mPEG) foi enxertado em Icariin (ICA) por anidrido succínico para formar um polímero de polietilenoglicol-Icariína (mPEG-ICA). A estrutura do polímero foi caracterizada por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA foram preparadas por incorporação física de ICA por diálise. O tamanho de partícula foi determinado como sendo (220 ± 13,7) nm, e o potencial ζ era (2,30 ± 1,33) mV por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Sob um microscópio eletrônico de transmissão (TEM), as nanopartículas eram esféricas e a morfologia era regular. No meio com pH 7,4, a taxa de liberação do fármaco de nanopartículas de mPEG-ICA atingiu (52,80 ± 1,70)% em 72 h. Em pH 6,8, a liberação cumulativa do fármaco de nanopartículas atingiu (75,66 ± 0,17)% em 48 h. O tratamento das nanopartículas com células H9c2 tratadas com LPS manteve a viabilidade celular, reduziu a liberação de LDH e exerceu efeitos antiapoptóticos. Além disso, as nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA diminuíram significativamente a expressão de mRNA das citocinas inflamatórias do miocárdio TNF-α, IL-1β e IL-6M. Em conclusão, as nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA protegeram contra a lesão de células H9c2 induzida por LPS.

Introdução

A resposta inflamatória participa de todo o processo patológico de remodelação ventricular e é a principal razão para a remodelação racional da doença cardíaca após lesão cardíaca [1, 2]. Essas citocinas pró-inflamatórias, que incluem fator de necrose tumoral (TNF) -a, IL-1β, IL-6 e IL-18, levam a lesão miocárdica e remodelamento patológico em longo prazo [3]. Quando os cardiomiócitos são danificados, eles também podem liberar DAMPs (modelos moleculares relacionados à lesão), como HMGBI, para ativar células endoteliais para expressar receptores de quimiocinas, gerar fatores inflamatórios e induzir necrose ou apoptose de cardiomiócitos [4, 5]. Além disso, o HMGB promove o acúmulo de células inflamatórias, como macrófagos e neutrófilos, no coração danificado por meio de CXCL12 / CXCR4, agravando a carga e a lesão cardíaca [5]. Portanto, o bloqueio da ativação da resposta inflamatória pode ser utilizado como uma estratégia eficaz para reduzir a remodelação patológica do coração.

Icariin (ICA C ₃₃ H ₄₀ O ₁₅ ) é um composto de lipossoma extraído do medicamento chinês herba epimedii [6]. Estudos extensos têm mostrado que o ICA é encorajador como um agente imunorregulador, cardioprotetor, antioxidante, antiinflamatório e antiapoptótico [7, 8]. Apesar das propriedades positivas do ICA, existem vários fatores que limitam sua aplicação, incluindo baixa solubilidade aquosa, meia-vida curta e baixa biodisponibilidade oral [9]. Os nanocarreadores se tornaram uma nova estratégia para aumentar a eficácia alvo-direta, antiinflamatório e proteção cardíaca; além disso, os nanocarriers podem superar as desvantagens do ICA [10, 11].

Recentemente, os pesquisadores têm se concentrado em sistemas de entrega de drogas [12]. Vários nanocarreadores foram desenvolvidos, como micelas [13], lipossomas [14] e nanotubos de carbono [15]. Para reduzir a mortalidade e morbidade das doenças cardiovasculares, é urgente projetar uma nova forma de nanodosagem com ICA suficiente e que tenha propriedades de liberação direcionadas ao alvo.

Para superar as limitações da aplicação de ICA, usamos éter monometílico de polietilenoglicol (mPEG) como um transportador [16, 17]. O mPEG é um derivado do polietilenoglicol, que possui propriedades químicas estáveis e hidrofilicidade mais forte do que o PEG [18]. No entanto, como a atividade hidroxila terminal do mPEG é muito pequena, o mPEG, como um nanomaterial carregado de droga, deve sofrer ativação da hidroxila. Portanto, usamos ICA como a extremidade hidrofóbica e carboxil mPEG formado pela esterificação de mPEG e anidrido succínico como a extremidade hidrofílica para conexão química. A ligação éster formada pode acelerar a clivagem em condições ácidas.

As nanopartículas têm vantagens únicas na distribuição de drogas insolúveis [19], drogas poliméricas [20] e terapia genética [21]. Semelhante ao tecido tumoral, os locais inflamatórios do miocárdio têm funções semelhantes de permeabilidade e retenção (EPRs) [22]. Nanopartículas com um tamanho de aproximadamente 200 nm podem penetrar através da lacuna intersticial para alcançar o enriquecimento da droga [23]. Os NPs mPEG-ICA foram preparados no estágio inicial, confirmando seu papel na isquemia miocárdica, mas devido à falta de carga do ICA, eles não puderam atingir o melhor efeito [24]. Portanto, um novo tipo de nanopartícula de mPEG-ICA carregada com ICA, preparada pela combinação de síntese química e aprisionamento físico, pode não apenas melhorar a solubilidade em água e a carga de drogas de ICA, mas também prolongar o tempo de liberação sustentada de nanopreparações na inflamação do miocárdio e efetivamente melhorar a biodisponibilidade de drogas, alcançando o melhor efeito do tratamento direcionado do dano às células H9c2 induzido por LPS com ICA. Estudamos a liberação de ICA de NPs de mPEG-ICA carregados com ICA em soluções de pH 7,4 e 6,8 PBS. Além disso, para estudar o efeito das nanopartículas de mPEG-ICA na inflamação do miocárdio, usamos lipopolissacarídeo (LPS) para induzir células H9C2 para estabelecer um modelo inflamatório externo, detectamos a viabilidade celular, a taxa de apoptose e a expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias e, em seguida, estudamos o efeito farmacodinâmico das nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA no processo de inflamação do miocárdio.

Materiais e métodos

Instrumentos experimentais

Foram utilizados os seguintes:balança eletrônica JA302 (Shanghai Suzhan Metrology instrument Co., Ltd.); evaporador rotativo RE52CS-1 (fábrica de instrumentos bioquímicos de Shanghai Yarong); agitador magnético de temperatura constante 78HW-1 com display digital (Hangzhou instrumento Motor Co., Ltd.); secador elétrico 101-OA (Tianjin Telester instrument Co., Ltd.); Espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier NEXUS670 (Neliko Co., Ltd.); Espectrofotômetro UV-Vis (Beijing Leiboteke instrument Co., Ltd.); microscopia eletrônica de transmissão (TEM Glacios); instrumento de extração dispersiva ultrassônica oscilador de banho de água JP-010S (China Jiemeng Co., Ltd.); instrumento de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real; instrumento de rotulagem enzimática multifuncional; microscópio invertido (empresa Olympus) microscópio de fluorescência (Leica, Heidelberg, Alemanha); incubadora de células de dióxido de carbono (empresa Thermo).

Reagentes experimentais

Foram utilizados os seguintes:nome do reagente pureza / especificação / número do lote de produção (fabricante):Icariin (95% / 1 g / DL070208 Sahn Chemical Technology Co., Ltd.); lipopolissacarídeo (Modelo 055-100 g / Z06J9Y52452 B5 25 mg Sigma Co., Ltd.); éter monometílico de polietilenoglicol (Analytical Pure / 250 g / MKBT7172 V, Sigma Co., Ltd.); diclorometano (Analytical Pure / 500 mL / 20171103 Sinopharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); 4-dimetilaminopiridina (Analytical Pure / 100 g / L170741 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); N-hidroxissuccinimida (Reagente Biológico / 100 g / RA328L758 Shanghai Ruiyong Biotechnology Co., Ltd.); Método FastKing de uma etapa para remover a primeira fita do kit pré-misturado de síntese de cDNA genômico (Tiangen Biotechnology Co., Ltd.); kit de detecção de apoptose (Biyuntian); Kit quantitativo de fluorescência SYBR Green (empresa QIAGENGmbH).

Síntese de mPEG-COOH

mPEG (5,00 g), anidrido succínico (SA, 0,40 g) e 4-dimetilaminopiridina (razão molar 1:1,5 / 1,5, 0,50 g) foram pesados e colocados em um frasco de fundo redondo de 250 mL. Cinquenta mililitros de diclorometano foram adicionados, refluxados e agitados a 60 ° C durante 2 h. O diclorometano foi removido por um evaporador rotativo a 35 ° C durante meio dia, e foi obtido um sólido branco, o qual foi mantido à temperatura ambiente e pressão atmosférica durante meio dia até não aparecer nenhum resíduo de éter. O pó foi dissolvido em 50 mL de água destilada secundária e dialisado em um saco de diálise de 2 kDa por 48 h com a água constantemente substituída. O SA dissolvido foi removido e a substância não dissolvida foi filtrada. O mPEG carboxilado (mPEG-COOH) foi obtido por liofilização do filtrado e pesagem.

Síntese do polímero mPEG-icariin

mPEG-COOH (0,37 g), N -hidroxi succinimida (0,024 g) e 4-dimetilaminopiridina (0,026 g) foram pesados em um frasco de fundo redondo de 250 mL e, em seguida, 10 mL de dimetilsulfóxido desidratado (DMSO) foram adicionados como o solvente e agitados em temperatura ambiente por metade um dia para ativar o grupo carboxila. Em seguida, 100 mg de Icariin padrão foram colocados em um pequeno tubo e 5 mL de DMSO do qual a água havia sido removida foram adicionados para dissolver o padrão completamente. Em seguida, a amostra padrão foi adicionada ao frasco de fundo redondo e agitada por 48 h sob proteção de gás nitrogênio em temperatura ambiente. Após diálise contínua com água destilada secundária, a amostra padrão não continha DMSO, e confirmamos a remoção do DMSO por UV. Em seguida, o material dialisado foi liofilizado em um liofilizador a vácuo por 48 h para se obter um produto amarelo claro, ou seja, o polímero mPEG-ICA.

Preparação de nanopartículas (NPs) mPEG-ICA carregadas com ICA

mPEG-ICA (5 mg) foi pesado em um pequeno tubo, dissolvido em 2 mL de DMSO e então agitado em água a 37 ° C por 5 min. Cinco miligramas de ICA foram dissolvidos em uma quantidade adequada de DMSO e colocados em um pequeno copo, e mPEG-ICA foi adicionado lentamente e dissolvido no DMSO, e 5 mL de água destilada foram adicionados. A solução foi então agitada num agitador magnético à temperatura ambiente durante 15 min. Em seguida, o reagente foi dialisado em um saco de diálise de 3500 e dialisado em água por 24 h, durante as quais a água foi constantemente trocada, o solvente DMSO foi dialisado limpo e as nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA foram obtidas após a filtração.

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

Quantidades apropriadas de polímeros padrão ICA, mPEG-COOH e mPEG-ICA foram moídas em pó em um almofariz de ágata, misturadas com quantidades apropriadas de pó KBr seco e moídas em pós finos. Depois de pressionar os comprimidos, a mistura foi digitalizada em um espectrômetro infravermelho de Fourier com uma faixa de varredura de 4000–4400 cm / mol ⁻¹ , e seus espectros infravermelhos foram registrados. ICA e mPEG-COOH foram usados para a caracterização do material e o polímero mPEG-ICA foi usado para a caracterização do produto.

Espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio

Os polímeros ICA, mPEG-COOH e mPEG-ICA foram dissolvidos em dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) e carregados no tubo de amostra, que foi inserido no rotor. Em seguida, a amostra foi colocada em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de 500 MHz, e os parâmetros de amostragem foram ajustados.

Espectro UV-Vis

Icariin padrão (4,0 mg) foi adicionado a um balão volumétrico de 25 mL, com metanol adicionado à escala e foi então agitado e dissolvido até ficar clarificado. Em seguida, alíquotas de 0,3 mL, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL e 2,5 mL de solução padrão de icariin foram medidas com precisão em balões volumétricos de 25 mL e metanol foi adicionado para ajustar o volume. Os valores de absorbância das soluções foram então medidos em espectrofotômetro ultravioleta no comprimento de onda de 270 nm (comprimento de onda de absorção máximo), tendo o metanol como controle em branco. Os dados foram registrados para gerar uma regressão linear.

O polímero mPEG-ICA (4,3 mg) foi pesado com precisão em um balão volumétrico de 25 mL, com metanol adicionado à escala. A solução foi agitada até se dissolver e clarificar. Em seguida, uma solução de amostra de 2,0 mL foi medida com precisão três vezes e dissolvida em frasco volumétrico de 25 mL, com o volume ajustado com metanol. Os valores de absorbância das soluções foram então medidos em espectrofotômetro de ultravioleta no comprimento de onda de 270 nm (comprimento de onda de absorção máximo), tendo o metanol como controle em branco, e os dados foram registrados três vezes, com a média tomada. Em seguida, o conteúdo de icariin foi calculado.

As nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA preparadas de acordo com o método acima foram colocadas em um frasco com capacidade de 25 mL, metanol foi adicionado à escala e o frasco foi agitado até a solução ser dissolvida e clarificada. Em seguida, uma solução de amostra de 2,0 mL foi medida com precisão três vezes e dissolvida em frasco volumétrico de 25 mL, com o volume ajustado com metanol. Os valores de absorbância das soluções foram então medidos em espectrofotômetro de ultravioleta no comprimento de onda de 270 nm (comprimento de onda de absorção máximo), tendo o metanol como controle em branco, e os dados foram registrados três vezes, com a média tomada. Os dados foram coletados para calcular o conteúdo médio de ICA de nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA.

Caracterização de NPs mPEG-ICA carregados com ICA

Detecção dinâmica de dispersão de luz

Um dimensionador de partículas de espalhamento de luz dinâmico (DLS; The zetasizer 3000hs, Malvern Instruments, Malvern, UK) foi usado para medir a distribuição do tamanho de partícula e o potencial de NPs mPEG-ICA carregados com ICA. Os NPs mPEG-ICA recém-preparados e carregados com ICA mPEG-ICA foram liofilizados e redispersos em água destilada, derramados em um copo colorimétrico e, em seguida, colocados em um pool de amostra de analisador de tamanho de partícula de dispersão de luz dinâmica para detecção. Cada amostra foi analisada três vezes.

Observação sobre a morfologia por TEM

A solução de mPEG-ICA NPs carregada com ICA (1,0 mg / mL) foi colocada em uma malha de cobre com filme de carbono e papel de filtro para secar. A grade foi colocada no secador e 2% (p / p) de ácido fosfotúngstico foi adicionado e deixado secar naturalmente por 10 min. Em seguida, as características morfológicas dos NPs mPEG-ICA carregados com ICA foram observadas a uma voltagem acelerada de 80 kV por microscopia eletrônica de transmissão.

Medição da estabilidade

Os NPs de mPEG-ICA carregados com ICA preparados foram liofilizados com 5% de manitol em um liofilizador a vácuo por 48 h e, em seguida, as nanopartículas liofilizadas foram redissolvidas em água bidestilada para detectar as mudanças em seu tamanho de partícula e valor PDI .

Determinação da carga de droga e eficiência de aprisionamento

Uma solução de mPEG-ICA NP carregada com ICA de 1,8 mL foi medida com precisão em um frasco volumétrico de 10 mL, 0,2 mL de DMSO foi adicionado e o ultrassom foi realizado por 2 min. A absorvância da solução foi determinada a 270 nm, e o polímero mPEG-ICA com o mesmo solvente foi usado como um branco. A absorbância da amostra determinada foi substituída na equação da curva padrão e o teor de Icariin foi calculado. No DMSO / H ₂ O =1/9 do sistema de solvente, a equação da quase-curva de Icariin foi medida a 270 nm, e a carga de droga (EE%) e a eficiência de aprisionamento (LC%) das nanopartículas foram calculadas.

Carga de droga (EE%) =massa de nanopartículas de droga / massa total de nanopartículas de carga de droga × 100%
Taxa de encapsulação (LC%) =massa do fármaco em nanopartículas / dosagem × 100%.

Liberação de droga in vitro

Cinco mililitros de ICA livre, polímero mPEG-ICA e NPs mPEG-ICA carregados com ICA foram colocados em sacos de diálise (3500 kDa), que foram fixados em ambas as extremidades e dialisados em 25 mL de PBS (meio de liberação) sob 37 ° C e Vibração ultrassônica de 100 rpm (pH =7,4). Dois mililitros foram removidos dentro de períodos de tempo predeterminados (Tn, n =0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 e 72 h) e substituído por uma nova solução do mesmo volume. A espectrofotometria UV-Vis foi realizada para determinar a absorbância do dialisado a 270 nm nos diferentes tempos. A proporção da porcentagem de liberação de ICA foi calculada conforme descrito, e três amostras foram medidas para calcular a liberação média do medicamento. O conteúdo de dialisado foi determinado pelo método da curva padrão e o teste de liberação foi repetido 3 vezes in vitro.

A fórmula de liberação do medicamento é Q % =( C _n × V + V _n Σ ⁿ _{t =0} C _i ) / (W _NP × LC%), onde W é o peso de NP, LC% é a carga de droga de nanopartículas, C _n é a concentração da amostra em Tn, V é o produto total do meio de liberação (25 mL), Vn é o peso da amostra (2 mL) e C _i é T _i ( eu =0, 0,5, 1,…., n h , V ₀ = C ₀ =0).

Lançamento de NPs mPEG-ICA-ICA em diferentes mídias de lançamento

Dois mililitros de solução de mPEG-ICA NP carregada com ICA foram colocados em uma bolsa de diálise (4-88 kDa, valor de corte de peso molecular) e colocados em pH 7,4 e pH 6,8 solução salina tamponada com fosfato (meio de liberação de PBS, 37 ° C, 25 mL). Em seguida, 2 mL de meio de liberação foram coletados para amostragem e substituídos por uma solução nova do mesmo volume em intervalos predeterminados (Tn, n =0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 e 48 h). A absorbância do dialisado a 270 nm nos diferentes tempos foi determinada por espectrofotometria UV-Vis. A proporção percentual de liberação de ICA foi calculada e três amostras foram medidas para calcular a liberação média do medicamento.

Experiência de teste de células

H9c2 (H9c2 de rato), uma linha de mioblastos ventriculares de rato, foi adquirido no Instituto de Bioquímica e Biologia Celular de Shanghai, China. As células foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (Gibco, EUA) a 37 ° C em um CO ₂ -contendo atmosfera. As células H9c2 foram geralmente inoculadas em uma placa de cultura de 10 cm [25]. Quando as células cresceram até aproximadamente 80%, elas foram subcultivadas com 0,25% de tripsina (Gibco). Em seguida, as células foram semeadas nas placas de cultura correspondentes ou placas de 96 poços para os seguintes estudos.

Tratamento celular com LPS ou nanopartículas ICA

As células H9c2 foram divididas em cinco grupos como segue:(1) grupo controle:usando meio de cultura normal, (2) grupo LPS:as células foram tratadas com 10 mg / L LPS por 24 h; (3) Grupo ICA:as células foram tratadas com 20 μmol / L de ICA (1:1000, DMSO) e 10 mg / L LPS pela mesma duração, (4) grupo de polímero mPEG-ICA:as células foram tratadas com 20 μmol / L polímero mPEG-ICA e a mesma concentração final de LPS pela mesma duração; (5) Grupo mPEG-ICA NPS carregado com ICA:as células foram tratadas com 20 μmol / L de NPs de mPEG-ICA carregado com ICA e 10 mg / L de LPS, com as outras condições iguais às do grupo acima.

MTT

A viabilidade celular de nanopartículas de ICA contra lesão de cardiomiócitos induzida por LPS foi determinada por MTT. Resumidamente, as células H9c2 foram tratadas com LPS e diferentes nanopartículas de ICA por 24 h. Em seguida, as células foram coradas com MTT a uma concentração final de 0,5 mg / mL por 4 h a 37 ° C e, em seguida, 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados para dissolver os cristais da tireoide. A densidade óptica foi medida a 570 nm em um leitor de microplaca (* / SpectraMax i3 Molecular Devices, Afeganistão).

Liberação de lactato desidrogenase (LDH)

Para investigar o efeito do nano-ICA no dano de H9c2 induzido por LPS, avaliamos a liberação de LDH no meio de cultura. Resumidamente, de acordo com os tratamentos correspondentes por 24 h, o meio de cultura foi coletado, e o LDH foi detectado de acordo com o protocolo do Kit de Detecção de LDH (Beyotime Biotechnology). Finalmente, o valor de DO foi medido em 490 nm com um espectrômetro.

Coloração Hoechst 33.258

A coloração Hoechst 33.258 foi usada para observar a morfologia nuclear por microscopia de fluorescência. Após o tratamento, as células H9c2 foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas em tampão de paraformaldeído a 4% (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa), enxaguadas com PBS e coradas com Hoechst 33.258 a 37 ° C por 15 min [26]. Após a coloração, os aspectos morfológicos nucleares foram imediatamente observados em microscópio de fluorescência (Leica, Heidelberg, Alemanha). Índice de apoptose =número de núcleos apoptóticos / núcleos totais × 100%.

Ensaio TUNEL (rotulagem terminal dUTP nick-end)

Para a detecção da integridade do DNA das células H9c2, adotamos a técnica TUNEL. As células H9c2 foram cultivadas em uma placa de cultura de 24 poços. Após o tratamento, foram lavados 3 vezes com PBS e fixados com poliformaldeído 4% por 30 min [27]. Em seguida, 1% Triton X-100 foi adicionado por 5 min para aumentar a permeabilidade da membrana celular. Em seguida, as células foram coradas com um kit de detecção de uma etapa TUNEL (Beyotime Biotechnology) de acordo com as instruções, e a apoptose celular foi observada com um microscópio de fluorescência. A taxa de apoptose de cada grupo é expressa como a porcentagem de núcleos fluorescentes verdes (TUNEL-positivo) em relação aos núcleos totais (azul) (os núcleos são corados com DAPI) [28].

Citometria de fluxo para detectar apoptose

Para investigar ainda mais os efeitos de diferentes nanopartículas de ICA na apoptose de células induzida por LPS, usamos o método de coloração dupla com Anexina V-FITC / PI para analisar a taxa de apoptose. Após o tratamento com H9c2 conforme descrito acima, as células foram colhidas e ressuspensas em 195 μL de tampão de ligação contendo 10 μL de Anexina V-FITC e 5 μL de PI e então incubadas por 15 min em temperatura ambiente no escuro. Após centrifugação a 1500 rpm durante 10 min a 4 ° C, o tampão de coloração foi aspirado e as células foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em 100 µL de PBS. Por fim, as amostras foram medidas por citômetro de fluxo.

Reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT – qPCR)

RT – qPCR foi usado para detectar os níveis de expressão de mRNA de marcadores inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-1β e IL-6. Depois que as células H9c2 foram tratadas por 24 horas, o RNA total foi extraído usando TRIzol conforme descrito anteriormente e medido usando um espectrofotômetro de micro ultravioleta-visível NanoDrop ™ One / OneC (Thermo, ND-ONEC-W, EUA). O cDNA foi sintetizado usando um kit ExScript RT e a amplificação foi realizada em uma máquina de PCR quantitativa fluorescente (BIO-RAD CFX96 Touch *) com reagente SYBR Green nas seguintes condições:95 ° C por 5 min, 95 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s, e um total de 28 ciclos. Os primers usados neste estudo são os seguintes:

Actin ::: Encaminhar 5 ′ GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3 ′;

5′-TTGATGTCACGCACGATTT-3 ′ reverso;
TNF-α ::: Encaminhar 5′TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3 ′;

5′-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3 ′ reverso;
IL-1β ::: Encaminhar 5′GGATGATGACGACCTGCTA 3 ′;

Reverter 5′-CACTTGTTGGCTTATGTTCTG3 ′
IL-6 ::: Avançar 5′TGCCTTCTTGGGACTGAT-3 ′;

Reverter 5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3 ′.

A quantidade de cada gene alvo foi normalizada para a do gene da actina. As experiências foram repetidas em triplicado.

Resultados e discussão

FTIR e H ¹ Espectro de NMR

A partir dos espectros de mPEG-ICA, os picos de absorção de vibração de alongamento de duas ligações éster (–C =O–) estavam em 1700 ⁻¹ e 1740 ⁻¹ cm. Em comparação com os espectros de mPEG-COOH, houve um pico de vibração de alongamento C =C em excesso em 1650 cm ⁻¹ , indicando que a síntese de esterificação de ICA e mPEG-COOH teve sucesso na formação de mPEG-ICA (Fig. 1).

Do espectro de hidrogênio mPEG-ICA, 12,6 ppm indica os grupos hidroxila fenólicos ICA devido à presença de –C =O grupos de elétrons de absorção forte movendo-se para o campo baixo. O pico de hidrogênio do anel de benzeno em aproximadamente 7,5 ppm e a área do pico de 3,5 ppm são muito grandes, avaliados como –CH ₂ –O– pico de hidrogênio no polímero mPEG. Um grande número de análises mostra que o sinal de alquil hidrogênio é de 0–2 ppm. Portanto, pode-se concluir que 1,7 ppm é o pico da ligação dupla do hidrogênio na ICA. Os picos característicos de mPEG-COOH e ICA aparecem em polímeros de mPEG-ICA, demonstrando a síntese bem-sucedida de mPEG-COOH com ICA (Fig. 1).

Tamanho de partícula, potencial zeta e TEM

O tamanho médio de partícula das nanopartículas de mPEG-ICA é de aproximadamente (145,0 ± 15,2) nm, e o valor do índice de dispersão (PDI) do polímero é (0,277 ± 0,00). O tamanho de partícula das nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA aumentou ligeiramente, para aproximadamente (220,0 ± 13,7) nm, e o PDI foi (0,119 ± 0,00). Quanto menor for o PDI, mais uniforme será a distribuição dos NPs mPEG-ICA carregados com ICA. O potencial zeta das nanopartículas de mPEG-ICA era (0,439 ± 0,258) mV, e o potencial zeta de NPs de mPEG-ICA carregados com ICA era (2,30 ± 1,33) mV. A microscopia eletrônica de transmissão revelou que as nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA eram esféricas, regulares em morfologia e relativamente uniformes em tamanho (Fig. 2).

Carga de drogas e eficiências de encapsulamento

O conteúdo de ICA nos NPs de mPEG-ICA carregados com ICA pode ser calculado por espectrofotometria ultravioleta. A curva padrão da concentração de ICA foi estabelecida e o conteúdo de ICA no polímero foi obtido calculando a concentração do fármaco com base na curva padrão. De acordo com os cálculos, com base na absorbância do polímero mPEG-ICA (1,2397 ± 0,1024), o conteúdo de ICA foi (0,4132 ± 0,0359) mg / mL, com absorbância de nanopartículas de mPEG-ICA carregado com ICA (1,6289 ± 0,0923), e o o conteúdo de ICA era (0,5496 ± 0,3234) mg / mL. Calculado de acordo com a fórmula do método, a carga de droga do polímero mPEG-ICA foi (16,5 ± 0,014)% e a taxa de encapsulação foi (41,3 ± 0,036)%; o conteúdo de carga de droga dos NPs de mPEG-ICA carregados com ICA foi (21,9 ± 0,013)%, e a taxa de encapsulação foi (54,9 ± 0,032)% (Tabela 1).

Determinação da estabilidade

O tamanho de partícula de nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA preparadas pelo método de diálise foi (220,0 ± 13,7) nm, e o PDI foi (0,119 ± 0,00). Após liofilização em 5% de manitol por 48 h, as nanopartículas podem ser redissolvidas em água para formar nanopartículas estáveis. O tamanho da partícula era de 255 nm, e o PDI era (0,326 ± 0,00), que era ligeiramente maior do que o das nanopartículas de diálise (Fig. 3).

Liberação de medicamento mPEG-ICA-ICA in vitro

Na Fig. 4, a liberação de ICA depende amplamente do pH do meio de liberação. Dentro de meio de liberação de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em pH 7,4, icariin livre foi liberado (77,21 ± 0,15)% em 12 he liberado completamente. Como os NPs de mPEG-ICA carregados com drogas de icariin podem aumentar a liberação de nanopartículas, a liberação de nanopartículas de mPE-ICA foi liberada em (44,08 ± 0,12)% em 72 h, e as nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA atingiram (52,80 ± 1,70) % Nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA foram colocadas em uma solução tampão de pH 6,8, e descobrimos que a liberação de drogas mediada por nanopartículas atingiu (75,66 ± 0,17)% em 48 h. Isto é provavelmente porque alguns NPs de mPEG-ICA carregados com ICA tinham NPs despolimerizados ou moléculas de mPEG-ICA quebradas em NPs. Essas observações indicaram que a liberação de ICA foi mais favorável em condições ácidas de pH 6,8. Também indicou que as características de liberação de nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA foram benéficas para o tratamento local de lesão inflamatória do miocárdio, porque as lesões locais levam a um foco com um ambiente fracamente ácido.

Viabilidade das células H9C2 e liberação de lactato desidrogenase

Primeiro, para observar a citotoxicidade das nanopartículas de mPEG-ICA carregadas com ICA, adicionamos droga livre (20 µM de ICA), NPs de mPEG-ICA e NPs de mPEG-ICA carregados com ICA para células H9c2, e os resultados de MTT não mostraram citotoxicidade marcada de as nanopartículas (Fig. 5). Em seguida, exploramos ainda se eles poderiam proteger as células H9c2 contra a lesão induzida por LPS (Fig. 6). Após o tratamento com LPS por 24 h, a viabilidade celular foi reduzida para (50,0 ± 3,22)% (grupo de controle 100%), onde o tratamento com ICA, NPs mPEG-ICA e NPs mPEG-ICA carregados com ICA aumentou significativamente a viabilidade das células H9c2 em (55,94 ± 1,06)%, (60,97 ± 2,615)% e (65,36 ± 1,214)%, respectivamente ( P <0,05).

In addition, LDH levels are a marker of cell damage; therefore, we measured the release level of LDH in the culture medium (Fig. 7). LDH levels were increased in the LPS group compared with the normal culture group. Treatment with ICA, mPEG-ICA NPs or ICA-loaded mPEG-ICA NPs reduced the LDH level increase induced by LPS, especially in the ICA-loaded mPEG-ICA NP group. These results showed that ICA nanoparticles could protect cells from LPS.

Cell apoptosis induced by LPS

First, nuclear morphology was detected by Hoechst 33,258 staining (Fig. 8). Nuclear chromatin exhibited condensation, breakage and fragmentation after LPS damage in the LPS group. However, for ICA-loaded mPEG-ICA NP group, the number of apoptotic cells obviously decreased. Moreover, we used TUNEL staining to observe cellular DNA breaks or DNA damage (Fig. 9). The number of apoptotic nuclei in the LPS-induced group was (47.57 ± 3.41)% (P ˂ 0.0001) compared to (6.47 ± 1.87)% in the normal culture group. After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA, the apoptosis rates decreased to (17.92 ± 3.12)% and (26.54 ± 3.68)% and (35.49 ± 4.25)%, respectively, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs significantly reduced the apoptosis rate compared with mPEG-ICA NPs. In addition, flow cytometric analysis in LPS-induced H9c2 cells showed that (35.93 ± 2.23)% of the cells were in the early and late apoptotic stages (Fig. 10). After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs or mPEG-ICA NPs, the total apoptotic rates were reduced to (16.70 ± 2.77)% and (19.15 ± 3.67)%, respectively. These results were in line with the Hoechst 33,258 staining and TUNEL staining findings and indicated that ICA-loaded mPEG-ICA NPs largely prevented the cells from undergoing apoptosis.

Inflammatory cytokine mRNA in LPS-induced H9c2 cells

Next, we evaluated the effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. After LPS treatment for 24 h in H9c2 cells, the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased. These increases were attenuated by ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA treatment, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs treatment markedly lowed TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA expression (Fig. 11).

In this study, we analyzed the suitability of polymer nanoparticles to load ICA for the treatment of LPS-induced H9c2 cell damage. The synthesis method is highly feasible and has many advantages. First, mPEG is nontoxic and has good biocompatibility [29]. In this study, a chemical bonding method was used to assemble mPEG and ICA into an mPEG-ICA polymer, and then dialysis was used to physically wrap the ICA and form stable nanoparticles [30]. Nanoparticles can significantly improve the water solubility of ICA and can realize the long circulation of nanoparticles in the body [31, 32]. Compared with mPEG-ICA nanoparticles, ICA-loaded mPEG-ICA nanoparticles have many significant advantages. First, their PDI value is smaller, which proves that the particle size distribution is more uniform [33]. Second, the drug loading and encapsulation efficiencies of ICA-loaded mPEG-ICA NPs are both higher than those of mPEG-ICA NPs, making it easier to reach the effective drug concentration of ICA [34]. In a pH 6.8 solution, nanoparticles release more drugs, and an acidic environment may destroy the self-assembly force of nanoparticles and accelerate the cleavage of ester bonds, resulting in faster release of the drug into the medium and effective enrichment of the drug in the inflammation site [35, 36]. Huang et al. used LPS-induced osteoblasts to validate the model to explore the anti-inflammatory mechanism of Icariin. They found that Icariin can significantly upregulate the expression of BMP-2 and Runx2 in LPS-induced osteoblasts, thereby achieving effective therapeutic effects [37]. A study has shown that ICA can inhibit the inflammatory response of chondrocytes induced by LPS and reduce collagen formation [38]. In addition, ICA can also inhibit the caspase-1 signaling pathway mediated by the NLRP3 inflammasome and reduce LPS-induced sagging [39]. However, LPS-induced cells cannot effectively absorb ICA. Making ICA nanoparticles can solve this problem well. It may be that ICA is loaded by nanocarriers, greatly increasing its water solubility and allowing it to enter cells through free diffusion. At the same time, studies have shown that nanoparticles can promote cell endocytosis and tissue cell efflux and significantly improve the bioavailability of ICA [40, 41].

The results of the MTT assay and lactate dehydrogenase release experiments showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could effectively alleviate the cell damage induced by LPS, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release ICA from the particles. Furthermore, compared with the mPEG-ICA NPs, ICA-loaded mPEG-ICA NPs could load more ICA and release more easily. We also found that these nanoparticles markedly decreased apoptosis induced by LPS to alleviate the inflammatory response in H9c2 cells. Moreover, the antiapoptotic effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs was better than that of mPEG-ICA NPs and ICA. These results indicated that ICA nanoparticles could protect cardiomyocytes from inflammatory injury.

Inflammatory cytokines are the key factors involved in the development and progression of cardiovascular disease and are markers of the inflammatory response [42, 43]. Some researchers have found that TNF-α, IL-1β and IL-6 were closely related to cardiac function. The addition of these inflammatory cytokines to isolated cardiomyocytes resulted in abnormalities in cardiac function and promoted cardiomyocyte loss [44]. Our RT–qPCR results showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could significantly inhibit the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Therefore, these results implied that the protective effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs may occur through controlling inflammatory cytokines.

Conclusion

ICA-loaded mPEG-ICA NPs are a new type of nanomedicine successfully synthesized through nanotechnology (a combination of chemical synthesis and physical embedding). This process not only converts the hydrophobic drug ICA into water-soluble nanomedicine but also successfully improves the load capacity of ICA. In the weakly acidic solution, the ICA release from ICA-loaded mPEG-ICA NPs was greater than that of the neutral solution, indicating that nanoparticles are meaningful for the treatment of inflammatory cardiovascular diseases. Treatment with ICA nanoparticles effectively protected against LPS-induced H9c2 damage, promoted cell viability and inhibited cell apoptosis. Further experiments demonstrated that the new ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release inflammatory cytokine production.