Síntese Assistida por Ácido Sulfúrico de Polímero Carbonizado Pontos Vermelhos Brilhantes para Bioimagem de Dois Fótons

Resumo

Pontos de polímero carbonizado (CPDs) emissores de vermelho foram fabricados a partir de solução aquosa de p-fenilenodiamina (p-PD) sob influência catalítica de ácido sulfúrico (H₂SO₄). Os SA-CPDs resultantes (diâmetro médio ≈5 nm) exibiram a fotoluminescência mais brilhante entre ácidos testados, com rendimento quântico (QY) de 21,4% em água e rendimento global de 16,5%. Excitação a 300–580 nm consistentemente produziu emissão a 600 nm, independente do comprimento de onda de excitação. Cálculos de funcional da densidade indicam que crescimento transversal de precursores protonados é energeticamente favorecido, impulsionando formação de CPDs nanoescalares. Fotoluminescência de dois fótons, emitindo a 602 nm sob excitação a laser femtossegundo 850 nm, foi demonstrada para imagem de células HeLa, destacando potencial de SA-CPDs em aplicações biomédicas.

Introdução

Pontos de carbono (CDs) atraíram interesse generalizado devido à sua excelente solubilidade em água, estabilidade óptica, baixa toxicidade e síntese custo-efetiva. São explorados em sensores eletroquímicos, bioimagem, catálise, dispositivos emissores de luz e optoeletrônica. Rotas bottom-up de monômeros orgânicos, polímeros ou produtos naturais são preferidas para produção em larga escala. Grupos funcionais como –OH, –COOH, –C=O e –NH₂ passam por desidratação e carbonização a temperaturas elevadas para render nanopartículas fluorescentes.

CDs emissores de vermelho são particularmente valiosos para bioimagem devido à sua penetração tecidual mais profunda e interferência de fundo mínima. No entanto, a maioria dos CDs exibe emissão dependente de excitação, tornando fonte de fóton vermelho única e estável rara. Isômeros de fenilenodiamina (o-, m-, p-) têm sido usados para gerar CDs azuis, verdes e vermelhos, respectivamente. Trabalho recente identificou pontos baseados em p-PD como pontos de polímero carbonizado (CPDs) devido à sua emissão independente de excitação.

Aqui apresentamos síntese hidrotérmica assistida por ácido sulfúrico facilitada, de alto rendimento, de CPDs emissores de vermelho e demonstramos sua capacidade de imagem de dois fótons em células HeLa.

Métodos

Síntese de CPDs Vermelhos de Sistemas p-PD Assistidos por Ácido

Investigamos H₂SO₄, HCl e HClO₄ como doadores de próton, rotulando CPDs resultantes como SA-CPDs, HC-CPDs e PA-CPDs. Variáveis de reação — razão ácido-p-PD, concentração de precursor, temperatura e tempo — foram sistematicamente otimizadas. Após tratamento hidrotérmico (200 °C, 2 h), produto purificado por hexano (removendo p-PD não reagido) e etanol (removendo ácido), seguido por centrifugação a 14.000 rpm, filtração através de membrana 0,22 µm e evaporação rotativa opcional para render pós secos.

Caracterização e Medição

MET de alta resolução (JEM-2100, 200 kV) avaliou morfologia e franjas de rede. Espectros FT-IR registrados com espectrômetro Prestige-21 usando janelas KRS-5. Espectros de fluorescência e UV-Vis obtidos com espectrofotômetro F-2500 e espectrômetro Lambda 950, respectivamente. Emissão de dois fótons medida em espectrógrafo de fibra (QE65000, Ocean Optics) acoplado a laser femtossegundo. Rendimentos quânticos calculados usando Rodamina B (QY = 56% em etanol) como referência, seguindo procedimento no Arquivo Suplementar 1.

Métodos de Cálculo

Cálculos de teoria do funcional da densidade (DFT) realizados com Gaussian 09 (B3LYP/6-311++G(d)) no modelo PCM água para avaliar energéticas de vias de crescimento longitudinal e transversal.

Cultura Celular e Tratamento

Células HeLa (4 × 10⁴ células mL⁻¹) semeadas em DMEM (Gibco) e incubadas a 37 °C com 5% CO₂ por 24 h. SA-CPDs (40 µg mL⁻¹) adicionados por 12 h, seguido por lavagens com PBS. Imagem realizada em microscópio confocal usando laser femtossegundo 850 nm (30 mW).

Resultados e Discussão

Otimização da Preparação para CPDs Vermelhos

Todos sistemas de ácido renderam CPDs vermelhos a temperaturas acima de 180 °C (2 h). Temperaturas mais altas (240 °C, 4–12 h) aumentaram tamanho de partícula e diminuíram fluorescência. Condições ótimas foram 200 °C, 2 h, com razão ácido-p-PD de 1 para H₂SO₄, e 3 para HCl e HClO₄. Faixa de concentração de p-PD (0,02–0,20 mol L⁻¹) foi tolerável. Sob estes parâmetros, SA-CPDs alcançaram QY de 21,4% e rendimento de 16,5%, superando HC-CPDs e PA-CPDs.

Caracterização TEM e Análise FT-IR

MET-HR revelou CPDs esféricos monodispersos (diâmetro médio ≈5 nm) com espaçamento de rede 0,21 nm correspondente a planos grafeno (100). Espectros FT-IR indicaram maior oxidação superficial em SA-CPDs, com características pronunciadas –OH e –COOH e sinais –NH₂ reduzidos, sugerindo superfície mais oxidada e hidrofílica.

Mecanismo Proposto para Formação de CDs

Cálculos DFT mostram que crescimento transversal (−1.406 kJ mol⁻¹) é significativamente mais favorável que crescimento longitudinal (−616 kJ mol⁻¹), levando a intermediários planares que auto-montam em CPDs esféricos.

Propriedades Ópticas

SA-CPDs exibem forte absorção UV a 290 nm (π→π*), com bandas adicionais a 430 e 510 nm (transições fenazina-amina). Espectros de excitação pico próximo a 580 nm, correspondendo à emissão a 600 nm, e fluorescência permanece independente de excitação através de 220–580 nm, confirmando natureza CPD.

Imagem Celular

Excitação de dois fótons a 850 nm produziu emissão a 602 nm antes de pulverização e 529 nm após, com intensidade aumentada. Imagens confocais de células HeLa incubadas com SA-CPDs mostraram localização citoplasmática, com fluorescência mais forte no canal verde devido à emissão com deslocamento azul.

Conclusões

Demonstramos método hidrotérmico simples, escalável, assistido por ácido sulfúrico para produzir CPDs vermelhos brilhantes (≈5 nm, QY = 21,4%, rendimento = 16,5%). CPDs emitem a 600 nm sob excitação 300–580 nm, e a 602 nm sob excitação de dois fótons 850 nm. Sua fluorescência de alto brilho, independente de excitação, e captação celular eficiente tornam-nos candidatos promissores para imagem de tecido profundo e outras bioaplicações.

Abreviações

CDs:

Pontos de carbono

CPDs:

Pontos de polímero carbonizado

HC-CPDs:

CPDs sintetizados de p-PD com assistência HCl

PA-CPDs:

CPDs sintetizados de p-PD com assistência HClO₄

SA-CPDs:

CPDs sintetizados de p-PD com assistência H₂SO₄

QYs:

Rendimentos quânticos

p-PD:

p-Fenilenodiamina